Extracto
Antecedentes
La comprensión de las características moleculares de los tumores específicos puede aumentar nuestro conocimiento sobre el mecanismo (s) subyacente en el desarrollo de la enfermedad y progresión. Esto es particularmente significativo para el cáncer colorrectal, que es un complejo heterogéneo de enfermedades desarrolladas de una manera secuencial a través de un proceso carcinogénico de etapas múltiples. Como tal, es probable que los tumores con características similares pueden proceder de la misma forma y tienen un comportamiento molecular similar. Por lo tanto, la cartografía específica de las características moleculares puede ser potencialmente útil tanto para la clasificación de tumores y el desarrollo de regímenes terapéuticos apropiados. Sin embargo, esto sólo puede lograrse mediante el desarrollo de sondas moleculares de alta afinidad con la capacidad de reconocer los marcadores específicos asociados con diferentes tumores. Los aptámeros pueden cumplir más fácilmente este desafío basado en su diversidad de destino, la manipulación flexible y facilidad de desarrollo.
Metodología y Resultados
Uso de un método conocido como Evolución Sistemática basado en células de Ligandos mediante enriquecimiento Exponencial (célula-SELEX) y el cáncer colorrectal líneas celulares cultivadas DLD-1 y HCT 116, se seleccionaron un panel de aptámeros específicos de la diana. Estudios de unión por citometría de flujo y microscopía confocal mostró que estos aptámeros tienen alta afinidad y selectividad. Nuestros datos muestran además que estos aptámeros ni reconocen las células normales del colon (cultivado y fresco), ni tampoco reconocen la mayoría de otras líneas celulares de cáncer probado.
Conclusión /Importancia
Los aptámeros seleccionados pueden identificar específica biomarcadores asociados con los cánceres colorrectales. Creemos que estas sondas podrían ser desarrolladas para la detección temprana de la enfermedad, así como marcadores de pronóstico, de los cánceres colorrectales
Visto:. Sefah K, L Meng, López-Colón D, E Jiménez, Liu C, Tan W (2010) Los aptámeros de ADN como sondas moleculares para el estudio del cáncer colorrectal. PLoS ONE 5 (12): e14269. doi: 10.1371 /journal.pone.0014269
Editor: Dimitris Fatouros, Universidad Aristóteles de Tesalónica, Grecia
Recibido: 3 Mayo 2010; Aceptado: 16 de octubre de 2010; Publicado: December 10, 2010
Derechos de Autor © 2010 Sefah et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo era financiado por el texto siguiente: NIH: R01 GM079359: Desarrollo de sondas moleculares para aplicaciones biomédicas; NIH CA122648, Enriquecimiento y la detección de células tumorales exfoliadas. El organismo de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común (10-15% de todos los cánceres) y una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo, con un estimado de medio millón de muertes en todo el mundo y más de cincuenta mil muertes en los Estados Unidos solamente.
CRC es un complejo heterogéneo de enfermedades causada por alteraciones genéticas /epigenética destructivos que se acumulan de una manera secuencial a través de un proceso carcinogénico de múltiples etapas [1]. Por tanto, es probable que los tumores con características similares pueden proceder de la misma forma y tienen un comportamiento molecular similar. Dado que las características moleculares de un tumor dado reflejan el mecanismo (s) subyacente desarrollo de la enfermedad y la progresión, la implicación para la clasificación de tumores es significativo. Por ejemplo, la clasificación molecular de la leucemia y los linfomas ha mejorado enormemente nuestra comprensión de estas enfermedades [2], [3], [4]. La investigación de las bases moleculares de dos síndromes principales, poliposis adenomatosa familiar (FAP) y nonpolypsis hereditaria CRC (HNPCC), ha llevado a la identificación de dos vías principales por los cuales estos eventos moleculares pueden conducir a la CRC [5]. Alrededor del 85% de los CCR surgen de eventos que dan lugar a la inestabilidad cromosómica (CIN), con aneuploidía y la inactivación inicial de adenomatosis poliposis coli (APC). Un resultado más del 15% de los procesos que generan inestabilidad de microsatélites (MSI), repetición de errores o pérdida de la función de reparación desajuste cuidador (MMR) asociado con HNPCC [6], [7], [8], [9]. Aunque hemos mejorado nuestra comprensión de los eventos moleculares que subyacen al desarrollo de CCR, sin impacto significativo en el cuidado del paciente ha dado como resultado. A pesar de considerables progresos que han hecho en el tratamiento de pacientes con CCR usando ácido fólico (FA) -modulated 5-fluorouracilo (5-FU), alrededor del 50% de los pacientes con CCR eventualmente desarrollan CCR metastásico (CCRm). Sin embargo, el uso de nuevos agentes de quimioterapia, tales como oxaliplatino e irinotecán, ya sea solo o en combinación con agentes biológicos aprobados, tales bevacizumab y cetuximab, promete prolongar la supervivencia [10], [11].
Por lo tanto, con el fin de maximizar los tratamientos disponibles, es críticamente importante para ganar aún más información sobre los mecanismos moleculares que subyacen enfermedad en la población, así como a mejorar significativamente nuestros esfuerzos por esclarecer nuevas dianas terapéuticas relevantes y los marcadores moleculares. Estos esfuerzos ayudarán a expandir y diversificar las opciones de gestión de la enfermedad. Los estudios también han demostrado que el cambio de detección de la enfermedad a una etapa anterior a través de la detección y la intervención de masa en esta etapa puede reducir el riesgo de muerte por CRC [12], [13]. Estos hallazgos demuestran firmemente la necesidad clínica de biomarcadores para la detección temprana del CRC para que la enfermedad puede ser controlado efectivamente.
técnicas genómicas, como el análisis de microarrays de ADN, y los métodos de proteómica, como dos dimensiones (2 -D) electroforesis y espectrometría de masas, ahora se utiliza comúnmente para dilucidar los perfiles de expresión de genes y proteínas en las células, los tejidos y fluidos corporales [14], [15]. En efecto, la identificación de genes y proteínas que se producen característicamente durante el desarrollo del cáncer puede potencialmente descubrir biomarcadores útiles que ayudarán en la gestión de CRC. Aunque la proteómica han desempeñado un papel dominante en el campo del desarrollo de biomarcadores [16] y que seguirán utilizando marcadores suficientes modo, las estrategias proteómicas actuales no han generado para el CCR.
Curiosamente, el CRC es uno de los primeros tipos de cáncer para los que se utilizaron los marcadores tumorales para ayudar en la gestión de la enfermedad. Por ejemplo, el antígeno carcinoembrionario (CEA) se ha utilizado ampliamente para determinar el pronóstico y seguimiento de la progresión de la enfermedad y la terapia después de la resección curativa. Un alto nivel de CEA en el suero se asocia con la progresión del cáncer. Sin embargo, incluso en ausencia de cáncer, se ha informado de altos niveles de CEA en condiciones tales como hepatitis, pancreatitis, enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad pulmonar obstructiva. Además, otros tipos de cáncer, como el de páncreas, gástrico, de pulmón y de mama, han elevado los niveles de CEA, lo que indica la falta de especificidad de este marcador. Otros marcadores, tales como antígeno carbohidrato 19-9 (CA19.9), CA242, metaloproteinasas-1 (TIMP-1), la timidilato sintasa, p53, y
APC
gen, todas carecen de la sensibilidad y la especificidad necesaria. Para ser clínicamente útil, un biomarcador debe ser eficaz y tienen un alto valor predictivo [7], no existe aún semejante biomarcador único. A pesar de que se ha llegado a ningún consenso, parece que el desarrollo de múltiples biomarcadores para la detección y evaluación de riesgos de un único cáncer se ve favorecida por los biomarcadores individuales amplios, que puedan predecir sucesivamente riesgo de cualquier tipo de cáncer [7]. Esto es aún más importante como métodos de multiplexación son cada vez más de una norma que la excepción.
Los biomarcadores que están directamente asociados con las células tumorales a medida que se transforman de la normalidad en la malignidad serán de gran interés ya que estos marcadores pueden ser herramientas útiles para la cartografía de las características moleculares de las células enfermas. La capacidad de las sondas para identificar una importante muestra clínica, tales como colonocitos malignas exfoliadas, en lugar de colonocitos normales, sería particularmente importante para el CCR [16]. Específicamente, las células una vez exfoliadas de la mucosa colónica se han desprendido en las heces, ya se ha demostrado que el ADN de las heces puede ser aislado y sometido a un análisis de ADN multi-objetivo. Este ensayo se puede evaluar actualmente 15 puntos calientes de mutación, incluyendo K-ras, p53, APC, BAT-26 y L-ADN. Aunque los marcadores de ADN fecal son bastante prometedores, no son ampliamente utilizados en la práctica clínica y, por tanto sondas que pueden detectar específicamente las células será importante.
En el desarrollo de marcadores moleculares sensibles, selectivos para CRC, basado en células la selección de aptámeros es una promesa significativa por su potencial para identificar múltiples marcadores útiles en un tiempo relativamente corto. Durante las dos últimas décadas, se han hecho esfuerzos apreciables para desarrollar marcadores para varios tipos de cánceres utilizando un proceso conocido como la Sytematic Evolución de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) [17], [18]. A través de este proceso, numerosas sondas de oligonucleótidos (aptámeros) se han generado que pueden unirse específicamente a las proteínas asociadas a membranas de diferentes células tumorales [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Los aptámeros son cortos, los oligonucleótidos de cadena sencilla (ADN o ARN), típicamente & lt; 100 mer, que tienen la capacidad de unirse a otras moléculas con alta afinidad y especificidad. Han sido generados contra una variedad de objetivos a partir de moléculas pequeñas [27], [28], [29], [30] y péptidos /proteínas [31], [32], [33], [34], [35] , [36] a las células enteras [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], así como las bacterias, los virus y los virus asociados a proteínas [37 ], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. La estrategia de selección basada en células genera aptámeros que se unen a objetivos desconocidos en su estado nativo. Sin embargo, el objetivo aún puede ser identificado a través de la extracción de afinidad y espectrometría de masas [44], [45]. Para crear sondas más sensibles y selectivos para CRC, hemos desarrollado un panel de aptámeros de ADN que reconocen específicamente células de cáncer colorrectal. Estas sondas se generaron por la célula-SELEX usando líneas de células cultivadas de cáncer colorrectal DLD-1 y HCT 116. Los estudios de unión iniciales por citometría de flujo y microscopía confocal usando estas líneas celulares en cultivo muestran que la mayoría de nuestros aptámeros tienen alta afinidad y selectividad. Nuestros datos muestran, además, que estos aptámeros no reconocen las células de colon normales (cultivadas), ni se reconocen la mayoría de las otras líneas celulares de cáncer probados. Nuestros resultados muestran claramente que las sondas identifican proteínas de membrana específicos asociados con los cánceres colorrectales. Creemos que estas sondas podrían ser desarrolladas para la detección temprana de la enfermedad, así como marcadores de pronóstico, de los cánceres colorrectales.
Resultados
Durante la última década, varios aptámeros se han desarrollado para diferentes objetivos , incluyendo moléculas purificadas, así como los objetivos complejos, tales como las células vivas de diferentes tipos de cáncer. Hemos usado la estrategia de SELEX basada en células para generar un panel de aptámeros de ADN para los cánceres colorrectales. Una combinación de ADNss aleatorio (aproximadamente 10
14) se sometió a secuencial de unión y elución para seleccionar entre las secuencias de ADN de la piscina que tienen la capacidad de unirse a los marcadores de la célula diana de la superficie. DLD-1 y HCT 116 se utilizaron como dianas con HCT1116 y HT-29 como controles respectivos en selecciones separadas. La introducción de la selección contador proporciona la oportunidad de eliminar, en la medida de lo posible, los marcadores de superficie común, mientras que al mismo tiempo enriquecer marcadores diferenciales en las células diana. La piscina de ADN recogidos después de cada ronda de selección fue amplificado por PCR, y el producto se utilizó para preparar ssDNA para la siguiente ronda de selección. En esta estrategia de selección, la incubación de la piscina de ADN con las células se realizó en placas de cultivo (monocapas de células). El enriquecimiento de la piscina selección a través de la selección sucesiva se controló por citometría de flujo. Con el fin de usar las células para citometría de flujo, las células se cultivaron durante una noche y se disociaron usando corto período de tiempo (30 seg-1 min) tratamiento con tripsina y la solución /o no enzimática de disociación celular (MP Biomedicals). tiempo de tratamiento corto con tripsina no tenía ningún efecto observable con respecto a la capacidad de la piscina selección de reconocer las células, ya que no se observó ninguna diferencia entre las intensidades de señal de la tripsina y las opciones de tratamiento no enzimáticos (Texto S1, Figura S1 ). Cambio de Pico (aumento de la intensidad de fluorescencia en comparación con la biblioteca) es una indicación de la intensidad de fluorescencia de la célula como resultado de la secuencia de ADN marcado unión a las células (Figura 1). Con el creciente número de ciclos de selección, hubo un aumento constante de la intensidad de fluorescencia de las células diana, lo que indica que las secuencias de ADN con mejor unión a las células diana se estaban enriquecidos. Sin embargo, no hubo cambio de pico significativo con las células de control, especialmente en las rondas a principios y mediados de la selección. Por la 14
ª ronda de selección, había un aumento significativo de la señal de fluorescencia de la diana en comparación con las células de control. Otros dos rondas adicionales (16
ª ronda) condujeron a un aumento en la mejora de la señal del control, pero no un incremento significativo para el objetivo. Esto es posible en el extremo terminal cuando la selección se continuó adicionalmente incluso cuando no hay ninguna diferencia significativa de la señal entre las piscinas sucesivas a la diana. Las piscinas altamente enriquecidas se clonaron y secuenciaron los clones positivos. El análisis de secuencia proporcionado candidatos potenciales de aptámero de ADN agrupadas en familias basadas en su homología de secuencia. Cerca de 8 familias homólogas distintas y muchas secuencias al azar se identificaron para la selección DLD-1. El número de secuencias en las familias homólogas distintos varió 6-110 (Tabla 1) con pocas mutaciones de base dentro de una familia. secuencias representativas de las diferentes familias fueron elegidos para poner a prueba sus interacciones con el objetivo.
dirección de las flechas muestra el aumento de rondas de selección del 5
al 16
ª piscina. A medida que avanzaba la selección no fue mayor aumento correspondiente de la intensidad de fluorescencia de la diana que el control. El aumento repentino de la señal de fluorescencia del control del 14
al 16
ª ronda sin el correspondiente aumento en el blanco indica mayor enriquecimiento.
El ciclo continuo de amplificación (RCA ) los productos de la secuenciación se utilizaron para el cribado inicial. Los productos de los pocillos seleccionados se diluyeron con 100 l H
20 y se utilizan para la amplificación PCR. Los productos de PCR se utilizaron para preparar ADN monocatenario y luego utilizados para los ensayos de unión. Dos secuencias que tienen al menos una mutación de base fueron seleccionados de las familias con secuencias de más de 20 (Tabla 1). El uso del producto RCA nos proporcionó un método más rápido de cribado para los candidatos potenciales de aptámero. Las secuencias con señal mayor que la del control (Texto S1, S2 figura) de unión se sintetizaron químicamente y se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o biotina en el extremo 3 '. Todas las secuencias sintetizados fueron purificados por HPLC y luego cuantificados. Los ensayos de unión se realizaron utilizando citometría de flujo, como se describe, y la señal de unión se detectó directamente en FL1 para sondas FITC, FL2 para PE conjugada con estreptavidina o FL3 para estreptavidina conjugada con PE-Cy5.5. Los ensayos de unión iniciales con las secuencias sintetizadas nombre KDED1 a KDED20 reveló muchas secuencias de unión a la diana celular (Figura 2). Algunas de las secuencias que pertenecen a la misma familia, y por lo tanto, previstas para ser vinculante para el mismo objetivo, mostraron diferentes intensidades de señal de unión a la diana. Estos incluyen KDED2 /KDED15; KDED1 /KDED5; KDED9 /KDED10, KDED3 /KDED19 y KDED7 /KDED18.
Las células fueron disociadas con una solución de disociación no enzimática. Las células se lavaron y se incubaron con diferentes candidatos de aptámero (histograma azul). La señal de fluorescencia se detectó por estreptavidina-PE-Cy5.5. La biblioteca no seleccionada se utiliza como señal de fluorescencia de fondo (histograma negro). Todos los aptámeros A (KDED2), B (KDED5), C (KDED7), D (KDED15), E (KDED19), F (KDED20).
Las selecciones co-corriente, utilizando sistema antibloqueo de frenos -1 (sin selección negativa) y HCT 116 como blancos, también generaron los siguientes: aptámeros KC2D3, KC2D4, y KC2D8 para DLD-1:. KCHA10 y KCHB10 para HCT 116 (Figura 3)
a (KC2D3 ), B (KC2D4), C (KC2D8). D (KCHA10), E (KCHB10).
Todos los aptámeros desarrollados se probaron además con todas las líneas celulares de cáncer colorrectal utilizados en este estudio. Los siguientes aptámeros mostraron reconocimiento sólo en la línea celular utilizada para la selección: KDED2 /KDED15, KDED7 /KDED18, KDED9 /KDED10 y KC2D3 (DLD-1) y KCHB10 (HCT 116). Figura 4 muestra la representación gráfica de la interacción entre los aptámeros individuales y las tres líneas celulares de cáncer colorrectal diferentes. La altura del cono representa el porcentaje de células que tenían la intensidad de fluorescencia por encima de la biblioteca de control con el umbral fijado en intensidad de la señal de fluorescencia 5%.
Los ensayos de unión se realizaron con DLD-1, HCT 116 y HT-29 . La intensidad de la fluorescencia de fondo de la biblioteca se estableció por debajo de 5% y después se determinó la señal de fluorescencia de los aptámeros individuales y se utiliza en la representación pictórica tal como se muestra.
A continuación, determinamos las constantes de disociación aparentes (Kd) para los aptámeros seleccionados, que oscilaban entre 0,68 nM y 302 nM (Tabla 2 y Figura 5). Con el fin de mejorar la eficiencia de la síntesis y también aumentar la flexibilidad de la manipulación química, algunos de los aptámeros fueron truncados, y también se evaluaron la resistencia de unión y aparente Kds de las secuencias truncadas. Antes de cada truncamiento, las posibles estructuras de cada secuencia de aptámero se prevé utilizar Integrated DNA Technologies OligoANALYZER bajo las condiciones de selección. Se seleccionaron las estructuras de horquilla más favorables y la cuelgan sobre las bases en los extremos 3 'y /o el extremo 5' eliminado, cada uno a la vez. Series de truncamientos se hicieron y cada uno de estos finalmente se probó con las células positivas para evaluar la unión. El truncamiento de KCHA10 (KCHA10a) no cambió las propiedades del aptámero. Sin embargo, se observó una mejora significativa de la afinidad de unión con KDED7 truncamiento (KDED7a) y las diversas formas de KDED2 (KDED2a, KDED2a-1 y KDED2a-3), como se demuestra en las afinidades mejoradas de las versiones truncadas (Tabla 2). Por ejemplo, la Kd de KDED7 mejoró de 157,3 nM a 46,8 nM, la mejora de 3 veces, mientras que KDED2 mejoró de 191,9 nM a 29,9 nM, una mejora de 6 veces. El resto no mostró observables unión a la diana. En casi todos los ensayos reportados, hemos utilizado todas las secuencias individuales (truncada y de longitud completa) de KDED2, ya que la diferencia en la afinidad de unión puede influir en la sensibilidad de un ensayo particular.
Las células se incubaron con diferentes concentraciones de aptámero marcado con biotina por duplicado. La señal de fluorescencia se detectó con estreptavidina-PE-Cy5.5. La intensidad de fluorescencia media de la biblioteca no seleccionada (unión de fondo) en cada concentración se resta de la intensidad media de fluorescencia del aptámero correspondiente. La intensidad de fluorescencia real fue equipado en Sigmaplot para determinar la Kd aparente.
Además, examinó la selectividad mediante pruebas de la interacción entre los aptámeros y líneas de células normales en cultivo, así como líneas de células de otro cáncer, incluyendo leucemia, pulmón, ovario, cerebro y cáncer de cuello uterino. Como se muestra en la Tabla 3, entre los aptámeros ensayados, KDED19 y KC2D8 mostraron intensidad de la señal significativa por encima de la biblioteca de control de algunas de las líneas celulares. Por ejemplo, hubo un reconocimiento significativo (≥ +++) de KDED19 a Caov3, TOV21G, CEM y H661, mientras que Hela y U87MG demostraron una reducción de la señal (Tabla 3). KC2D8 mostró una tendencia similar a la de reconocimiento de KDED19 con las líneas celulares ensayadas (Tabla 3). No había señal observable de los otros aptámeros con cualquiera de las líneas celulares ensayadas, incluyendo las líneas de células de colon normales (CCD18Co y FHC) y las células del colon humanos frescos (Texto S1, la figura S3). Esto implica que la mayoría de los aptámeros desarrollados son específicos de los cánceres colorrectales (Tabla 3). Esta observación es importante, ya que ofrece muchas opciones posibles para un mayor desarrollo de estos aptámeros para estudios de cáncer colorrectal. Debido al patrón de unión similar se observa con KDED19 y KC2D8, especialmente con la señal de la CEM, se decidió utilizar Sgc8 contra estos aptámeros en los ensayos de competición preliminar posteriores para verificar la molécula diana.
En general, la estrategia de células-SELEX produce diferentes tipos de aptámeros para diferentes objetivos y /o el mismo objetivo presentes en la superficie extracelular de las células. Para ello hemos realizado ensayos de competición para evaluar si alguno de estos aptámeros, especialmente aquellos de familias diferentes, podría influir en la unión del otro. Obviamente, era razonable suponer que las secuencias sintetizadas a partir de la misma familia competirán; También, las secuencias que se unen a las células diferentes no competirán entre sí. Por ejemplo, es posible que KDED2 para competir con KDED15, pero es poco probable que competirá con KDED5 o KCHA10. Sobre esta base, se realizó la competencia de KDED2 (FITC) contra KDED7, KDED10, KDED18, y KC2D3 (sin marcar), y KCHA10 (FITC) contra KDED5, KDED20, KC2D4, KDED19 y KC2D8 (sin etiqueta), terminando con KC2D4, KC2D8 y KDED19 contra CEM aptámero Sgc8 (sin marcar). exceso de diez veces de la competidor no marcado se incubó primero con DLD-1 antes de la introducción del aptámero marcado con FITC. Esto aseguró la ventaja competitiva y el potencial para saturar y bloquear la unión de la segunda aptámero si ambos unidos al mismo objetivo o si la unión de una influyeron en la unión del aptámero secundaria. Unlabeled KDED2 y KCHA10 se utilizaron en estos ensayos como control positivo. KDED2 unión no fue influenciado por cualquiera de los aptámeros probados en contra de ella. Del mismo modo, no se observó ninguna competencia entre KCHA10 y cualquier aptámeros que compiten. Sin embargo, hubo una influencia significativa en la unión de KDED19, KC2D4, y KC2D8 en presencia de exceso de 10 veces de Sgc8 no marcado (Texto S1, figura S4). Este resultado sugiere que estos aptámeros pueden ser vinculante para el mismo objetivo que Sgc8. Esto sugiere además que KDED19, KC2D4 y KC2D8 competirán entre sí, a pesar de no haber realizado tal ensayo de competición. Estos fueron desarrollados usando aptámeros DLD-1, que no contaba con el bloqueo inicial usando Sgc8. Esto apoya la idea de que es posible bloquear un marcador conocido con el fin de permitir el desarrollo de sondas para dianas de interés.
imágenes inmunohistológica y microscopía de fluorescencia han sido ampliamente utilizados en el estudio de tumores sólidos y, en en particular, los cánceres colorrectales. Por lo tanto, también se evaluó si estos aptámeros se podrían utilizar para la formación de imágenes del tumor con la línea celular positiva. En este estudio preliminar, se utilizó líneas de células cultivadas. Aquí hemos realizado ensayos de unión en placas de cultivo similares a las del protocolo de selección, pero con la confluencia celular de más de 60%. Después del lavado, se detectó la señal con el conjugado o PE-estreptavidina estreptavidina-Alexa Fluor 633. La Figura 6 muestra las imágenes confocales de KDED2, KDED3, KDED5 y KDED7 detectó con PE-estreptavidina. No fue significativa intensidad de señal de los aptámeros probados en comparación con la biblioteca no seleccionada. El patrón de señal muestra que los aptámeros unidos a la superficie de las células unidas a la placa de cultivo.
Las células se incubaron con aptámero conjugado con biotina y el evento se observó unión con estreptavidina conjugada con PE. A (biblioteca no seleccionada muestra la unión de fondo); B (KDED2); C (KDED3); D (KDED5) y E (KDED7).
Del mismo modo, se observó señal de fluorescencia significativa de estreptavidina-Alexa Fluor 633 conjugados cuando se utilizó DLD-1 contra los otros aptámeros, incluyendo KCHA10, KC2D8, KDED18 , KDED19, y KDED20 (Figura 7), así como células HCT 116 con KCHA10 y KC2D8. Como era de esperar, no se unió KDED2 HCT 116. La intensidad de la señal de fluoróforo siguió el mismo patrón que la citometría de flujo. Curiosamente, KC2D8 mostró una señal más fuerte con HCT 116 que con DLD-1.
Las células se incubaron con aptámero conjugado con biotina y se observó el acontecimiento de unión con AlexaFluor 633 estreptavidina conjugada. biblioteca no seleccionada muestra la unión de fondo. Los aptámeros muestran una unión significativa sobre la señal de fondo. Para las células DLD-1, A = biblioteca no seleccionada; B = KCHA10; C = KDED19; D = KC2D8; E = KDED18; F = KDED20 y para las células HCT 116, G = biblioteca no seleccionada; H = KCHA10; I = KC2D8 y J = KDED2a-3.
Es habitual suponer que los aptámeros seleccionados frente a líneas celulares tumorales se unen a las proteínas de la superficie. Esto se ha demostrado en la mayoría de los protocolos de SELEX que implican líneas de células tumorales [44], [45]. A fin de no traducir completamente cualquier uno de datos de SELEX a la otra, se realizaron ensayos para determinar preliminarmente las moléculas en la superficie celular a la que se unirían los aptámeros seleccionados. En este ensayo, las células dc-1 se trataron con tripsina y /o de proteinasa K durante 15 min a 37 ° C. Después del período de incubación, la actividad de la proteasa se detuvo con la adición de medio de cultivo frío en hielo que contiene FBS. Las células se lavaron rápidamente dos veces por centrifugación y después se incubaron con los aptámeros. Se utilizaron las células no tratadas como control positivo. La Figura 8 muestra la respuesta de la unión después de la actividad de la proteasa aptámero. A excepción de KDED5 y KCHA10, todos los otros aptámeros perdieron reconocimiento tanto en las células K tratados con tripsina y proteinasa. Las señales de fluorescencia reducen al fondo, lo que indica que el tratamiento de células con las proteasas causó la digestión de la proteína diana. Para KDED5, hubo una reducción significativa en la intensidad de la señal, pero la señal KCHA10 reduce sólo ligeramente, lo que indica que los objetivos no han sido totalmente afectados por el tratamiento.
Las células se trataron con tripsina y proteinasa K durante 15 min y luego se incubaron con aptámero. La célula no tratada se incubaron con aptámero se utilizó como control positivo. histograma negro, (biblioteca no seleccionada con las células no tratadas); rojo (aptámero con las células no tratadas); azul (biblioteca no seleccionada con las células tratadas con tripsina); púrpura (aptámero con las células tratadas con tripsina) y cal (aptámero con proteinasa K tratada). Se evaluaron los siguientes aptámeros; A (KDED2); B (KDED5); C (KDED10); D (KDED18); E (KDED20); F (KCHA10); G (KC2D3); H (KC2D4), I (KC2D8). Con la excepción de KDED5 y KCHA10 que redujo sólo mínimamente, la señal de todos los demás redujo significativamente
prevé dos posibles causas:. 1) la falta de tiempo de tratamiento con proteasa y /o 2) moléculas diana que tiene porciones significativas distintas de proteínas, tales como carbohidratos o proteínas fuertemente glicosilada no totalmente expuestos a la digestión por proteasas. En respuesta, se realizó mucho tiempo (30 min y hora 1) el tratamiento con proteasa con mayores concentraciones de proteinasa K, así como el tratamiento glicosidasa. El aumento de la concentración de proteasa, así como el tiempo de incubación largo, no afectó a la unión de estos dos aptámeros. Además, la incubación de las células con glicosidasas O-ligados y unidos a N, seguido de tratamiento con proteasas no influyó significativamente en la unión de estos dos aptámeros. Creemos que los ensayos de glucosidasa no pueden ser concluyentes ya que no se encontró literatura para apoyar la eficacia de este ensayo usando líneas de células cultivadas en lugar de glicoproteína puro.
El desarrollo de aptámeros que se unirá a la diana en condiciones variables , especialmente a la temperatura fisiológica y en medio de cultivo, es importante. Esto aumentará la flexibilidad con la que estos aptámeros pueden ser adoptadas y aplicadas en muchas plataformas de ensayo. por lo tanto, se evaluó la unión de los aptámeros a 37 ° C, en medio de cultivo, y bajo las dos condiciones simultáneamente. Como se muestra en la figura S5 (Texto S1), KDED2, KDED2a, KDED2a-1 (aptámero misma, pero diferente longitudes de secuencia) y KCHA10 mantiene una unión significativa a las células DLD-1. Las intensidades de las señales no fueron significativamente diferentes de los ensayos a 4 ° C. Por otra parte, los otros aptámeros habían reducido intensidad de la señal a DLD-1. La diferencia de señal puede ser el resultado de la afinidad diferencial de aptámeros individuales. Por ejemplo, KDED2 (mejor afinidad) y KDED15 pertenecen a la misma familia, pero KDED15 no mostraron unión significativa a 37 ° C. En los experimentos de RPMI-1640, KEDE2, KDED2a y KDED2a-1 mostraron la misma fuerza de unión, incluso cuando la incubación se realizó a 37 ° C. KDED5 y KCHA10 mostraron una reducción, pero significativa de unión, en lugar de los aptámeros restantes (Texto S1, Figura S6), algunos de los cuales casi no mostraron unión. Esta observación es importante en el desarrollo de ensayos basados en aptámeros, tales como la terapia dirigida, ensayos de apoptosis y viabilidad en condiciones fisiológicas.
Discusión
evolución sistemática de sondas de ácido nucleico para el reconocimiento molecular tiene generado un gran número de aptámeros útiles para diversas aplicaciones en diversos campos, incluida la biotecnología, la biomedicina, farmacología, microbiología y química. Hemos utilizado células en SELEX para generar un panel de aptámeros de ADN que tienen un reconocimiento específico a los cánceres colorrectales. En este informe, se utilizó DLD-1 y HCT 116 ya que las líneas de células diana, y la selección se realizó en la placa de cultivo. Creemos que este sistema es una representación exacta del estado nativo de los marcadores de superficie. En una de las selecciones con DLD-1, se presentaron selección negativa con la línea celular HCT 116 con el objetivo de seleccionar un panel de aptámeros con diversos patrones de reconocimiento a los cánceres colorrectales. Tradicionalmente, con el fin de garantizar la eficiencia de la selección negativa, la línea celular de control es a menudo en de 5 a 10 veces el exceso de la línea celular diana. Sin embargo, en estos esquemas, porque la selección se realizó en la placa de cultivo, los volúmenes de incubación limitan el tamaño de placa de cultivo que podríamos utilizar. En consecuencia, sólo se utilizó el exceso de alrededor de 2 veces de la línea celular de control. Por lo tanto, prevé que la relación de la las líneas de células positivas y negativas era insuficiente para eliminar potencialmente un número significativo de las secuencias de unión a los marcadores comunes. Sin embargo, creemos que proporcionó la oportunidad para nosotros para enriquecer en aptámeros que podrían tener patrones de unión diferencial a las líneas celulares de cáncer colorrectal.
unión secuencial y la elución de la piscina biblioteca de ADN con las células positivas y negativas producidas finalmente ADN