Extracto
El tratamiento del cáncer, tales como oligonucleótidos o péptidos requiere sistemas de entrega eficientes. Un nuevo péptido, TMTP1, derivado previamente e identificado en nuestro laboratorio mostró una notable capacidad de dirigirse a los tumores altamente metastáticos tanto
in vitro e in vivo
, incluso en la etapa temprana de focos de metástasis ocultas. TMTP1 inhibió moderadamente la viabilidad de células tumorales, aunque no lo suficiente para determinar si es un asesino eficiente de las células tumorales. En este estudio, hemos tratado de potenciar la actividad antitumoral de TMTP1. Para ello, hemos fusionado a un péptido antimicrobiano,
D (klaklak)
2, y ha dado en llamar el péptido resultante TMTP1-DKK. Se encontró que TMTP1-DKK podría desencadenar la apoptosis rápida en la próstata humana y células de cáncer gástrico a través tanto de la vía mitocondrial de la apoptosis inducida por la vía del receptor y la muerte. Por otra parte, la inyección directa de TMTP1-DKK en ratones con xenoinjertos de cáncer de próstata y gástrico resultó en una reducción de los volúmenes de tumor y un retraso significativo en la progresión tumoral y la metástasis
in vivo
. Estos resultados sugieren que TMTP1-DKK puede servir como un agente terapéutico potente para tumores metastásicos
Visto:. Ma X, Xi L, Luo D, Liu R, Li S, Liu Y, et al. (2012) Los efectos antitumorales del péptido TMTP1-GG-
D (klaklak)
2 en cánceres altamente metastásicas. PLoS ONE 7 (9): e42685. doi: 10.1371 /journal.pone.0042685
Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 5 Febrero 2012; Aceptado: 11 Julio 2012; Publicado: 11 Septiembre 2012
Copyright: © Ma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No.30973472; 81001006; 30973148), el programa de Medicina gran innovación (2009ZX09103-738; 2009ZX09103-739; 2009ZX09103-740), y el programa "973" de China (Nº 2009CB521808). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mayoría de la mortalidad asociada a cáncer se debe a la metástasis de las células tumorales originales a sitios distantes del tumor inicial o primaria. Actualmente las opciones de tratamiento disponibles rara vez son capaces de curar cánceres metastásicos, tales como los arised de próstata y cáncer gástrico. A nivel mundial, el cáncer de próstata es la neoplasia maligna más común en los hombres y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer. El cáncer gástrico sigue siendo una de las neoplasias más frecuentes, causando el 12% de todas las muertes relacionadas con el cáncer cada año [1], [2], [3]. Además, el tratamiento clínico de estos tumores sólidos sigue siendo relativamente ineficaz. Por lo tanto, la detección y el tratamiento de la metástasis tumoral, metástasis especialmente ocultas, ha sido el enfoque principal de las terapias del cáncer desarrolladas recientemente. Los últimos años de investigación sobre el cáncer ha proporcionado una visión de los procesos responsables del crecimiento del cáncer y identificado numerosos objetivos moleculares para una posible terapia para el cáncer [4], [5]. Sin embargo, el procedimiento de autorización de nuevas terapias contra el cáncer es largo. La esperanza es que por la orientación alteraciones específicas en las células cancerosas en la primera etapa de la metástasis, las terapias pueden ser desarrollados para ser más eficaz en matar las células tumorales
in situ
y focos de metástasis, mientras que menos perjudicial para las células normales. Como resultado, estas terapias innovadoras harían un gran impacto positivo en la supervivencia y la calidad de vida de pacientes con cáncer
.
Durante la última década, el campo del desarrollo de fármacos contra el cáncer se ha transformado con la identificación molecular específico de objetivos [6], [7], [8]. la terapia génica dirigida puede lograrse mediante una variedad de técnicas que incluyen la terapia génica y la transcripción de genes. ventajas recientes en la administración dirigida incluyen el uso exitoso de inhibidores moleculares pequeños, anticuerpos monoclonales, y péptidos dirigidos cortos [9], [10]. El desarrollo de péptidos dirigidos cortos parece ser una vía prometedora para el éxito de la terapia génica dirigida. péptidos dirigidos cortas tienen una excelente penetrabilidad del tejido y la toxicidad e inmunogenicidad mínima, haciéndolos aptos para la aceptación por los pacientes y los médicos.
Recientemente, hemos identificado un péptido de ácido 5-amino, TMTP1, que une a una serie de altamente metastásico líneas celulares de cáncer de
in vitro
y
in vivo
, en particular los de hígado micrometasteses atípicos que contenía pequeñas cantidades de células neoplásicas [11]. Sin embargo, no reconoció TMTP1 líneas celulares normales y no metastásicos. También se encontró que las altas concentraciones de TMTP1 podrían mediar la apoptosis de células tumorales. Desde TMTP1 obligado a cánceres metastásicos con alta especificidad, podría ser útil como una herramienta de diagnóstico y /o tienen la función citotóxica. Específicamente, TMTP1 podría ser utilizado en la construcción de
de novo
conjugados de péptidos personalizables. Estos péptidos se pueden personalizar para diversas aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a través de la conjunción para una amplia gama de agentes tales como los virus, las proteínas y péptidos antimicrobianos de orientación. En este estudio, nos acoplamos TMTP1 a un péptido antimicrobiano catiónico conocido por su fuerte actividad citotóxica con el fin de mejorar sus efectos anti-tumorales.
Hay más de 100 péptidos de origen natural a los antibióticos y su
de novo
diseño ha recibido mucha atención [12], [13], [14], [15], [16]. Ellerby et
al
[17] encontró que cuando se conjugan un péptido antimicrobiano catiónico,
D (klaklak)
2, el dominio homing CNGRC, el péptido resultante tenía actividad anti-tumor a través de su capacidad de dirigirse a las mitocondrias y desencadenar la apoptosis. Estos y otros péptidos antibióticos pro-apoptóticos estructuralmente similares se mantienen relativamente no tóxico exterior de las células eucariotas. Sin embargo, una vez absorbido por las células tumorales, que inducen la inflamación mitocondrial y la apoptosis dependiente de la mitocondria [18], [19], [20]. Sin embargo, un problema importante con estos péptidos es asegurar su introducción en las células. Por lo tanto, estos péptidos tienen que ser acoplados a péptidos dirigidos tumorales que permiten la internalización mediada por receptor. Esto asegura que el péptido quimérico entrará en el citosol de las células diana en las que puede inducir la apoptosis mitocondrial dependiente.
En este estudio, hemos fusionado
D (klaklak)
2 a TMTP1 por fase sólida la síntesis de péptidos en un modelo automatizado de Applied Biosystems y nombrado el péptido resultante TMTP1-DKK [11]. La hipótesis de que el péptido TMTP1 permitiría una focalización mientras que
D (klaklak)
2 promovería mitocondrias inducida por la apoptosis. En este estudio, se evaluó la notable especificidad y capacidad antitumoral de TMTP1-DKK en tumores metastásicos
in vitro
y
in vivo
.
Resultados
TMTP1-DKK hogares a las células tumorales altamente metastásicas in vitro e in vivo
Hemos demostrado previamente que TMTP1 se une específicamente a las células tumorales metastásicas [11]. Para determinar si el péptido TMTP1-DKK recién sintetizado conserva la especificidad de unión de su dominio de dirección, TMTP1, conjugamos TMTP1-DKK con FITC. A continuación, examinó la unión de FITC-conjugado TMTP1-DKK a varias líneas celulares de cáncer y las células normales
in vitro
y
in vivo
. Conjugado con FITC-TMTP1 DKK une específicamente a la línea celular de cáncer de próstata metastásico altamente PC-3M-1E8 y la línea celular de cáncer gástrico MKN-45sci (Figura 1 A, A y C,). Sin embargo, TMTP1-DKK no se dirigen a las células de la línea celular no metastásico PC-3M-2B4, la línea celular de fibroblastos murinos NIH /3T3, lo normal de células epiteliales mamarias MCF-10A, LO2 celular normal del hígado y las células HEK293 (Figura 1A, B , D y B).
Un imágenes fluorescentes de las células tumorales tratadas con TMTP1-DKK se examinaron con microscopía de escaneo láser confocal. (A) células PC-3M-1E8 (b) las células PC-3M-2B4 (c) las células MKN-45sci (d) células NIH /3T3. FITC-TMTP1-DKK (verde) y el péptido de control se examinaron en los tumores de xenoinjertos, incluyendo PC-3M-1E8 (e) TMTP1-DKK, (f) svTMTP1-DKK, MKN-45sci (g) TMTP1-DKK, (h) svTMTP1 -DKK. Los núcleos se co-manchadas con DAPI (azul). B imágenes fluorescentes de las células nomal (células MCF-10A, LO2 normales del epitelio mamario normal de las células del hígado y las células HEK293) tratados con TMTP1-DKK se examinaron con microscopía de escaneo láser confocal. El cambio morfológico de las células nomal se visualizó usando microscopio invertido.
A continuación trató de determinar si TMTP1-DKK une a estas células tumorales altamente metastásicas
in vivo
. Para este propósito, PC-3M-1E8 y las células MKN-45sci se inyectaron por vía subcutánea en ratones BALB /c ratones desnudos. Los ratones con tumores de 1-1,5 cm de diámetro fueron inyectados con 300 mg de péptido FITC-TMTP1-DKK a través de la vena de la cola. Después de 24 horas, los tumores y los órganos de control fueron extirpados y se procesaron para seccionamiento congelado. Detectamos la biodistribución dinámica del conjugado con FITC TMTP1-DKK desde al 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, y 48 h en los modelos de ratón de cáncer gástrico ortotópico MKN-45sci y el cáncer de próstata subcutánea PC-3M-1E8 por confocal microscopía. TMTP1-DKK se detectó en altamente metastásico PC-3M-1E8 y los tejidos tumorales de xenoinjerto MKN-45sci (Figura 1A, E y G). Por microscopía confocal mostró que TMTP1-DKK podría persistir en un nivel superior durante 48 h en los modelos de ratón de cáncer gástrico ortotópico MKN-45sci y cáncer de próstata subcutáneo PC-3M-1E8 (Figura S1). Que podría indicaron que el péptido podía estable en el tejido tumoral. Sin embargo, la fluorescencia no se detectó en los órganos y tejidos de control. El ensayo homing con el péptido control, svTMTP1-DKK, no mostró ninguna tinción de fluorescencia obvia en PC-3M-1E8 y MKN-45sci tejido tumoral de xenotrasplante o tejidos normales (Figura 1A, f y h, Figura S2,).
TMTP1-DKK inhibe la proliferación e induce la apoptosis en las células cancerosas altamente metastásicas
a continuación trató de determinar si TMTP1-DKK puede inhibir la proliferación de células cancerosas altamente metastásicas. Para probar esto, PC-3M-1E8, MKN-45sci, y células NIH /3T3 se trataron con diversas concentraciones (1-20 mM) de TMTP1-DKK y péptidos de control para 24 h. Las tasas de crecimiento de las células se midieron mediante el ensayo de MTT. TMTP1-DKK inhibió la proliferación celular de PC-3M-1E8 y las células MKN-45sci de una manera dependiente de la dosis con la inhibición máxima se produce a una dosis de 15 a 20 M de TMTP1-DKK (Figura 2A y B
P
& lt;. 0.01 Adicionalmente, la tasa de inhibición por TMTP1 era mucho menor que por TMTP1-DKK (Figura 2A y B,
P
& lt; 0,01). la inhibición de la proliferación de fibroblastos murinos NIH /3T3 no se detectó (Figura 2C). y svTMTP1-DKK no mostró efectos sobre la próstata y células de cáncer gástrico (Figura 2D, F).
las tasas de supervivencia de células se determinó por ensayos de MTT realizados por triplicado (
barras de error
, ± SD). los datos presentados representan el porcentaje de células supervivientes en comparación con las células no tratadas. los resultados representativos se muestran. las diferencias de las tasas de supervivencia de entre 10 mM y 20 mM TMTP1-DKK son más significativos en cualquiera de PC- 3M-1E8 o células MKN-45sci (
P
& lt; 0,01). sin embargo, poco o ningún efecto se observó en fibroblastos de murino proliferación de células NIH /3T3 cuando fueron tratados con TMTP1-DKK. D Las células viabilidad de las células de cáncer de PC-3M-1E8 MKN-45 y se trató diferentes concentraciones (0-20 mM) de svTMTP1-DKK por 24 horas se midió por el ensayo MTT. E cuantificación morfológica de apoptosis celular por microscopio invertido en el PC-3M-1E8 y las células MKN-45sci tratados con 10 mM TMTP1-DKK. Después se trató con DKK, las células mostraron contracción celular, desintegración de la membrana, y la condensación /fragmentación nuclear. Poco cambio morfológico F fue observado por el microscopio invertido en el PC-3M-1E8 y MKN-45sci trató con 10 mM svTMTP1-DKK por 24 horas.
Es posible que TMTP1-DKK restringido mediante la inducción de la proliferación apoptosis en las células cancerosas altamente metastásicas. Para probar esto, PC-3M-1E8, las células MKN-45sci, normal de las células epiteliales mamarias MCF-10A, LO2 células del hígado normal y las células HEK293 fueron tratadas con 10 mM TMTP1-DKK y svTMTP1-DKK por 24 h. No se observaron cambios morfológicos en alguna de las células bajo el microscopio de contraste de fase. Tarifas de las tasas de apoptosis se determinó por FACS utilizando FITC-anexina V y tinción con yoduro de propidio. PC-3M-1E8 y las células MKN-45sci tratados con TMTP1-DKK mostraron contracción celular, desintegración de la membrana, y la condensación /fragmentación nuclear (Figura 2E), que son todos los cambios morfológicos característicos de las células sometidas a apoptosis. Mientras TMTP1-DKK no afectó la viabilidad y la morfología de estas células normales en virtud de contraste de fase microscopio (Figura 1B). análisis FACS indicó también que TMTP1-DKK indujo apoptosis de las células de una manera dependiente de la dosis a dosis de 10 mM o superior, en comparación con el control (Figura 3A y C).
Las células se trataron durante la noche con 10 mM TMTP1- DKK péptido y después se analizó por citometría de flujo a las 12 h, 24 h, y 48 h. La proliferación de las células PC-3M-1E8 y células MKN-45sci tratados con péptido TMTP1-DKK (barras rellenas) mostraron una disminución de la viabilidad a través de la apoptosis en el tiempo (
P
& lt; 0,01). Sin embargo, los fibroblastos murinos NIH /3T3 no mostraron cambios significativos. B moléculas de señalización implicadas en la apoptosis efecto del péptido TMTP1-DKK tratada. Las células cultivadas tratadas con 10 mM de péptido TMTP1-DKK por 24 h se recogieron y se lisaron. proteínas celulares totales se resolvieron por 12% elctrophoresis gel SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear con 5% de leche sin grasa, las membranas se incubaron durante 1 h con 1 g /anticuerpos ml primarios (caspasa 9 (35 KD, 17 KD), caspasa 8 (20 KD) y la caspasa 3 (19 KD)) seguido de rábano picante anticuerpos anti-conejo conjugado con peroxidasa secundaria. Las transferencias se expusieron a sustrato de quimioluminiscencia y se desarrollaron con Hyperfilm MP. C células PC-3M-1E8 y células MKN-45sci fueron desafiados con 10 mM TMTP1-DKK en presencia (+) de 40 mM Z-VAD-fmk durante 24 h. Después de 24 horas, se analizó la viabilidad celular. El inhibidor de amplio rango de caspasas Z-VAD-FMK disminuyó la tasa de apoptosis de las células PC-3 M-1E8 y MKN-45sci.
TMTP1-DKK activa ambas vías de la apoptosis mitocondrial y Fas-dependientes
D (klaklak)
2 es un péptido de D-aminoácido anfipático que se une selectivamente a bacterias, pero no eucariota, las membranas celulares [9]. En eucariotas, se inicia la apoptosis a través de la interrupción de la mitocondria, presumiblemente ya que las membranas de las mitocondrias parecen a los de bacterias [10]. Hay dos grandes vías de señalización de la apoptosis: la vía del receptor de muerte Fas extracelular y la vía mitocondrial intracelular. Para identificar la ruta apoptótica provocada por el tratamiento TMTP1-DKK en el PC-3M-1E8 y las células MKN-45sci, hemos examinado la expresión de la caspasa-3, 8, y 9 por el Western Blot. Se detectaron bandas correspondientes a: la caspasa 3 activa (19 kDa), la caspasa 8 (20 kDa), y la caspasa 9 (17 kDa y 35 kDa dos bandas). Así, en TMTP1-DKK tratado las células cancerosas, la escisión de las caspasas 3, 8 y 9 fueron todos detectar. Esto indicó que tanto la vía del receptor de muerte Fas y la vía mitocondrial fueron activadas por TMTP1-DKK (Figura 3B).
A fin de validar que TMTP1-DKK promovido la apoptosis, hemos probado si los inhibidores de caspasas podrían disminuir la TMTP1- DKK tasa de apoptosis inducida en PC-3M-1E8 y líneas de células MKN-45sci. El inhibidor de amplio rango de caspasas Z-VAD-FMK podría disminuir la tasa de apoptosis de los tratados con TMTP1-DKK PC-3 M-1E8 y las células MKN-45sci del 45,2 ± 2,3% a 22,1 ± 1,3% y el 53,7 ± 2,6% a 25 ± 0,8 % respectivamente (Figura 3C). Estos resultados sugieren que TMTP1-DKK induce la apoptosis a través tanto de la vía mitocondrial intracelular y la vía del receptor de muerte Fas.
TMTP1-DKK inhibe la invasión de tumor
in vitro
Para examinar si TMTP1-DKK células afectadas invasión, PC-3M-1E8 y las células MKN-45sci fueron tratados con TMTP1-DKK o agua de filtro estéril durante 12 h, después el que la invasión de células se determinó mediante un ensayo de invasión de matrigel (Figura 4A) . La tasa de migración celular de las células PC-3M-1E8 redujo en 52,38 ± 3,3% cuando las células se trataron con 2 M de péptido TMTP1-DKK. Del mismo modo, la migración celular de las células MKN-45sci disminuyó en 46,16 ± 2,7% en las mismas condiciones (Figura 4B).
Las células fueron incubadas con 2 mM TMTP1-DKK péptido de 12 h. Se llevaron a cabo los ensayos de migración transwell de células PC-3M-1E8 y células MKN-45sci. Después de 24 h de incubación, se eliminaron las células de la parte superior del filtro y las células de la superficie inferior del filtro se fijaron y se tiñeron. Los datos son las medias ± SE de tres experimentos independientes; cada uno realizado por triplicado. migración celular B se redujo en 52,38 ± 3,3% en las células PC-3M-1E8 y 46,16 ± 2,7% en las células MKN-45sci en comparación con los controles apropiados.
TMTP1-DKK inhibe el crecimiento tumoral y el desarrollo
in vivo
a continuación trató de explorar si TMTP1 péptido-DKK podría representar una posible estrategia terapéutica para suprimir el crecimiento tumoral
in vivo
. Para probar esto, se analizó el efecto de TMTP1-DKK en el crecimiento de los tumores subcutáneos en ratones. MKN-45sci cáncer gástrico ortotópico y las células de cáncer de próstata PC-3M-1E8 se inyectaron por vía subcutánea en ratones que fueron tratados a continuación con 50 mM TMTP1-DKK, TMTP1 o agua filtro estéril a través de inyección intraperitoneal (IP) cada dos días. ratones portadores de tumores PC-3M-1E8 tratados con TMTP1-DKK mostraron un aumento en la tasa de supervivencia de 55 días (rango de 49 a 58 días) a 65 días (rango de 60 a 69 días) en comparación con los grupos control. Mientras tanto, el tiempo de supervivencia de ratones portadores de tumores MKN-45sci aumentó de 35 días (rango de 29 a 39 días) a 42 días (rango de 35 a 44 días) cuando se tratan con TMTP1-DKK.
TMTP1 tratamiento -DKK también el crecimiento del tumor marcadamente inhibida en PC-3M-1E8 cáncer de próstata subcutáneo y ratones de cáncer gástrico teniendo ortotópico MKN-45sci. El volumen medio de los dos tipos de tumores de xenoinjertos encogido en el grupo relativo TMTP1-DKK tratada para controlar (Figura 5B, C). Cuarenta días después de la inyección, el volumen de los tumores de xenoinjerto de cáncer de próstata subcutáneo PC-3M-1E8 fue en promedio de 18% de la de control en el TMTP1-DKK ratones tratados (Figura 5D). Además, se investigó si el péptido TMTP1-DKK apoptosis inducida en el xenoinjerto de tumores de próstata
in vivo fotos: por ensayo de TUNEL. El número de células apoptóticas observadas aumentó en TMTP1-DKK grupo tratado péptido relación con el control. Por lo tanto, estos resultados muestran un efecto antitumoral del péptido vigorosa TMTP1-DKK
in vivo
.
Los ratones tratados con péptido TMTP1-DKK sobrevivieron más tiempo que los ratones control tratados con una mezcla equimolar de péptido TMTP1 o agua de filtro estéril, como se muestra por una parcela de supervivencia de Kaplan-Meier. B, C PC-3M-1E8 cáncer de próstata y cáncer gástrico ortotópico MKN-45sci tratados con péptido TMTP1-DKK eran más pequeños que los tratados con el péptido de control. El crecimiento del tumor D en ratones portadores de tumor PC-3M-1E8 se somete a terapia péptido TMTP1-DKK. Los ratones fueron tratados durante un período de 40 días (
n
= 9). Durante el período de tratamiento, los tumores se midieron dos veces a la semana. Tumores de volumen en los ratones tratados con el péptido TMTP1-DKK fue en promedio de 18% del tamaño de control. Los volúmenes tumorales se evaluaron en el día 1 (○) y el día 40 (•). P & lt; 0,05, prueba t. E Los animales se sacrificaron seis días después del tratamiento TMTP1-DKK. El tumor se recuperó y la imagen inmediatamente después de análisis de la muerte celular por apoptosis mediante el ensayo TUNEL. El número de células apoptóticas aumentó notablemente en TMTP1-DKK tumores tratados con péptido. una, Magnificación: × 100. b Ampliación:. × 200
TMTP1-DKK suprime la metástasis tumoral y la progresión de xenoinjertos ortotópico MKN-45sci en ratones atímicos
Para probar si TMTP1-DKK puede disminuir la metástasis
in vivo, se examinaron los efectos de este péptido en un modelo de metástasis. implantación ortotópico de fragmentos de cáncer gástrico MKN-45sci humanos en el estómago de los seis ratones nude causó un aumento significativo en el número de los tejidos metastásicos, incluyendo cuatro metástasis de hígado, dos metástasis bazo, tres metástasis pared abdominal, una metástasis de riñón, y dos linfático mesentérico metástasis en los ganglios (uno ratones de control murieron dentro de los 16 días de la implantación). Sin embargo, la administración IP de TMTP1-DKK cada dos días durante 20 días causó una disminución dramática y dependiente de la dosis en el número de los tejidos metastásicos, sin metástasis observándose en seis TMTP1-DKK tratada ratones desnudos (Figura 6A, C). Además, H & amp; E-análisis de safranina de la metástasis de hígado, metástasis de bazo, metástasis pared abdominal, y la metástasis de riñón revelaron que el desarrollo de la etapa de focos metastáticos (Figura 6B). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el tratamiento TMTP1-DKK disminuyó significativamente el crecimiento tumoral y la metástasis
in vivo
. Además, la apoptosis de células en el tumor gástrico ortotópico se detectó mediante un ensayo de TUNEL (Para la cuantificación, véase la Figura 6D).
péptido TMTP1-DKK causó una disminución dramática y dependiente de la dosis en el número de tumores metastásicos (amarillo flechas) en el cáncer gástrico ortotópico MKN-45sci. muestras de tejido C Metástasis se recogieron y patológicamente confirmado por H & amp; E tinción. tumores gástricos ortotópico D se recuperaron y la imagen inmediatamente después de análisis de la muerte celular por apoptosis mediante el ensayo TUNEL. Columnas, número medio de células TUNEL positivas contadas en tres campos seleccionados al azar en tres muestras de tumor de cada grupo; barras de error, Dakota del Sur. *, P & lt;. 0,001 por la prueba t de Student en comparación con el grupo control
TMTP1-DKK-ratones tratados sobrevivieron bien y no mostraron signos de toxicidad o pérdida de peso corporal a lo largo de los experimentos. En conjunto, estos resultados sugieren que TMTP1-DKK puede inhibir la metástasis tumoral y el crecimiento tumoral
in vivo
.
Discusión
El tratamiento del cáncer mediante la terapéutica micromoleculares tales como oligonucleótidos o péptidos requiere que los sistemas de suministro eficientes capaces de penetración intracelular. Recientemente, se identificaron una serie de nuevos péptidos que se unen específicamente a la membrana plasmática de cáncer y las células endoteliales asociadas al tumor. Los péptidos identificados fueron prometedores alternativas para utilizar actualmente biomoléculas para atacar a las células metastásicas debido a su eliminación de la sangre rápida, una mayor difusión y penetración en el tejido, la naturaleza no inmunógeno, y la facilidad de síntesis [21], [22], [23], [24], [25]. Hemos demostrado anteriormente que la metástasis ocultas o subclínicos micrometástasis se detectaron claramente por TMTP1 [11]. En el presente estudio, se investigó más a fondo si TMTP1 podría suministrar agentes terapéuticos de manera eficiente. Se examinó la capacidad de los TMTP1 para entregar un péptido proapoptótico a las células cancerosas altamente metastásicas acoplándolo a la pro-apoptótica
D (klaklak)
2 dominios. Elegimos el péptido de 14 aminoácidos sintéticos KLAKLAKKLAKLAK porque era inerte fuera de las células, pero se convirtió tóxico cuando interiorizado causando la interrupción de la membrana mitocondrial, lo que lleva a la muerte celular programada.
Nuestros datos muestran que TMTP1-GG
D (klaklak)
2 unido específicamente a las líneas de células tumorales altamente metastásicas, las células del cáncer de próstata PC-3M-1E8 y celular de cáncer gástrico MKN-45sci
in vitro
y
in vivo
. Sin embargo, TMPT1-GG-
D (klaklak)
2 no se unió a la célula nometastatic cáncer de próstata PC-3M-2B4 y línea celular de fibroblastos murinos NIH /3T3 normales de células epiteliales mamarias MCF-10A, célula normal del hígado Las células HEK293 y LO2 (Figura 1). Los resultados mostraron que TMTP1-DKK no afectó la viabilidad y la morfología de estas células normales ". Desde que se observó con FITC TMTP1-GG-
D (klaklak)
2 vinculante para ambas líneas celulares y xenoinjertos de tumores en ratones desnudos, razonó que TMTP1 sería dirigir la administración del péptido pro-apoptótica de tumores altamente metastáticos.
además, examinó los efectos antitumorales del péptido de fusión TMTP1-DKK. Nuestros resultados muestran que TMTP1-DKK mediada actividades antitumorales notables tanto i
n vitro
y
in vivo
, en comparación con cualquiera TMTP1 o DKK solo. El péptido de fusión TMTP1-DKK indujo apoptosis rápida y potente. Las bajas concentraciones de TMTP1-DKK podrían inducir la muerte de células cancerosas mientras que teniendo poco efecto sobre las células de fibroblastos murinos NIH /3T3. TMTP1-DKK mostró efectos antitumorales altos en altamente metastásico MKN-45sci y las células PC-3M-1E8, en comparación con TMTP1. DKK por sí solo no podría desencadenar la apoptosis, ya que no podría ser transducido al citoplasma de las células tumorales. Cuando se conecta a la péptido dirigido TMTP1, los niveles micromolares de DKK resultaron en aumento por lo menos 100 veces de matar a la eficiencia en células de cáncer. Curiosamente, el aumento de la eficiencia de matar no se observó en la línea celular de fibroblastos murinos NIH /3T3. Por otra parte, TMTP1-DKK inhibió significativamente la capacidad de invasión de las células tumorales
in vitro
en un ensayo transwell. Estos datos también demuestran la naturaleza modular del dominio de dirección /transducción y el dominio pro-apoptosis en TMTP1-DKK. Cada dominio confiere sus propiedades sobre el péptido acoplado para generar un agente biológicamente activo.
D (klaklak)
2 tiene actividad antibacteriana, pero es relativamente no tóxico para las células eucariotas. Sin embargo, se ha demostrado que si
D (klaklak)
2 se suministra en el citoplasma de células de mamíferos, interrumpe mitocondrias, debido a la similitud de las membranas mitochonrdrial y bacterianas, e inicia la apoptosis [26]. Estudios anteriores demostraron que cuando
D (klaklak)
2 se conjugó con un péptido autodirigido a través de un enlazador GG que al conjunto de vasos del tumor y fue citotóxica selectiva a las células endoteliales angiogénicas y tenía actividad anti-tumor
in
vivo [26]. Después de la internalización, la proapoptótico
D (klaklak)
2 péptido actuado por romper la membrana mitocondrial, lo que provoca flujo de salida de citocromo c en el citoplasma que resulta en la apoptosis. En el citoplasma, el citocromo c forma un complejo con Apaf-1 y procaspasa-9. La interacción con los resultados de procaspasa-9 en su escote y la activación, iniciando la escisión de las caspasas efectoras abajo. En nuestro estudio, se observó caspasa 9 por Western blot en células tumorales tratadas TMTP1-DKK, lo que sugiere la participación de la vía mitocondrial (Figura 3). También se observó la activación de la caspasa 8, lo que sugiere la vía de la muerte celular extracelular Fas-ligando estaba involucrado en la apoptosis inducida TMTP1-DKK también. La eficiencia de la apoptosis inducida TMTP1-DKK fue inhibido por el inhibidor de amplio rango de caspasas Z-VAD-FMK en el PC-3M-1E8 y las células MKN-45sci. Por lo tanto, nuestro estudio demostró que TMTP1-DKK desencadena la apoptosis a través tanto de la ruta mitocondrial y de la vía del receptor de muerte.
TMTP1-DKK parecía inhibir selectivamente el crecimiento del tumor y tienen poco efecto en otros tejidos en el xenoinjerto subcutáneo y ortotópico modelos de ratones trasplante. Tanto los xenoinjertos de tumores subcutáneos de PC-3M-1E8 y los tumores gástricos ortotópico MKN-45sci murinos fueron notablemente inhibida por TMTP1-DKK. El tiempo de supervivencia de ratones lampiños con tumor en ambos modelos se prolongó significativamente por el tratamiento TMTP1-DKK. El cese de la administración del péptido terapéutico condujo a un crecimiento rápido del tumor y la muerte de animales experimentales. Además, hemos proporcionado evidencia experimental directa en un modelo preclínico de la eficacia de la interferencia de crecimiento ortotópico de células de cáncer gástrico humano en ratones nude, tanto en el sitio primario y metástasis. Hemos observado metástasis de tumores en todos los animales no tratados, pero sólo unos pocos en TMTP1-DKK animales tratados. Por lo tanto, los resultados de los xenoinjertos ortotópico MKN-45sci revelaron que TMTP1-DKK inhibe eficazmente la metástasis tumoral en ratones. Los efectos terapéuticos de péptido TMTP1-DKK
in vivo
fueron también mostraron ser el resultado de tumor células por apoptosis como se demuestra mediante un ensayo de TUNEL (Figura 5, 6).
En conjunto, estos datos sugieren que TMTP1-DKK es un agente antitumoral eficaz tanto
in vitro
y
in vivo
. Se desencadena la apoptosis en una serie de células cancerosas altamente metastásicas tanto a través de la vía mitocondrial y vía del receptor de muerte. Nuestros resultados sugieren que TMTP1-DKK puede ser un potente agente terapéutico candidato para tumores metastásicos en función de su orientación específica y la actividad eficaz para matar tumor. El estudio adicional de DKK-TMTP1 y sus análogos puede conducir al descubrimiento de nuevos agentes anti-tumoral y la metástasis.
Materiales y Métodos
Diseño y síntesis de péptidos
TMTP1- DKK (NVVRQ -GG-
D (klaklak)
2) y svTMTP1-DKK (VNQRV -GG-
D (klaklak)
2), que es el péptido de control de TMTP1 (NVVRQ) , fueron creados mediante el acoplamiento del dominio de dirección (TMTP1) y la pro-apoptótica
D (klaklak)
2 dominio a través de un puente glycinylglycine como se describe [11]. isotiocianato de fluoresceína (FITC) se acopló al péptido a través de una glicina adicional en el extremo N-terminal. TMTP1-DKK y péptidos de control (DKK, TMTP1 y svTMTP1-DKK) se sintetizaron usando química de Fmoc en un sintetizador de fase sólida y se purificaron por HPLC de Xi'an Huachen Bio-Tech Ltd (Xi'an, China). La secuencia y estructura de los péptidos se confirmaron por espectrometría de masas. Los péptidos se disolvieron en agua de filtro estéril a una concentración de 1 mM.
Las líneas celulares y reactivos
El altamente metastásico y no metastásico líneas celulares de cáncer de próstata humano PC-3M-1E8 y PC-3M -2B4, respectivamente, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Jie Zheng (Universidad de Pekín, Beijing, china) [27], [28]. La célula de cáncer gástrico lineMKN-45sci humano, el fibroblasto murino NIH /3T3, normal de las células epiteliales mamarias MCF-10A, LO2 células del hígado normal y las células HEK293 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Todas las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) a 37 ° C con 5% de CO
2. Z-VAD-FMK se obtuvo de Bachem (Heidelberg, Alemania).
Construcción de modelos de ratón
Cuatro semanas de edad BALB /c
nu /nu ratones fueron
obtenido a partir del SLAC Animales de Laboratorio Co Ltd (Shanghai, china). En los estudios de inyección intratecal directa (IT), se suspendieron 3 x 10
6 células PC3M-1E8 en 100 l de solución salina normal y se inyectaron por vía subcutánea (SC) en los costados derecho de ratones (4-6 semanas de edad). Los tumores se dejaron crecer hasta 4-6 mm de diámetro antes del tratamiento. fragmentos tumorales frescas (2 mm
3) fueron luego implantados SC en el maletero posterior de los ratones anestesiados.
El modelo de ratón de cáncer gástrico ortotópico MKN-45sci, que tiene el potencial para la metástasis específica del hígado , fue proporcionado amablemente por el Dr. Li Jinjun (Instituto de cáncer de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad Shanghai Jiao Tong, de Shanghai, china) [29], [30], [31]. Se obtuvieron fragmentos de tumor fresco como se describe anteriormente. Después de anestesia ratón, el estómago se expuso y la parte de la membrana serosa raspó con fórceps. Una pieza 1 mm
3 del tumor se fijaron luego en el sitio raspado de la superficie serosa con una sutura absorbente 5-0.