Extracto
Antecedentes
El cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres. enfermedad en estadio temprano a menudo no se detecta debido a la falta de síntomas y marcadores biológicos fiables. La identificación de cambios genéticos tempranos podría proporcionar información sobre nuevas vías de señalización que pueden ser explotadas para la detección y tratamiento tempranos.
Metodología /Principales conclusiones
del epitelio superficial del ovario
Ratón células (MOSE) se utilizaron para identificar los cambios de etapa dependiente en los niveles de expresión de genes y vías de transducción de señales por el ratón analiza toda microarrays genoma y la ontología de genes. Estas células han sufrido una transformación espontánea en el cultivo celular y la transición de no tumorigénicos a fenotipos intermedios y agresivo, malignas. Es significativo que las modificaciones de los genes estaban sobrerrepresentados en una serie de vías, en particular la categoría funcional citoesqueleto. Al mismo tiempo que los cambios de expresión génica, la arquitectura del citoesqueleto se convirtió progresivamente desorganizada, lo que resulta en la expresión aberrante o distribución subcelular de las proteínas reguladoras del citoesqueleto clave (quinasa de adhesión focal, α-actinina, y vinculina). La desorganización del citoesqueleto se acompaña de patrones alterados de la serina y la fosforilación de la tirosina, así como cambio de la expresión y localización subcelular de la integral de señalización intermedias APC y PKCβII.
Conclusiones /Importancia
Nuestros estudios han identificado los genes que se expresan de forma aberrante durante celular MOSE progresión neoplásica. Mostramos que la desregulación etapa temprana de microfilamentos de actina es seguido por la desorganización progresiva de los microtúbulos y los filamentos intermedios en etapas posteriores. Estos cambios graduales etapa específica de facilitar la comprensión de la secuencia temporal y espacial de los eventos que conducen al estado totalmente transformado, ya que estos cambios también se observan en líneas de ovario humano agresivos celulares de cáncer, independientemente de su tipo histológico. Por otra parte, nuestros estudios apoyan una relación entre la organización del citoesqueleto aberrante y la regulación de importantes eventos de señalización que pueden estar implicados en la progresión del cáncer. Por lo tanto, nuestro modelo celular MOSE derivados constituye un modelo único en profundidad estudios sobre el mecanismo de la progresión del cáncer de ovario
Visto: AL. Creekmore, Silkworth WT, Cimini D, Jensen RV, Roberts PC, Schmelz EM (2011) Los cambios en la expresión génica y la arquitectura celular en una progresión Modelo cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (3): e17676. doi: 10.1371 /journal.pone.0017676
Editor: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Noviembre 2010; Aceptó 8 de febrero de 2011; Publicado: 3 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Creekmore et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los estudios fueron apoyados por el NIH R01 CA118846 (a EMS, PCR) y AICR conceder 04B071 (EMS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario sólo el 3% de los cánceres diagnosticados, sino que es la quinta causa de muerte por cáncer en la mujer, con tasas de supervivencia a cinco años de sólo el 45% [1]. La edad promedio de diagnóstico es de 63 años de edad, y la mayoría de los pacientes (62%) se presentan con enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico [1]. El cáncer de ovario es una enfermedad heterogénea con diferentes subtipos his- o clínico-patológicos que se desarrollan y presentes de manera diferente. El punto de vista convencional es que aproximadamente el 90% de los cánceres de ovario se deriva de la capa de una sola célula de epitelio de la superficie que rodea el ovario [2]. A medida que el epitelio de ovario se transforma en un fenotipo maligno, que se diferencia en varios subtipos que se han clasificado en el carcinoma de células serosas, mucinoso, endometrioide y claro, en base a su morfología en lugar de su genotipo [3]. Sin embargo, el origen de los subtipos individuales pueden variar y una mayor aportación de las trompas de Falopio y el endometrio a los cánceres más agresivos se encuentra actualmente en discusión [4]. El origen de ambos epitelial de ovario y de Falopio es el mismo, es decir, el epitelio celómico [2], que puede contribuir a la controversia.
epiteliales cánceres de ovario muestran un alto grado de heterogeneidad genética como resultado de mutaciones, silenciando, y deleciones. Dado que los cambios en la expresión génica, ya sea a través de la mutación, la regulación epigenética, o eventos de empalme diferenciales, el desarrollo de tumores influencia, la progresión, capacidad de respuesta de drogas y en última instancia, la supervivencia del paciente, la identificación del subtipo de tumor y su huella genética es esencial. Recientemente, una nueva clasificación de los tumores epiteliales de ovario en tipo I y tipo de cáncer II se ha propuesto: tipo 1 son benignos con los tumores borderline con genotipos relativamente estables mientras que el tipo II se incluyen los tumores agresivos y de alta calidad que son genéticamente inestables y presentan cambios genéticos sustanciales [ ,,,0],5]. La mayoría de los cánceres epiteliales siguen un esquema de progresión en la que inició células progresan a adenomas a adenocarcinomas y la metástasis, la acumulación de alteraciones genéticas de una manera paso a paso durante la progresión [6]. Esta secuencia también se ha descrito para los carcinomas de ovario de bajo grado; es, sin embargo, debate si todos los cánceres de ovario siguen este desarrollo del cáncer ya que las lesiones precursoras de los tumores de ovario más agresivos (tipo II) no se han identificado de manera concluyente [5]. Recientemente, Lee et al. han propuesto que las fimbrias de la trompa de Falopio puede ser el origen de "tipo II" células de carcinomas serosos [7]. Proponen que el tipo II que aparecen los tumores de las lesiones "firma p53" precursores procedentes de la amplificación de las células epiteliales secretoras. mutaciones posteriores a continuación, facilitan la progresión a carcinoma intraepitelial tubárica seroso y en última instancia a carcinoma seroso.
Actualmente, los patrones de expresión de genes sólo se han utilizado con éxito para distinguir entre células mucinoso y claro de carcinomas serosos [8] o entre bajo grado , bajo potencial de malignidad y de alto grado, los tumores metastásicos [9], [10], [11]. marcadores moleculares o clínicos fiables para identificar cambios en las primeras etapas de la progresión no se han establecido aún, y desde las primeras etapas de la enfermedad son relativamente asintomáticos el diagnóstico a menudo sólo se produce en las etapas finales. Por lo tanto, la caracterización de los perfiles de expresión génica de las lesiones precursoras etapa temprana del cáncer de ovario podría proporcionar nuevos conocimientos e identificar nuevas dianas para los esfuerzos de prevención y tratamiento.
Hemos desarrollado previamente y caracterizado un modelo de célula epitelial de la progresión del cáncer ovárico para estudiar la secuencia de eventos que conducen a cáncer de ovario epitelial [12]. Las células de ratón singénico de ovario epitelial de superficie (MOSE), derivados de los ratones C57BL6, han experimentado una transformación espontánea en el cultivo celular. Las células MOSE heterogéneos se someten a distintos cambios fenotípicos a medida que se pasan de forma continua en la cultura, con pasajes tempranos que representan una premaligna, fenotipo no tumorigénicos, pasajes intermedios representan un fenotipo de transición, y los pasos posteriores que evolucionan hacia un fenotipo maligno muy agresivo cuando se administra a inmunocompetentes ratones . estados de transición de la progresión eran distinguibles por alteraciones en las tasas de crecimiento, tamaño celular, pérdida de inhibición por contacto del crecimiento y la capacidad de crecer como esferoides en condiciones no adherentes. Es importante destacar que, tanto el MOSE-I (conducto intermedio) y MOSE-L (paso tarde) células también han adquirido la capacidad para formar tumores cuando se inyectan en la cavidad peritoneal de ratones inmunocompetentes singénicos, aunque el primero era menos invasiva [12].
en el presente estudio, se identificaron cambios significativos en los patrones de expresión de genes como la transición células derivadas del MOSE no transformado a fenotipos agresivos y herramientas de ontología de genes utilizados para determinar sus más categorías funcionales. Los estados de transición de este modelo nos ha permitido identificar genes etapa dependiente, productos de genes y vías de transducción de señales implicadas en la progresión del tumor de ovario. Aquí destacamos cambios progresivos que conducen a un citoesqueleto muy mal regulada. Muchos de estos cambios se confirmaron en los conjuntos de datos archivados humanos de ovario cáncer de microarrays. Es importante destacar que demostrar que la desorganización del citoesqueleto puede tener efectos profundos sobre la localización subcelular de señalización intermedias importantes, que en última instancia pueden llevar a vías de señalización moduladas que contribuyen al desarrollo del cáncer de ovario. Estos genes, sus productos genéticos y las vías de señalización asociadas pueden representar nuevas dianas para la intervención temprana de la progresión neoplásica.
Resultados
genes regulados diferencialmente en el cáncer de ovario de ratón progresión
Para identificar los cambios de expresión génica durante la progresión del cáncer epitelial de ovario y determinar los patrones potenciales específicos de la etapa, se utilizó el análisis de todo el genoma de microarrays para comparar los niveles de expresión génica en células que representan benigna (MOSE-e), el intermedio (MOSE-I), y maligno ( etapas de cáncer de ovario de ratón MOSE-L). Tres repeticiones biológica se utilizaron para tener en cuenta las variaciones dentro de las culturas heterogéneas. De los 45,102 sonda fija en el microarray (que representa 18.136 genes anotados), se encontraron 960 conjuntos de sonda a ser significativamente hasta reguladas (701 genes anotados) y 1006 fueron significativamente las reguladas (711 genes anotados) mayor que 2 veces (p ≤ 0,05) entre las células MOSE-L-e y MOSE. De estos 1966 cambiantes sonda fija, 58,9% no presentó ningún cambio significativo en los niveles de expresión durante la progresión entre MOSE-E y MOSE-I, lo que indica que la mayoría de los cambios en la expresión génica están asociados con sucesos posteriores en la progresión maligna en nuestro modelo, con 608 y 549 cada vez mayor decreciente a medida que las células de transición de Mose-I a Mose-L. Por el contrario, el 33,3% de los genes afectados mostró un aumento progresivo (272 conjuntos de sonda) o disminuir (382 conjuntos de sonda) en la expresión como células de transición de Mose-E para Mose-I a Mose L-células (Figura 1). Un pequeño número de conjuntos de sondas afectados, 3,9%, demostró relaciones MOSE-I /MOSE-E que estaban dentro de 0,4 veces de proporciones MOSE-L /MOSE-E, que indica que estos cambios de expresión génica pueden estar asociados con muy primeros eventos en maligno la progresión de nuestras células. En conjunto, estos datos indican que la mayoría de los cambios en los niveles de expresión de genes o bien se producen continuamente, de forma gradual, a lo largo de la evolución de nuestro modelo o se llevan a cabo en las etapas posteriores, mientras que sólo un cambio subconjunto limitado durante las primeras etapas. El conjunto completo de datos se puede encontrar en la base de datos GEO (GSE24789).
De 45,102 sonda fija analizadas, 970 fueron significativamente (p = 0.05) hasta reguladas (A) y 1006 se redujeron reguladas (B ) mayor que dos veces. Las flechas indican el patrón de expresión cambia con el número de conjuntos de sonda indicadas junto a la flecha. Probe conjuntos indicados como otros no siguieron los patrones descritos.
representado exceso de genes ontología categorías en la progresión del cáncer de ovario
Para detectar las vías que pueden contribuir a la promoción y progresión de cáncer de ovario cáncer, se utilizó el programa de genes Trail para identificar las categorías funcionales de los genes que demuestran cambios estadísticamente significativos en sus niveles de expresión entre las células MOSE-L MOSE-e y. Gen Trail es una herramienta de análisis conjunto de genes de enriquecimiento de avanzada que determina sobre-representados categorías de ontología de genes en los conjuntos de datos [13]. La sobre-representado componente celular, proceso biológico, y las categorías de ontología de genes función molecular que se encuentra en el MOSE-L-E frente MOSE conjuntos de genes expresados diferencialmente se enumeran en la Tabla 1 (p & lt; 0,01). El exceso de representación de los genes en el ciclo celular y la proliferación celular categorías fue anticipado debido a la mayor tasa de crecimiento se ha informado de las células MOSE-L [12] y la participación de la proliferación incontrolada de células en el cáncer [14]. Curiosamente, el citoesqueleto y categorías de unión de ión metálico /de cationes representados un número significativo de los genes expresados diferencialmente, con un solapamiento sustancial de genes categorizados en ambas categorías ontología. Sin embargo, en contraste con la amplia gama de funciones de los genes en la categoría de unión de ión metálico /de cationes, genes compilados en la categoría de la ontología de genes citoesqueleto eran funcionalmente muy específico. Ya que se cree que los cambios en los niveles de expresión de las proteínas del citoesqueleto y sus reguladores están asociados con la progresión y la metástasis [15], [16], [17], los cambios en los genes que participan en la estructura y regulación del citoesqueleto durante la progresión de nuestro modelo MOSE fueron objeto de una investigación adicional.
la desorganización del citoesqueleto celular durante la progresión maligna
citoesqueleto de actina.
de los 141 genes categorizadas dentro del citoesqueleto categoría de la ontología de genes, 90 tienen productos génicos que son subunidades de los filamentos de actina (Tabla 2) o están implicadas en la organización y la regulación del citoesqueleto de actina (Tabla 3; la lista completa en la tabla suplementaria S1). Para la mayoría de estos genes, los niveles de expresión cambiaron gradualmente de una manera escalonada como células de la transición de Mose-E para Mose-I a Mose-L, lo que indica que estos cambios se producen continuamente durante la progresión. Sólo tres genes, γ-actina 1, Formin 1, y drebrin 1, demostraron proporciones MOSE-I /MOSE-E que estaban a menos de 0,4 veces de proporciones MOSE-L /MOSE-E, lo que sugiere estos son los primeros cambios en la progresión maligna (Tabla 2 y 3). Siete genes, incluyendo la integrina-alpha v, -β1, y -β2, mostraron niveles de expresión que cambió por la mayor magnitud en las células MOSE-I, dos de los cuales fueron confirmados por qRT-PCR (Tabla 2 y Tabla 3). Un gran número de estos genes se desregula en el cáncer o involucrados en la metástasis incluyendo todos los 15 genes que fueron confirmados por qRT-PCR (Tabla 2 y 3).
Los productos génicos de un subconjunto de genes confirmados por qRT-PCR también se analizaron por Western blot, así como la microscopía de inmunofluorescencia para determinar posibles diferencias en su localización subcelular. Los resultados de los microarrays indicaron una disminución progresiva de α-actina y mRNA γ-actina, que fue confirmado por qRT-PCR (Tabla 2), sin embargo, no se observaron cambios de β-actina. Esto corresponde a una disminución en los niveles de proteína total de actina durante la progresión (Figura 2A). Además, el examen de la arquitectura F-actina mediante microscopía de inmunofluorescencia reveló distintas diferencias de la organización subcelular de actina. células MOSE-E exhiben larga, bien definidas las fibras de estrés similares a cables después de la tinción con Alexa Fluor
488 faloidina conjugada, mientras que las células malignas MOSE-L muestran estructuras de F-actina menos definidos y organización. (Figura 3A, 1
columna st). En las células MOSE-L, las estructuras de actina variaron de fibras de estrés fina pequeñas a las zonas prominentes "volantes" con los filamentos de actina muy cortos, que recuerda a podosomes (Figura 3A y 3B, 2 confocal imagen recuadro). De nota, el MOSE-I exhibió F-actina desorganización similar a la de las células MOSE-L (Figura 3A). Para comparar específicamente contenido F-actina celular entre las líneas celulares MOSE, se empleó un procedimiento basado en faloidina conjugada con fluorescencia. Como se muestra en la Figura 4, celular F-actina total se redujo en un 78% (p & lt; 0,01). En células MOSE-L en comparación con las células MOSE-E, confirmando QRT-PCR y los resultados occidentales
Extractos de células enteras de Mose-e (e, barras blancas), MOSE-I (I, barras grises), y MOSE-L (L, barras negras), las células se sometieron a análisis de transferencia de Western con anticuerpos dirigidos contra proteínas reguladoras de actina (a) y ( proteínas B) de los microtúbulos. Los niveles de expresión se expresan como porcentaje MOSE-E niveles de normalización de la proteína ribosomal L19 (RPL19) o γ-tubulina durante tres repeticiones biológica hecha por duplicado ± la desviación estándar. Se muestra una mancha representante de las tres réplicas biológicas. * P ≤ 0,01.
(A) tinción de inmunofluorescencia de MOSE-E, MOSE-I y las células MOSE-L para visualizar los filamentos de actina (faloidina, verde), α- tubulina (2
ª columna), β- tubulina (3
columnas rd), o citoqueratina (4
ª columna) junto con el núcleo (azul, DAPI). (B y C) la tinción de Triple de células MOSE-L MOSE-E y con DAPI (azul), faloidina (f-actina, verde), y anticuerpos contra α-actinina (rojo, B) o vinculina (rojo, C). Las imágenes confocales muestran son 0,6 micras aparte dentro de la célula, con la imagen 1 a partir de la base de la célula y la imagen 2 hacia la parte superior de la celda. Co-localización aparece como el amarillo en las imágenes fusionadas y confocal. (D) tinción triple de MOSE-E y las células MOSE-L con DAPI (azul), anticuerpo contra FAK (verde), y el anticuerpo contra la FAK fosforilada en tirosina 861 (rojo, FAK
Y861). Amarillo imagen fusionada en indica la co-localización. (Aumento original X600) guía empresas
Un número igual de células MOSE-L MOSE-E o en plateado. Después de 48 horas, las células fueron fijadas con paraformaldehído y se tiñeron con faloidina conjugada con Alexa Fluor
488. La faloidina se solubilizó con MeOH y se determinó la fluorescencia. Los datos se normalizaron al número de células y se presentan como las medias unidades relativas fluorescentes (RFU) por célula ± la desviación estándar. . * P ≤ 0,01
La microscopía confocal reveló gran diferencia en el grosor de las células; células MOSE-E tenían un espesor medio de 2 micras, lo que indica que estas células son más bien plana cuando se cultiva en plástico, mientras que las células MOSE-L mostraron un espesor medio de 4,4 micras a través de las regiones citoplásmicas. Las imágenes confocales muestran en la Figura 3B (imagen confocal 1 y 2) son consecutivos Z-pilas 0,6 micras aparte a partir de la base de la celda en la que las fibras de actina se encuentran abundantemente en los sitios de fijación. Desde la celda de media MOSE-L es 4,4 m de espesor, la segunda imagen captura aproximadamente el tercio medio de la celda, no la membrana, lo que sugiere las estructuras no fibrosos en las células MOSE-L no son el resultado de la membrana fruncido. Sin embargo, están dentro del citoplasma de la célula y son reminiscencias de estructuras caracterizadas en células de cáncer de mama invasivo como podosomes [18]. Por el contrario, MOSE-E células (Figura 3B) mostró fibras de estrés a lo largo de las células sin filamentos de actina cortos.
Los microtúbulos.
Los productos génicos que lo componen o regulan la red de microtúbulos compone el segundo más grande conjunto de genes (44 de 141) afectados durante la transformación neoplásica de las células MOSE (Tabla 4; la lista completa en la tabla suplementaria S2). Todos menos seis genes son solamente hacia arriba o hacia abajo-regulada en las células MOSE-L. Cinco genes (Tubb2b, CENPE, Mtap6, NDN, y Vav2) tenían niveles de expresión que cambian gradualmente de Mose-E para Mose-I a Mose-L, lo que indica que estos cambios se producen continuamente durante la progresión. Sólo un gen, Ninl, demostró relaciones MOSE-I /MOSE-E que, cuando dentro de menos de 0,4 veces de relaciones /MOSE-L MOSE-E, lo que sugiere que este es un evento temprano en la progresión maligna (Tabla 4). Curiosamente, de los 44 expresados diferencialmente los microtúbulos y los genes asociadas a los microtúbulos, 12 genes codifican para proteínas implicadas en el cromosoma congression (Kif18a, Kif22, Kif4), la segregación (ASPM CENPE, Ckap2, INCENP, Jub, Kif20a, Kif23, LATS2, PRC1) , y /o la citocinesis (INCENP, Kif20a, Kif23, PRC1) (Tabla 4) [19]. Todos los 12 genes mostraron una disminución de la expresión con cinco de los 12 genes que codifican para kinesins que son motores moleculares que utilizan la energía de hidrólisis de ATP para moverse a lo largo de la superficie de los filamentos de microtúbulos o desestabilizar ellos [19], [20].
Una disminución significativa en los niveles de 4a isoforma α-tubulina y múltiples isoformas de β-tubulina también se observó en los datos de microarrays. Confirmación por qRT-PCR de las isoformas individuales resultó difícil debido a los altos niveles de homología, pero se confirmó la disminución de ARNm de tubulina en las células β3 MOSE-L. Sin embargo, no se detectaron cambios significativos de los niveles de proteína beta-tubulina entre las células MOSE-L MOSE-E y (Figura 2B). En contraste, los niveles de proteína alfa-tubulina se redujeron en 34% en las células MOSE-L y 67% en las células MOSE-I en comparación con los niveles de MOSE-E. No se observaron cambios significativos en gamma-tubulina de ARNm (datos no mostrados) o los niveles de proteína (Figura 2B) y la inmunotinción no revelaron diferencias fácilmente discernibles en la localización de proteínas entre las células MOSE-L MOSE-E y (datos no mostrados).
Es importante destacar que existen diferencias notables entre las células MOSE-L MOSE-e y cuando la organización subcelular de las proteínas de los microtúbulos, alfa y β-tubulina, se examinaron mediante inmunofluorescencia (Figura 3A). En las células MOSE-E, tanto α- y β-tubulina aparecer como largos filamentos que irradian definida de lo que es probable que sea el centríolo localizado perinuclear (Figura 3A, 2
ª y 3
Panel de columnas rd superior), informó ser una organización normal de la tubulina en las células epiteliales. Por el contrario, en las células MOSE-L filamentos de tubulina eran menos definidas, exhibiendo al azar ramificación desorganizado y el origen de la polimerización de tubulina no era evidente en muchas células (Figura 3A, 2
ª y 3
columnas tercera, panel inferior ). células MOSE-I parecen tener un fenotipo intermedio con la aparente centriolo en aproximadamente 50% de las células junto con más cortas, filamentos menos definidos que en las células MOSE-E (Figura 3A, 2
nd y 3
columna rd , paneles centrales).
filamentos intermedios.
el subconjunto final del citoesqueleto genes asociados afectados (7/141) tienen productos de los genes que conforman y regulan la red de filamentos intermedios (IF). Los niveles de mRNA para el número de citoqueratinas disminuyeron en células MOSE-L con citoqueratinas 7,8, y 19 verificados por qRT-PCR (Tabla 5). La inmunotinción con un anticuerpo pan-citoqueratina revelado que las células MOSE-E tienen una red de filamentos intermedios bien organizada que se extiende a lo largo de las células, mientras que la red de filamentos intermedios en células MOSE-L se compone de estructuras filamentosas cortas que no se irradian a través de la célula en una de manera organizada (Figura 3A, última columna). filamentos de citoqueratina bien definidos se observaron en sólo el 25% de las células MOSE-I, mientras que el resto de las células que muestran la tinción de citoqueratina difusa con la organización limitada reminiscencia de células MOSE-L.
Comparación con archivada conjuntos de datos de microarrays de ovario cáncer humano
con el fin de determinar la relevancia de los cambios observados en los genes del citoesqueleto niveles de expresión de nuestro modelo de progresión de células MOSE al cáncer de ovario humano, se evaluaron los conjuntos de datos de microarrays de ADN archivados que compararon la expresión génica niveles en diferentes líneas celulares de ovario humano establecidos con células epiteliales de ovario normales como superficie de referencia (véase Materiales y Métodos para una descripción de las líneas celulares evaluadas). Aunque la expresión diferencial de los genes del citoesqueleto no fuera un punto focal en estos estudios en humanos, aproximadamente el 50% de los genes de adhesión asociado de actina y de atención que figuran en la Tabla 2 como significativamente las reguladas durante la progresión de células MOSE también fueron significativamente las reguladas en el ovario humano líneas celulares. Como se muestra en la Tabla 6, se produjo un enriquecimiento claro para cambios significativos en la actina y los genes de adhesión focal asociada. Utilizando la distribución binomial acumulativa, la probabilidad estimada de observar esto, muchos expresan diferencialmente actina y los genes de adhesión focal en los estudios en humanos por casualidad eran 2,23 × 10
-6 y 1,87 × 10
-7, respectivamente, para la comparación con datos de Nagaraja et al. [21] y Iorio y cols. [22]. Además, el análisis comparativo reveló que varios genes se unen a actina adicionales enumerados en la Tabla 3 se downregulated significativamente en las líneas celulares de cáncer de ovario humano. Es de destacar que Marcks y TPM2 fueron regulados a la baja por los de 10 y 23 veces, respectivamente en las células tumorales de ovario agresivos en comparación con OSE normal. La superposición de los genes expresados diferencialmente en la categoría funcional de los microtúbulos no alcanzó significación [21]. Esto puede ser el resultado de las comparativamente pequeños cambios en los niveles de expresión de genes en esta categoría. Sin embargo, el gen NDN, que era 27 veces el regulado en las células MOSE, era tanto como 125 veces el regulado en las líneas celulares de cáncer humano [21]. En conjunto, estos resultados sugieren que los cambios en el citoesqueleto son comunes a muchas líneas celulares de cáncer de ovario, independientemente de su tipo histológico.
Los cambios en la regulación del citoesqueleto de actina y la arquitectura durante la progresión neoplásica
Para determinar los mecanismos de desregulación del citoesqueleto durante MOSE progresión maligna, se investigaron los niveles de expresión y localización subcelular de varias proteínas reguladoras, incluyendo α-actinina, vinculina y la quinasa de adhesión focal (FAK). Estas proteínas fueron elegidos debido a su participación en la regulación del citoesqueleto, la motilidad celular y la progresión del cáncer /metástasis. α-actinina está involucrado en la agrupación de actina por los filamentos de actina de reticulación y es parte del complejo de adhesión focal que une el citoesqueleto de actina de las integrinas [23], [24]. Los resultados de microarrays indicaron que disminuye progresivamente los niveles de expresión de α-actinina que fueron confirmados por qRT-PCR (Tabla 2). α-actinina los niveles de proteína se redujo significativamente tanto en las células MOSE-L MOSE-I y comparación con las células MOSE-E (figura 2A). A distinto co-localización de α-actinina (rojo) con los filamentos de actina (verde) que discurren paralelas al borde de ataque era siempre fácilmente evidentes en las células MOSE-E (Figura 3B). En las células MOSE-L, α-actinina apareció en gran parte como tinción difusa en el citoplasma con mucho menos evidente co-localiziation con los filamentos de actina (Figura 3B, rojo). Esto también se observó en células MOSE-I (datos no mostrados). La microscopía confocal se indica α-actinina no co-localizar a los filamentos de actina y actina muy cortos desorganizado encuentran en las células MOSE-L (Figura 3B, imágenes confocal y recuadro).
Además de la agrupación de filamentos de actina, α actos actinina como una plataforma para mediar en la interacción proteína-proteína incluidos los que participan en la formación y el mantenimiento de centros de adherencias [23], [24]. células MOSE tenían niveles variables de productos de genes conocidos por asociarse con o modular las adhesiones focales (tabla 2, Focal adherencias). Además, un número de productos génicos asociar directamente con α-actinina para modular las adhesiones focales (zyxin, vinculina, integrina b1 y b2) o regular de actina (Palladin y syndecan). Los cambios en los niveles de mRNA de varios de estos genes fueron confirmados por qRT-PCR (Tabla 2). Es importante destacar que los genes asociados con la progresión del cáncer (es decir, ITGB2, Itgb5, paxillin, fyn) muestran una mayor expresión, mientras que quienes se cree que suprimir la progresión (es decir, vinculina, gravín) mostraron una disminución de los niveles de expresión en comparación con las células MOSE-E.
Vinculina, que se une actina y es parte del complejo de adhesión focal que une actina para integrinas, exhibió tanto mRNA reducida (Tabla 2) y los niveles de proteína (Figura 2A) durante la progresión maligna. Para visualizar posibles alteraciones en la localización subcelular, se immunostained células MOSE tanto para la F-actina y vinculina (Figura 3C). En las células MOSE-E, vinculina co-localiza en los extremos de los haces de actina, que forman estructuras de adhesión focal bien definidos similar a la observada para las células no transformadas epiteliales. Por el contrario, la tinción vinculina era en gran parte difusa y sólo marginalmente co-localizada con las fibras de actina en las células MOSE-L. Intrínsecamente, las estructuras de adhesión similar focales en células MOSE-L fueron menos definida y más punteada. La microscopía confocal reveló que vinculina se distribuye por todo el citoplasma de las células MOSE-L y no parece que asociar directamente con la actina desorganizado, (Figura 2C, imágenes confocales). Se observaron patrones de tinción similares en el vinculina 90% de la MOSE-I (datos no presentados), lo que sugiere que vinculina aberrante localización subcelular es un evento temprano como células de transición de Mose-E a Mose-I.
El primaria componente de adhesiones focales, FAK, no mostró cambios significativos en los niveles de mRNA durante la progresión MOSE (Tabla 2). Sin embargo, los niveles de proteína FAK fueron significativamente elevados en células -L MOSE-I y en comparación con MOSE-E (figura 2A). Para determinar si hay un cambio en la actividad de FAK y la localización, las células se tiñeron MOSE immunofluorescently para FAK total (rojo) y FAK fosforilados en tyrosine861 (FAK-P
Y861, verde) (Figura 3D). De nota, la fosforilación de FAK en la tirosina Y
861 por Src, uno de los dos residuos fosforilados por Src, contribuye a la migración de células [25], [26]. Como se muestra en la figura 3D, FAK se asoció sólo marginalmente con las membranas de las células MOSE-L en comparación con la tinción punteada brillante en la periferia de la célula de MOSE-E, pero fue más bien distribuye difusamente por todo el citosol. En general, hubo muy poca tinción punteada de la FAK en la periferia de las células MOSE-L. Curiosamente, el periférica total FAK co-localizada con la activa FAK-Y
861, lo que sugiere que la FAK periférica es activo tanto en MOSE-E y las células -L (Figura 3C, fusión). Desde FAK tinción requiere la fijación de MeOH, microscopía confocal no proporcionó resultados concluyentes en cuanto a la co-localización de la FAK difusa total y pFAK-Y
861 observada en las células MOSE-L. Por lo tanto, no está claro si los bolsillos difusas de actina desorganizado y FAK total de contribuir a la reducción de la formación de adherencias focales observados en las células MOSE-L.
citoesqueleto Neoplásicas cambia las vías de transducción de señal influencia
El citoesqueleto desempeña un papel importante en la progresión de las células tumorales y los acontecimientos tales como la migración y la invasión, permitiendo que las células de adaptarse y sobrevivir en diferentes microambientes; compuestos que regulan el citoesqueleto organización se han utilizado como agentes terapéuticos del cáncer [27]. Por otra parte, la organización del citoesqueleto afecta a la organización celular, complejos de adhesión y la polaridad, y transportes vesiculares. Como se señaló anteriormente, la localización subcelular de las proteínas asociadas a las adhesiones focales muestra aberraciones concomitantes con el estado desorganizado del citoesqueleto. Esto puede permitir que las células tumorales para eludir los mecanismos de control homeostático celulares mediante la desviación de las proteínas de señalización a diferentes lugares, cambiando con ello la disponibilidad de socios o sustratos de unión, que pueden modificar las vías de transducción de señales. Desde la señalización aberrante es un signo de malignidad [28], la inmunotinción para tirosina y serina fosforilados proteínas globales se utilizó como un indicador general de la organización vía de transducción de señales y la función.
fosforilación de la tirosina, un indicador del receptor y no actividad de la tirosina quinasa del receptor, juega un papel crítico en células de cáncer, regulación de la proliferación, la diferenciación y el metabolismo;