Extracto
Un paradigma ampliamente aceptado en el campo de la biología del cáncer es que los tumores sólidos son uni-ancestral que se deriva de un único fundador y sus descendientes . Sin embargo, los datos han sido constantemente acumulando que indican principios de tumores en ratones y seres humanos pueden tener un origen multi-ancestral en el que un primogenitor iniciado facilita la transformación de los co-genitores vecino. Hemos desarrollado un nuevo modelo de ratón que permite la determinación de la arquitectura clonal de tumores intestinales
in vivo
y
ex vivo
, han validado este modelo, y luego lo utilizó para evaluar la arquitectura clonal de adenomas , carcinomas y adenocarcinomas, intramucosos invasoras del intestino. El porcentaje de tumores múltiples ancestrales no cambió significativamente a medida que los tumores progresaron de adenomas con displasia de bajo grado [40/65 (62%)], a los adenomas con displasia de alto grado [21/37 (57%)], a intramucoso carcinomas [10/23 (43%]), a adenocarcinomas invasivos [13/19 (68%)], lo que indica que el clon derivado de la primogenitor sigue coexistir con clones derivados de co-genitores. Además, incluso se han observado células neoplásicas a partir de clones distintos dentro de un adenocarcinoma multi-ancestral para invadir simultáneamente en la musculatura subyacente [2/15 (13%)]. Por lo tanto, la heterogeneidad intratumoral derivada temprano en la formación de tumores persiste durante toda la tumorigénesis
Visto:. Zahm CD, Szulczewski JM, Leystra AA, Paul Olson TJ, Clipson L, Albrecht DM, et al. (2016) Los cánceres intestinales Avanzada suelen mantener una arquitectura multi-ancestral. PLoS ONE 11 (2): e0150170. doi: 10.1371 /journal.pone.0150170
Editor: Kwong-Kwok Wong, de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos |
Recibido: 6 Octubre 2015; Aceptado 10 de febrero de 2016; Publicado: 26 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Zahm et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (http://www.cancer.gov/) de los Institutos nacionales de Salud (R01 CA123438 a RBH; P30 CA014520 a la Universidad de Wisconsin Centro de cáncer Carbone; DK058404 P30, modelos preclínicos de Enfermedades digestivas Core, Enfermedades Vanderbilt digestivos Centro de Investigación; P50 CA095013, Patología e Imagen del núcleo, Vanderbilt GI SPORE; K08 CA84146 a ATT; T32 CA009135 a CDZ y AAL, y T32 CA090217 a TJPO) y los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Wisconsin-Madison División de Gastroenterología y Hepatología, Departamento de Medicina y la Escuela de Medicina y Salud Pública de RBH
Conflicto de intereses.: los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
La heterogeneidad de los tumores ha sido reconocida desde hace décadas. Las células neoplásicas en un solo tumor varían en varias propiedades distinguibles incluyendo estado de diferenciación, la tasa de proliferación, potencial metastásico, y la respuesta terapéutica. Históricamente, se han propuesto dos modelos para explicar la heterogeneidad intratumoral. El modelo de evolución clonal afirma que surgen diferentes subclones de un solo progenitor, como consecuencia de cambios moleculares seguido de la selección para microambientes diferentes dentro de un tumor [1]. En contraste, el modelo de cáncer de células madre sostiene que una pequeña población de células madre procedentes de un solo progenitor es responsable del mantenimiento tumor pero la progenie puede diferenciarse en varias maneras diversas [1]. En ambos modelos, dos supuestos clave son que los tumores son uni-ancestral, derivan de un único fundador, y que un subclón con el tiempo se acumulan mutaciones que conducen a la metástasis a otros órganos.
Los datos se han acumulando de manera constante para una tercera modelo de heterogeneidad intratumoral: tumores sólidos puede tener una arquitectura multi-ancestral [2]. Hemos demostrado que los tumores intestinales y hereditarios inducidos por carcinógenos en el ratón de laboratorio se pueden derivar a partir de múltiples fundadores [3, 4]. Nuestros resultados son consistentes con los de otro laboratorio que demuestran que los tumores colorrectales hereditarios y esporádicos en humanos pueden ser multi-ancestral en la arquitectura [5, 6]. Por lo tanto, en contra de un paradigma ampliamente aceptada en el campo de la biología del cáncer, los tumores sólidos pueden tener un origen multifactorial ancestral y en consecuencia ser heterogénea, incluso, ya que sólo se empiezan a formar.
Los estudios iniciales con modelos animales se basaron principalmente en quimeras de agregación. Tales ratones se generaron mediante la fusión de embriones tempranos. Típicamente, un embrión lleva el marcador de linaje Rosa26 que expresa beta-galactosidasa de modo que las células de esta mancha embrión azules en presencia de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, mientras que las células de la otra embrión siendo blanco. Los tumores que son heterotıpica, compuestos por células neoplásicas azul y blanco, tienen un origen multifactorial ancestral. El uso de quimeras de agregación ha proporcionado nuevos conocimientos en las primeras etapas de la tumorigénesis. Por desgracia, esta poderosa herramienta experimental tiene algunas limitaciones significativas. La generación de quimeras de agregación es muy largo y costoso, por lo que el número de animales analizados a menudo es baja. La arquitectura clonal de cualquier tumor se puede determinar solamente después de un largo procedimiento de tinción que incluye dos pasos de fijación y de una incubación durante la noche a 37 ° C. La tinción es a menudo incompleta ya que el sustrato debe difundirse en el tumor; en consecuencia, no todos los tumores pueden ser anotados. Por otra parte, las duras condiciones prohíben cualquier posterior análisis molecular.
En este estudio, hemos desarrollado un nuevo modelo de ratón que permite la arquitectura clonal de tumores intestinales que se determinará
in vivo
y
ex vivo
, validado este modelo, y luego se usa para determinar la arquitectura clonal de los cánceres intestinales. Los resultados apoyan el concepto de que los adenomas tienen un origen multifactorial ancestral y que esta diversidad temprana persiste como tumores benignos transición de una a estado maligno.
Métodos
cepas de ratón y la generación de ratones mosaico
se realizaron
los estudios en animales bajo protocolos aprobados por el Cuidado y uso de Animales Institucional de la Universidad de Wisconsin en el cumplimiento de las políticas establecidas por la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio en los Institutos nacionales de Salud. C57BL /6J (B6), FVB /NJ (FVB), B6.Apc
Min /J ratones que eran heterocigotos para la
Min
alelo de la
adenomatosa coli gen poliposis gratis (
Apc
Min /+), y B6.129 (Cg) -gt (ROSA) 26Sor
tm4 (ACTB-tdTomato, EGFP) Luo /J ratones que eran hemizygous para el mT /reportero mg se obtuvieron del Laboratorio Jackson. FVB /N-Tg
(Fabp1-Cre) 1Jig hemizygous ratones para el transgén Fabp1-Cre en el que el promotor de la proteína de unión de ácidos grasos de rata se fusiona con el gen que codifica la recombinasa Cre, lo que resulta en la expresión mosaico de Cre antes de la finalización de la morfogénesis intestinal, se obtuvieron del Instituto Nacional del cáncer Repositorio Mouse en Frederick. Las poblaciones de estas cepas se mantuvieron mediante cruces entre hermanos y retrocruzamiento con ratones B6 o FVB que se importaron cada quinta generación. Offspring se genotipo utilizando ADN aislado a partir de clips de los pies para la PCR como se describe por los proveedores de los animales.
Un ratón que lleva el
Min
alelo de
Apc
fue identificado en el laboratorio del Dr. William F. Dove en la Universidad de Wisconsin después de la mutagénesis con etilnitrosourea [7, 8]. El fundador y su progenie presentan con los pies pálido debido a la pérdida de sangre a partir de tumores en el intestino [7]. el número de tumores, el crecimiento y la progresión en
Apc
Min /+ ratones dependen de los antecedentes genéticos. B6
Apc
Min /+ ratones desarrollan una media de 100 tumores intestinales y por lo general mueren por 150 días de edad [7]. Los tumores se inició a raíz de la pérdida de actividad de APC en las células epiteliales intestinales poco después del nacimiento y casi siempre son adenomas benignos [9-13]. Por el contrario, (SWRxB6) F1
Apc
Min /+ híbridos desarrollan algunos tumores y típicamente vivir un año o más [14]. Los tumores en estos ratones son cánceres invasivos a menudo que ocasionalmente hacen metástasis en los ganglios linfáticos regionales, presumiblemente debido a la mayor esperanza de vida [14].
ratones experimentales fueron generados por la primera travesía B6
mT /mg
las hembras a B6
Apc
Min /+ machos para generar B6
Apc
Min /+;
mT /mg ratones que después se pasaron a FVB
Fabp1-Cre ratones para generar
(FVBxB6) F1
Apc
Min /+;
Fabp1-Cre
;
mT /mg
híbridos. híbridos F1 experimentales se dejaron envejecer a 150 días o hasta que moribundo para evaluar la arquitectura clonal de tumores en diferentes etapas.
fluorescencia endoscopia
fluorescencia endoscopia se realizó con un sistema de Karl Storz Coloview modificado como descrito anteriormente [15, 16]. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se les dio un enema de PBS caliente para eliminar cualquier material fecal. El endoscopio se inserta aproximadamente cuatro centímetros y luego se retira lentamente utilizando un conjunto de láser de estado sólido bombeado por diodos Optotronics a 437nm con una potencia de 100 mW como fuente de luz. El video se recogió durante todo el procedimiento y las imágenes fijas se capturaron de cada tumor. Los ratones se les permitió despertar después del procedimiento.
Vídeos e imágenes fijas se procesaron con el paquete de Fiji ImageJ para visualizar criptas normales y displásicas que expresan la proteína verde fluorescente.
Imagen de preparaciones completas
Los tractos intestinales se retiraron intactos en la necropsia, se abrieron longitudinalmente, se enjuagaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 4 horas y se almacenó a 4 ° C en 70% de etanol. El intestino delgado, ciego y colon se montaron en 0,4% de agarosa en PBS y la imagen para capturar la fluorescencia roja (mT; tdTomato) y fluorescencia verde (mG; EGFP) utilizando un microscopio Zeiss a 12,5x y o Nikon microscopio de 20 aumentos (véase el archivo S1 para más detalles).
Todo el montaje imágenes utilizadas para el análisis estadístico se obtuvieron en el microscopio Zeiss y se procesaron mediante el paquete de procesamiento de imágenes de Fiji ImageJ [17]. Una macro se utiliza para garantizar la coherencia entre las imágenes. En pocas palabras, la macro buscó un directorio para los archivos de imagen Zeiss (Zvi) y los convierte en Abra de Microscopía Medio Ambiente (OME) tiff (TIFF) utilizando los loci Bio-Formatos importador /exportador de preservar los metadatos [18]. Se completó el siguiente conjunto de funciones con los ajustes de la base de que la proteína fue fotografiada (tdTomato o EGFP): antecedentes resta, el aumento de contraste local (CLAHE), establecido autothreshold, y se convierte a binario. Una vez en el sistema binario, las áreas de la imagen que contiene no tejido se llenaron de color amarillo. El resultado fue una imagen binaria en la que el blanco representa tejido que expresa tdTomato y negro representa tejido que expresa EGFP (Fig S1).
El tamaño de parche análisis
Para evaluar la relación entre la arquitectura y el mosaicismo clonal, rojo y manchas verdes de epitelio intestinal en ratones experimentales se analizaron mediante mapas distancia como se ha descrito anteriormente para quimeras de agregación [3, 4]. En pocas palabras, imágenes binarias planas de cada sección intestinal se convirtieron a distanciarse imágenes de mapas que indican para cada posición de la distancia euclídea al color opuesto más cercana, utilizando el paquete de software EBImage [19]. La distancia mínima media de las medidas de colores opuestos del tamaño de parches de mosaico, que se comparó con tamaños de parche de quimeras de agregación (Fig S2).
reconstrucción 3D de tumores
Algunos adenomas de los ratones sacrificados en 150 días de edad fueron extirpados y ópticamente apagan con 2,2-tiodietanol (TDE) como se ha descrito anteriormente [20]. adenomas despejados se montaron
en bloque
en el 97% se realizó TDE y excitación multifotónica de imágenes en un sistema Prairie Tecnologías Ultima IV de imágenes en loci.
Pilas de imágenes de la Ultima IV fueron cosidos entre sí utilizando el configuración por defecto en la cuadrícula /Colección Costura plug-in para ImageJ que se distribuye como parte del proyecto de Fiji [21]. sustracción de fondo se llevó a cabo en los dos canales utilizando la función de resta fondo ImageJ con un radio de bolas rodantes de 40 píxeles. Cuando mostrando sólo EGFP, se utilizó un umbral para eliminar la autofluorescencia del tejido. El umbral se aplica por igual a todas las áreas de todas las imágenes que se utilizaron en la reconstrucción. Las imágenes fueron luego abrir utilizando el visor de plug-in 3D ImageJ (Mostrar como: volumen, color: Ninguno; Umbral: 0, factor de repetición de muestreo: 1) para generar representaciones en 3D de alta calidad del conjunto de datos OME
La inmunohistoquímica
Todos los tumores extirpados fueron incorporados ya sea en el FSC 22 (Surgipath) y se congelaron rápidamente o se colocan en formalina, procesados e incluidos en parafina. Los bloques se seccionaron en serie y dispuestos como dos secciones de 5μm por diapositiva. Uno de cada diez portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para un análisis más completo, las diapositivas de interés se tiñeron por inmunohistoquímica para CTNNB1 (1: 200 purificada de ratón anti-β-catenina de anticuerpos, BD Transduction Laboratories) usando el kit de HistoMouse Max (Invitrogen) o por inmunofluorescencia para la proteína verde fluorescente (EGFP) o rojo proteína fluorescente (tdTomato) (de primaria 1: 1000 Living Colors EGFP monoclonal Antibody, Clontech, y secundaria- 1: 1000 de cabra anti-ratón de Alexa Fluor 488, Invitrogen, y /o de primaria 1: 200 anti-tdTomato, Rockland y secundaria- 1: 1000 de cabra anti-conejo Alexa Fluor 568, Invitrogen) y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) mediante la aplicación de prolongar oro con medios de montaje DAPI (Molecular Probes). Tenga en cuenta que la tinción para EGFP y tdTomato era necesario porque la fijación apaga la señal fluorescente
inmunofluorescencia
Las secciones histológicas teñidas por inmunofluorescencia fueron imágenes como se describe en la sección de formación de imágenes de todo el montaje.; el único cambio fue el uso de 4x, 5x, 10x o 20x lentes del objetivo. Post-procesamiento de imágenes no era necesario. Las secciones histológicas teñidas por inmunohistoquímica o hematoxilina y eosina (H & amp; E) se obtuvieron imágenes de la misma manera con una fuente de luz halógena y no hay filtros de color
Patología
La patología de cada lesión se evaluó. por dos patólogos certificados por la junta (KAM y MKW) mediante el examen de H & amp; e manchadas diapositivas. Los tumores se clasifican como adenomas con displasia de bajo grado, adenoma con displasia de alto grado, carcinoma intramucoso, o adenocarcinoma invasivo. Los criterios histológicos utilizados para la clasificación de las lesiones se definen como sigue: similar a la observada en los adenomas tubulares humanos, lesiones con displasia de bajo grado hipercromáticos exhibido, núcleos alargados con la estratificación de los núcleos a mitad de camino hacia el aspecto luminal con la mitosis scatted. En la displasia de alto grado, los núcleos hipercromáticos son más grandes, redondeadas y con frecuencia contienen un nucléolo prominente, exhibir estratificación nuclear a la superficie luminal, demostrar arquitectura compleja con espalda con espalda o cribiforme glándulas, y contienen abundantes mitosis (a veces atípico) con áreas de necrosis celular. En los tumores que presentan carcinoma intramucoso, las características nucleares y citológicas son idénticos a la observada con displasia de alto grado, sin embargo, estas lesiones también demuestran la invasión de células neoplásicas más allá de la membrana basal en la lámina propia o la muscularis mucosa y se pueden asociar con una reacción desmoplásico. Para las lesiones para ser clasificados como los adenocarcinomas invasivos, las células neoplásicas deben invadir más allá de la mucosa muscular en al menos la submucosa. La histología de los tumores invasivos puede variar de tal manera que los tumores pueden estar compuestas de células neoplásicas con glándulas bien formadas o láminas de células sin formación de la glándula, sin embargo en todos los casos hay una respuesta desmoplásico asociado.
Secuencia de
Apc
las secciones en parafina fueron preparados para microdisección de captura por láser (LCM) de las regiones de interés mediante la tinción para EGFP usando el kit de HistoMouse Max (Invitrogen) (primaria-1: 1000 Living Colors EGFP anticuerpo monoclonal, Clontech). Las secciones adyacentes se cortaron en láminas de membrana y se tiñeron con azul de metileno. Las regiones de interés fueron removidos a través de LCM con la ayuda de las iniciativas de investigación traslacional en Patología (TRIP) Laboratorio de la Universidad de Wisconsin-Madison. Alternativamente, si los parches eran grandes, se raspó el tejido a mano a partir de diapositivas sin teñir, que contienen secciones incluidas en parafina fijadas con formalina. El ADN genómico se extrajo a partir del tejido aislado utilizando el sistema de purificación automatizada Maxwell 16 con Maxwell 16 FFPE Plus Kit de Purificación de ADN LEV siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). Los cebadores de PCR fueron diseñados para amplificar dos regiones del exón 15 (codones 747-953 y 1285-1513; S1 Tabla) del ratón
Apc
gen, ya que la mayoría de las mutaciones se producen en estas dos regiones [8, 22]. PCR se llevó a cabo durante 35 ciclos. Cada ciclo consistió en 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55 ° C, y 1 minuto a 72 ° C. Todos los procedimientos de amplificación incluyen controles libres de ADN que consiste en el cóctel de amplificación y agua (Promega) libre de nucleasa en lugar del ADN molde. Los cebadores de PCR se utilizaron para la secuenciación. descubrimiento y análisis de la mutación se llevó a cabo utilizando el MSEQ 6.0.1 (Norman Drinkwater, Laboratorio McArdle para la Investigación del Cáncer, Departamento de Oncología de la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin-Madison) y la mutación Surveyor (SoftGenetics) programas.
resultados
Para estudiar la arquitectura clonal de tumores intestinales, hemos generado ratones que llevaban tres elementos genéticos. Las dos primeras eran transgenes que son necesarios para establecer un patrón de mosaicismo en el intestino. Un transgén consiste en el ácido graso rata proteína de unión 1 promotor fusionado al gen que codifica la recombinasa Cre y el otro tiene la
mT /mg
reportero. En las células que no pudieron expresar Cre, proteína fluorescente roja (tdTomato) fue producido exclusivamente a partir de la reportera, incluso durante la tumorigénesis intestinal; en células que expresan Cre a partir de E13.5 día (antes de la finalización de la morfogénesis intestinal y antes de la formación de tumores Min), proteína verde fluorescente (EGFP) se produce exclusivamente como el gen que codifica la tdTomato se ha eliminado después de la recombinación. Por lo tanto, estos dos elementos crean un patrón variado de células que expresan las proteínas fluorescentes rojas o verdes en el intestino delgado distal, ciego y colon (S3 Fig). Este patrón se mantuvo estable en todos los puntos de tiempo evaluados (S5) fig. El tercer elemento era una sola copia de la
Min
alelo de la
poliposis adenomatosa coli gratis (
Apc
) de genes [8]. Esta mutación predispuesto los ratones para el desarrollo espontáneo de tumores en todo el intestino delgado y colon. Puesto que el estado reportero se determina antes de tumores conformación y expresión Cre es estable durante la tumorigénesis, los tumores que consisten en una mezcla de células neoplásicas rojos y verdes tienen una arquitectura multi-ancestral.
Para caracterizar la tumorigénesis intestinal en este modelo, una cohorte de 20 ratones se generó y se practicó la eutanasia a los 150 días de edad. La incidencia de tumores intestinales fue del 100% con una multiplicidad promedio de 11 ± 5. Se esperaba una baja carga de tumor debido a los antecedentes genéticos F1 homogénea y era altamente deseable, ya que limita la posibilidad de dos tumores iniciados independientemente de coalescencia, como consecuencia de la proximidad [23]. Todos los tumores de este grupo de ratones que fueron analizadas fueron adenomas con displasia de bajo grado.
Muchos de los adenomas en estos ratones tenían una arquitectura multi-ancestral. La composición de los tumores de colon fue evidente
in vivo fotos: por endoscopia de fluorescencia (Figura 1A) y
ex vivo utilizando microscopía de fluorescencia (Figura 1B). De los 63 tumores en el intestino delgado y el colon distal, se confirmaron 32 (51%) que se compone de células neoplásicas rojo y verde por histología (Tabla 1 y Fig 1C-1F). Características de la transformación de mucosa normal a la neoplasia /displasia fueron la pérdida de la arquitectura cripta, el agotamiento de mucina de la superficie, y el aumento de la mitosis, así como los cambios nucleares asociados incluyendo el hacinamiento, la estratificación, la elongación y hyperchromasia. Además, las células rojas y verdes displásicas tenían un nivel elevado de CTNNB1 (β-catenina) y, a menudo esta proteína se localizó en el núcleo de confirmar que las células de los dos linajes eran neoplásica (Fig 1C-1F). Por último, los clones neoplásicas rojas y verdes a menudo llevan mutaciones únicas en
Apc
(Tabla 2 y Fig S4), lo que indica además que estos clones se derivan de diferentes fundadores. Por lo tanto, este innovador modelo de ratón es muy adecuado para el estudio de la arquitectura clonal de tumores intestinales. Además, una ventaja importante de este modelo es que la visualización de los diferentes linajes no impide el análisis moleculares, incluyendo inmunohistoquímica y la secuenciación del ADN.
La arquitectura clónica de los tumores de colon es visible
in vivo usando fluorescencia
endoscopia. El epitelio intestinal es una sola capa de células que se sustituye cada tres a cinco días. Las nuevas células se producen a partir de células madre se extiende cerca de la base de la cada cripta. En nuestro modelo, criptas son de color verde o rojo homotipica homotipica siendo este último particularmente evidente durante la endoscopia de fluorescencia, ya que cada cripta aparece como un círculo verde discreto (A). Los tumores pueden estar formadas sólo por criptas rojos (panel izquierdo), una mezcla de criptas rojo y verde (panel central), o sólo criptas verdes (panel derecho). Los tumores se resumen en blanco. La alta variabilidad en la arquitectura clonal es también evidente en su conjunto se monta (B). Los tumores eran de color rojo homotipica (panel izquierdo), heterotıpica (media de tres paneles), o verde homotipica (panel derecho). La mezcla de criptas rojo y verde varía entre los tumores múltiples ancestrales, con un poco de ser compuesto principalmente de cualquiera de las criptas rojos o verdes criptas, mientras que otros son más o menos la misma cantidad de ambos tipos. La histología es necesario determinar la arquitectura, como tumores pueden aparecer heterotípicos con criptas neoplásicas de un color entremezclados con criptas normales de otro color. La arquitectura clónica de los tumores se obtuvo a partir de secciones histológicas. Las células neoplásicas se visualizaron después de H & amp; E tinción (C) con altos niveles de CTNNB1 (β-catenina) la expresión en el citoplasma y el núcleo (D, mancha marrón). Como se muestra en una sección cercana del mismo tumor teñido por inmunofluorescencia, las células neoplásicas en un solo tumor a menudo surgen de los dos linajes de células rojas y verdes (E-F). Panel B fotos se muestran con la misma ampliación; Tamaño de la barra = 1 mm. Paneles C y E se muestran con la misma ampliación; bar size = 500μm. El panel D muestra una ampliación 4x en una sección adyacente del área mostrada en el panel C. Panel F muestra una ampliación 4x del área mostrada en el panel de E.
El porcentaje de tumores multi-ancestrales en mosaicos fue similar al porcentaje observado en estudios anteriores con quimeras de agregación (S2 Fig; 40-52% en mosaicos frente a 22 a 47% en quimeras de agregación). Este hallazgo muy probablemente refleja el hecho de que el mosaico de glóbulos rojos y verdes en el intestino delgado y el colon de los ratones nuestra mosaico distal era comparable con el mosaico de células azules y blancas observadas en quimeras de agregación en estudios previos (S2) Fig. Todos los 165 tumores en el intestino delgado proximal eran de color rojo homotípica (Tabla 1), como la unión del ácido graso rata proteína 1 promotor apenas se expresa en esta región del tracto intestinal (S3 Fig). Esta observación indica que la expresión de las proteínas fluorescentes de la reportero es estable durante la tumorigénesis. Debido a la tumorigénesis no conduce a la activación de Cre o mutaciones en el reportero, los tumores pueden ser heterotípicos precisión determinada a tener un origen multi-ancestral. Este enfoque general se puede aplicar para estudiar la arquitectura clonal de los tumores en otros tejidos, lo que requiere sólo el uso de un transgén diferente que expresa Cre recombinasa.
La arquitectura multi-ancestral de los tumores se confirmó a través de formación de imágenes. Se aislaron un total de cinco adenomas múltiples ancestrales, suspendido en TDE como el medio de montaje para reducir la dispersión de los lípidos, y la imagen con un microscopio multifotónica. Para cada adenoma, las imágenes recogidas se cosen juntos para generar una reconstrucción tridimensional. Estos datos indican que algunos tumores pueden ser más complejo que la simple biclonal; el número de regiones de color discretos varió de dos a cuatro (S2 Tabla). En un adenoma predominantemente rojo, tres zonas verdes separadas podrían ser vistos, lo que indica que este tumor se podría derivar de cuatro fundadores si cada clon surgió de un suceso iniciador único (Fig 2). Sin embargo, la preparación para la imagen que nos impedía ser capaz de realizar los estudios de secuenciación que nos permitan determinar si los parches verdes separadas tenían diferentes perfiles de mutación, que proporcionarían una prueba más de sus orígenes.
La expresión de proteínas fluorescentes facilita el uso de imágenes multifotónica de excitación para reconstruir el tumor en tres dimensiones reconstrucciones permiten la exploración de la estructura por debajo de la superficie de los tumores (a, superficie; B, vista lateral) sin distorsiones y artefactos que se producen cuando la formación de imágenes múltiples secciones histológicas. Cuatro áreas de color diferenciadas fueron evidentes en un tumor. Tres áreas verdes discretas fueron evidentes cuando el rojo se restó (C). Estas áreas de color verde fueron separados por al menos 100 micras, que es equivalente al diámetro de 1 a 2 criptas.
La arquitectura multi-ancestral persiste como tumores progresan de benigno a maligno estados. Una segunda cohorte de ratones se generó y se dejó envejecer hasta moribundo. La edad promedio de muerte fue de 494 ± 93 días. La incidencia de tumores intestinales fue del 100% con una multiplicidad promedio de 15 ± 5, que era ligeramente mayor que la observada en los ratones sacrificados a los 150 días de edad (p = 0,04; Wilcoxon rango suma, de dos caras). En los ratones moribundos, 16% de los tumores en el intestino delgado y el colon distal fueron carcinomas intramucosos y 13% eran adenocarcinomas invasivos (Tabla 3). De manera similar a la observada en lesiones colorrectales humanos, carcinomas intramucosos exhiben invasión de células neoplásicas, ya sea en la lámina propia o la mucosa muscular y pueden estar asociados con una respuesta desmoplásico (Fig 3). Tenga en cuenta que un estudio previo demostró que los ratones de larga vida Min desarrollan la enfermedad avanzada a pesar de que los tumores mostraron poco inestabilidad genética [14]. Para una lesión que se considera un adenocarcinoma invasor tenía que haber invasión de las células neoplásicas más allá de la mucosa muscular, al menos, en la submucosa. Las células neoplásicas eran a menudo columnar en apariencia con nucleolos prominentes, tenía una arquitectura cribiforme con glándulas de regreso a la espalda sin intervenir estroma, granular eosinofílica restos de cariorrexis presente dentro del lumen de la glándula, el aumento de la actividad mitótica y se asocia con una respuesta desmoplásico. Se observó una arquitectura multi-ancestral en el 62% de los adenomas con displasia de bajo grado, el 57% de los adenomas con displasia de alto grado, el 43% de los carcinomas intramucosos, y el 68% de los adenocarcinomas invasivos (Tabla 3).
En los ratones que fueron dejó envejecer hasta moribunda, algunos tumores eran adenomas con displasia de alto grado (a y B), mientras que otros eran carcinomas intramucosos (CF). Las células neoplásicas identificados en H & amp; E secciones teñidas (A, C y D) eran una mezcla de ambas células rojas y verdes (B, E y F). Los paneles A y B se muestran con la misma ampliación; Tamaño de la barra = 1 mm. Paneles C y E son misma ampliación; Tamaño de la barra = 1 mm. Paneles D y F son ampliaciones de 4x de la zona se describe en C.
Las células malignas que invaden la submucosa y muscular propia, incluso se pueden derivar de diferentes fundadores. Se analizaron un total de 15 adenocarcinomas invasivos de 10 ratones. se observó invasión simultánea de células neoplásicas rojo y verde en el 13%. Esta observación indica que pueden persistir incluso las interacciones entre los clones como los tumores comienzan a invadir a partir de la submucosa en la muscular propia.
Discusión
Hemos generado un nuevo modelo de ratón de cáncer colorrectal, realizó estudios de validación de comparar nuestros resultados con modelos experimentales anteriores, y luego se utiliza el modelo para estudiar la arquitectura clonal de los cánceres malignos en el intestino. Los resultados no sólo indican que los cánceres se componen de células derivadas de múltiples fundadores pero que las células de distintos orígenes pueden invadir simultáneamente en la musculatura de la pared del colon. Este descubrimiento es contrario a la idea de que todos los tumores sólidos son uni-ancestral y que una sola subclón finalmente adquiere una ventaja selectiva a través de alteraciones epigenéticas o mutaciones y, en consecuencia metástasis del tumor primario a sitios distantes
.
Nuestro modelo era validado utilizando varios enfoques diferentes. Se seleccionó el transgén Fabp1-Cre porque se expresa de manera estable en el intestino delgado distal, el ciego y el colon durante la embriogénesis [24, 25] y antes de la tumorigénesis se produce en el ratón Min. De acuerdo con esta afirmación, las criptas en el intestino normal, eran o totalmente rojo en la ausencia de expresión de Cre o totalmente verde en presencia de la expresión de Cre. Por otra parte, el patrón de mosaicismo es similar en ratones sacrificados a los 150 días de edad y los sacrificados por encontrarse moribundos, lo que indica que la tendencia establecida durante la embriogénesis temprana es estable en ratones adultos (Fig S5, S6 higo, y la Tabla S3). Si Cre se activó de forma espontánea en diferentes células, el intestino se volvería cada vez más verde como los ratones de edad porque las células verdes no pueden ser convertidos de nuevo en rojo. En ambos grupos de ratones, la mitad proximal del tracto intestinal era casi completamente rojo, mientras que la media distal era una mezcla de rojo y verde con el colon se compone de células verdes 37,6% en los ratones sacrificados en 150 días y 38,1% de células verdes en ratones sacrificados por encontrarse moribundos (p = 0,46, t-test). Todos los 165 tumores que se formaron en el medio proximal del intestino delgado y 24 de 63 tumores en el colon y el medio distal del intestino delgado estaban rojos homotípica (Tabla 1). Esta observación indica que Fabp1-Cre transgén no se activa de forma aberrante como consecuencia de la transformación neoplásica. Otros tumores en la mitad distal del tracto intestinal eran verdes homotípica o heterotípica. El porcentaje de heterotípicos, o abiertamente multi-ancestrales, tumores fue similar a la observada en estudios anteriores en los que se emplearon quimeras de agregación (S2 FIG). El patrón de clones neoplásicos rojas y verdes en un solo tumor varía dramáticamente con rojo y verde están altamente entremezclados en algunos tumores (Figura 1B). Tales mezclas complejas serían difíciles de explicar por la expresión del transgén indeterminado Fabp1-Cre dentro de un único clon.