Extracto
resistencia a la quimioterapia observado en pacientes con cáncer colorrectal (CCR) puede estar relacionado con la presencia de células madre del cáncer ( los CSC), pero el mecanismo (s) subyacente siguen sin estar claros. fibroblastos de carcinoma asociada (CAF) están íntimamente involucrados en la recurrencia del tumor, y la focalización ellos aumenta quimio-sensibilidad. Hemos investigado si los fibroblastos podrían aumentar los CAC mediación de este modo la resistencia a la quimioterapia. Los CCC fueron aisladas de cualquiera de xenoinjertos obtenidas de pacientes, o líneas celulares de CRC en base a la expresión de CD133. En primer lugar, se encontraron células madre cancerosas ser intrínsecamente resistentes a la muerte celular inducida por la quimioterapia. Además, el medio acondicionado derivado de fibroblastos (CM) promovido porcentaje, clonogenicidad y el crecimiento tumoral de células madre cancerosas (es decir, CD133 + y TOP-GFP +) tras el tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU) u oxaliplatino (OXA). Otras investigaciones mostraron que los exosomas, aisladas de CM, de manera similar tuvieron los efectos anteriores. La inhibición de la secreción de exosoma disminuyó el porcentaje, clonogenicidad y el crecimiento tumoral de células madre cancerosas. En conjunto, nuestros resultados sugieren que, además de la orientación células madre cancerosas, las nuevas estrategias terapéuticas que bloquean la secreción de CAF incluso antes de que se desarrolló la quimioterapia para obtener mejores beneficios clínicos en los CRC avanzada
Visto:. Hu Y, Yan C, Mu L, Huang K, Li X, Tao D, et al. (2015) Los exosomas derivados de fibroblastos-Contribuir a la quimiorresistencia través de células madre del cáncer de cebado en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (5): e0125625. doi: 10.1371 /journal.pone.0125625
Editor Académico: Christopher Heeschen, Centro Español Nacional del Cáncer (CNIO), ESPAÑA
Recibido: 4 Enero, 2015; Aceptado: March 24, 2015; Publicado: 4 Mayo 2015
Derechos de Autor © 2015 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81172065, 81272660), Programa para el Nuevo siglo talentos excelentes en la Universidad (núm NCET-12- 0208), la Fundación de Investigación Científica de los eruditos chinos de Ultramar Repatriados, Ministerio de Educación del Estado (Nº JYBHG201002), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades central (HUST, No.01-18-540005), Tongji bienes de los hospitales para los científicos de Ultramar Repatriados y destacados científicos jóvenes (2012yq004) (todos a JCQ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo, y su mortalidad ha aumentado constantemente en las últimas décadas [1]. Quimioterapias no han mejorado dramáticamente los resultados clínicos de los pacientes con CCR metastásico o recurrente. Una mejor comprensión de los mecanismos que subyacen a la resistencia en el CCR es imprescindible para el desarrollo de enfoques terapéuticos más eficaces que pueden beneficiar a los pacientes con CCR.
CRC es heterogénea, que se manifiesta morfologías celulares abigarradas y presentaciones histopatológicos. La evidencia experimental de la existencia de células madre del cáncer (CSC) en el CCR ha demostrado recientemente el uso de muestras de tumores primarios humanos CRC [2, 3]. Los CSC son la hipótesis de ser inherentemente resistentes a la quimioterapia. CRCs recurrentes sobre el tratamiento de quimioterapia con frecuencia se enriquecen para las células que expresan marcadores CSC como ABCB5 [2, 4]. Sin embargo, aún se están definiendo los mecanismos subyacentes.
fibroblastos asociados al carcinoma (CAF) están íntimamente involucrados en el mantenimiento y progresión del tumor. CAF también se informó que desempeñar un papel importante en la regulación de la sensibilidad del tumor a una variedad de quimioterapias, y que las oriente dramáticamente disminuye la quimio-resistencia [5, 6]. En este sentido, en primer lugar confirme que la quimioterapia preferentemente objetivos que no son células madre cancerosas debido a la célula de la resistencia autónoma de los CAC, y descubrir, además, que las CSC CAF primos y aumentar la resistencia a fármacos en quimioterapia a través de los exosomas derivados de la CAF.
Material y métodos
Declaración de Ética
muestras de tejido de adenocarcinoma colorrectal fueron obtenidas de pacientes que se sometieron a procedimientos quirúrgicos en el hospital de Tongji de Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos de investigación y todos los protocolos fueron aprobados por el Comité Ético del Hospital de Tongji, Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología (IRB ID: 20141106) y se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki .
anticuerpos y reactivos
monoclonal de ratón anti-CD133 humano y los anticuerpos EpCAM antihumano de ratón se adquirieron de Miltenyi Biotec (Sede, Alemania). El anticuerpo anti-α-SMA se obtuvo de Dako (Dinamarca). Anti-FAP fue adquirido de Abcam (Cambridge, Reino Unido) y anti-vimentina se adquirió de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Wnt3a y anti-beta actina fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (CA, EE.UU.). Alexa Fluor 488 cabra conjugado anti-ratón IgG se obtuvo de Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, EE.UU.). GW4869, 5-fluorouracilo (5-FU) y oxaliplatino (OXA) fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, EE.UU.). Matrigel se obtuvo de B.D. (Franklin Lakes, NJ).
Líneas celulares y cultivo celular
Las células humanas de cáncer de colon (SW620) y células de fibroblastos humanos procedentes de tejidos normales del colon (18Co) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas VA). fibroblastos asociados al cáncer (CAF) se aislaron a partir de muestras de cáncer colorrectal. células SW620, células 18Co y CAF derivadas de tumores primarios se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen, California, EE.UU.), complementado con (Life Technologies, NY, USA) FBS al 10% en un incubador humidificado a 37ºC con una atmósfera de 5% de CO
2 y 95% de aire.
Preparación de suspensiones de células individuales de tumores
tumores primarios de colon o tumores de xenoinjertos se picada completamente con el tamaño de 1 mm
3 y después se suspendió en DMEM /F12 (Invitrogen, California, EE.UU.), que contiene 1,5 mg /ml de colagenasa ⅳ (Invitrogen, California, EE.UU.), 20 ug /ml de hialuronidasa (Sigma, St. Louis, EE.UU.), 1% penicilina /estreptomicina (Life Technologies, NY , EE.UU.) y 1,25 mg /ml de anfotericina B (Sigma, St. Louis, EE.UU.) a 37 ° C durante 1 hora. Después de la digestión, los tejidos se lavaron con PBS y se filtraron a través de una malla 40μm (BD Falcon, CA, EE.UU.). Para eliminar las células rojas de la sangre, las células se incubaron en sangre roja tampón de lisis celular (eBioscience, California, EE.UU.) en hielo durante 10 minutos y se lavaron dos veces con PBS. Las células se volvieron a suspender en PBS durante los experimentos.
El aislamiento de los CAF y el establecimiento de xenoinjertos de tumores (CRC) guía XhCRC
Para aislar los CAF, las células individuales obtenidas de un paciente femenino de Duke B adenocarcinoma colorrectal se cultivaron en DMEM con 10% de FBS. Después se incubaron durante 3 horas, las células no adherentes fueron lavados con PBS, dejando a las células adherentes que consistían principalmente en macrófagos, células epiteliales, y fibroblastos. Después se cultivaron durante varios días, los macrófagos y las células epiteliales murieron, dejando las células que eran similares a fibroblastos y consistentemente α-SMA, vimentina y FAP positivo. Se utilizaron cultivos de fibroblastos primarios para los experimentos hasta el paso 10. Para establecer CRC modelo de tumor de xenoinjerto, las células de cáncer colorrectal primario individuales derivados de un paciente con Duke C adenocarcinoma colorrectal se implantaron en la espalda bilaterales de NOD hembra /ratones SCID.
celular activada por fluorescencia (FACS) y purificación de CD133
+/- células CRC
la FACS se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un clasificador de células FACS Aria II (BD, Biosciences, CA , ESTADOS UNIDOS). Para separar CD133
+ y CD133
- células /LO en las células SW620, las células se marcaron con anticuerpos CD133 anti-humano de ratón PE /APC-conjugado. En general, sólo la parte superior (CD133
+) e inferior (CD133
- /lo) se purificaron a cabo 10-20% de las células. Para separar CD133
+ y CD133
- /células LO en xenoinjertos de tumores XhCRC fueron disociadas de las células individuales se han descrito anteriormente y después se tiñeron con el ratón CD133 y conjugado con PE EpCAM antihumano de ratón anti-humano APC-conjugado anticuerpos, y EpCAM
+ CD133
+ y EpCAM
+ CD133
- /células Bajo CRC se purificaron a cabo
análisis de la muerte de la célula
La muerte celular de. células madre cancerosas y células madre cancerosas no se evaluó usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japón). Brevemente, las células se sembraron en medio completo a 3.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Después de 12 horas después de la siembra, las células se trataron con 5-FU (con 1 m) o OXA (con 1 m). Y 72 horas más tarde, se añadió 10μl solución CCK-8 a cada pocillo. A continuación, las placas se incubaron a 37 ° C durante 1 hora, la viabilidad celular se determinó mediante el escaneo con lector de mircoplate a 450 nm.
preparación del medio acondicionado
Los fibroblastos se sembraron y cultivaron en medio DMEM /F12 con 10% de FBS durante 24 horas, y después se lavó tres veces con PBS y, finalmente, se cultivan en medio DMEM /F12 libre de suero de 3 ml durante 2 horas. El medio acondicionado se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,22 mm (Merck Millipore, Massachusetts, EE.UU.) para eliminar los desechos celulares.
Aislamiento y caracterización de exosomas liberada por fibroblastos
exosomas se aislaron a partir cultivaron mediante el uso de fibroblastos total exosome Isolation Kit (Invitrogen, California, EE.UU.). En resumen, se añadieron 0,5 ml de reactivo de aislamiento total de exosomas a cada 1 ml de medio acondicionado con filtro y se mezcla bien por inversión. Después se incubaron durante la noche a 4 ° C, la mezcla se centrifugó a 12.000 × g durante 70 minutos a 4 ° C y todo el sobrenadante se eliminó por aspiración [7]. pellets de exosoma se resuspendieron con un volumen conveniente de medio DMEM /F12. Otro método de aislamiento de exosoma se realiza por centrifugación en serie como se ha descrito previamente [8]. sobrenadante celular se centrifugó en primer lugar a 2.000 × g durante 30 min, 10.000 × g durante 40 min para agotar las células muertas y los desechos celulares. Y entonces, exosomas y fracciones solubles de exosoma-agotado se separaron mediante ultracentrifugación a 100.000 xg 4 ° C durante 70 min.
El tamaño de partícula de la morfología y los exosomas se caracterizaron por medio de un microscopio electrónico de transmisión (FEI Tecnai 20, Philips) que opera a 160kV. proteínas exosoma se extrajeron de exosomas usando tampón SDS de lisis (250 nM Tris-HCL, pH 7,4, 2,5% SDS). Las proteínas se cargaron en 10% de geles de SDS-poliacrilamida, transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa. anticuerpos CD81 anti-humano de ratón (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU., clon: 1.3.3.22, 1: 100) se utilizaron para inmunotransferencia. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando Super Señal West Femto máxima sensibilidad Substrato (Thermo Scientific, Waltham, MA).
La inhibición de la liberación de exosomas
A fin de validar los efectos de los exosomas, que liberan de forma exosome fue bloqueada por cultivo con 10μM GW4869, un inhibidor específico para la esfingomielinasa neutra 2 (nSMase2) [9]. Después de la incubación durante 24 horas, el medio que contenía GW4869 se desechó y las células se lavaron por PBS 3 veces. Después, se añadió medio fresco DMEM /F12, y el medio acondicionado se recogió como se describió anteriormente.
Esfera de formación de ensayo
procedimientos básicos para ensayo de esfera-formación se han descrito anteriormente [10]. Las células se resuspendieron en medio de formación de esferas estándar [DMEM /F12 (Invitrogen, California, EE.UU.) suplementado con 1 x B27 sustituto de suero (Invitrogen, California, EE.UU.), factor de 20 ng /ml recombinante humano de crecimiento epidérmico y el crecimiento de fibroblastos básico 20 ng /ml los factores (Sigma, St. Louis, EE.UU.). CRC células se sembraron a 300 ~ 500 células /pocillo en placas de 24 pocillos ultra-bajas de fijación (Corning, Massachusetts, EE.UU.) con o sin la administración de 5-FU (con 1 m) o OXA (con 1 m). Para los ensayos de esfera de formación de serie, se recogieron las esferas de primera generación, desglosados con 0,025% de tripsina /EDTA, se filtró a través de una malla de 40 micras y re-plateado como anteriormente. Este proceso se repitió durante un máximo de 3 generaciones. Cuando se trata con quimioterapia, o /y CM /exosomas, agentes quimioterapéuticos o /y CM (200μl) /exosomas (igual a 200μl CM) se añadieron cada 2 días. Después de 5 ~ 14 días, esferas con diámetros ≥ 50 micras se marcaron y se muestran como clonogenicidad (%) en las figuras.
Estudio de Animales
Animal protocolos fueron aprobados por el Comité Universitario para el uso y cuidado de animales (UCUCA) en Tongji Medical College, universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. En todos los experimentos, la viabilidad de las células se confirmó mediante la prueba de exclusión con azul de tripano y las células se resuspendieron en 100 pl mezcla de PBS /Matrigel (1: 1 volumen), seguido por inyección en el tejido subcutáneo de la zona de la espalda izquierda y derecha usando un calibre 27 aguja. células SW620 se implantaron subcutáneamente en ratones 4 semanas de edad, ratones hembra BALB /c-nu, y las células XhCRC se implantaron en ratones NOD hembra de 4 semanas de edad /SCID. De cuatro a cinco ratones fueron inoculados por grupo. CM (200μ) o exosomas (igual a 200μl CM) fueron inyectados por vía subcutánea cada 2 días. Al mismo tiempo, todos los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con un agente quimioterapéutico, 5-FU (100 mg /kg de peso corporal) o OXA (peso corporal de 10 mg /kg) una vez a la semana. Los tumores fueron monitorizados, y los volúmenes tumorales fueron examinados cada tres días. Después de sacrificadas, los tumores se retiraron de los ratones y se pesaron para evaluar el desarrollo de tumores. Para limitar ensayos de dilución, 100.000, 10.000, 1.000 y 100 purificado CD133
+ y CD133
- células /lo CRC se implantaron ratones inimmunodeficient. Tumor iniciadoras de la frecuencia y la significación estadística se evaluó con el extremo análisis de dilución limitante (ELDA) 'limdil "función (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html).
microscopía de inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia se describió anteriormente [11] .CAFs o células XhCRC se cultivaron en cubreobjetos de 0,17 mm o placas de Petri con fondo de vidrio en monocapa durante la noche. Las células se fijaron en 4% paraformaldehído (PFA) durante 10 min a temperatura ambiente y seguido de bloqueo en 5% (w /v) de albúmina de suero bovino (BSA) en tampón PBS durante 1 hora. Los anticuerpos primarios se diluyeron en 1:50 en 5% de BSA. Después se incubaron durante la noche a 4 ° C, las células se aclararon tres veces con PBS y seguido de incubación con Alexa Fluor 488 anticuerpos secundarios conjugados (diluido 1:50 en BSA al 5%) durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, Sigma) se utilizó para visualizar los núcleos de células durante 10 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se examina con un microscopio confocal (FV1000, Olympus).
transfieren exosomas marcadas con Dil
exosomas purificada derivada de células 18Co se marcaron con tintes fluoescentcarbocyanine lipofílicas Dil de acuerdo con el protocolo del fabricante (Santa Cruz Biotecnología, CA, EE.UU.) .18Co-exosomas se suspendieron en 100 ul de PBS y se incubaron con 1μl Dil durante 15 minutos a 37 ° C, se lavó dos veces para eliminar el exceso de tinte, y se incubaron con células SW620 a 37 ° C durante la noche.
ensayos de reportero lentiviral
TCF /LEF reportero expresión de GFP conducción (TOP-GFP) lentivirus se adquirió de SBO Biotecnología médica Company, Shanghai, china. células SW620 se infectaron con lentivirus TOP-GFP a MOI = 25 durante 72 horas. Para los ensayos de formación de esferas, TOP-GFP
+ y TOP-GFP
- fracciones se separen por FACS y se sembraron en placas de fijación ultra-bajas como se describe anteriormente. Para evaluar los efectos de CM /exosomas en la actividad de Wnt de CD133 fracciones
+, 50.000 CD133
+ SW620 células fueron infectadas con lentivirus TOP-GFP y se sembró en placas de 6 pocillos, seguido por CM /exosomas tratamiento o más quimioterapia. Después de 3 días de incubación, la expresión de TOP-GFP se analizó mediante citometría de flujo.
El análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar. En general, no pareada de dos colas de Student
t-test o
se llevó a cabo de dos vías ANOVA de IBM SPSS Statistics 18 para comparar las diferencias entre las medias de los diferentes grupos de tratamiento. Un
P-valor
& lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
CD133 identifica células madre cancerosas en una línea celular de CRC y de xenoinjertos derivados de tumor de cáncer colorrectal primario
Los CSC son una población rara dentro de cáncer colorrectal que presentan autorrenovación y la capacidad tumorigénicos [12]. El uso de CD133, un fabricante de superficie, para enriquecer células madre cancerosas es esencial para separar las células tumorigénicas y no tumorigénicas [2]. Nosotros, los tumores de xenoinjertos establecidos primera (XhCRC) derivadas de un paciente femenino de Duke C adenocarcinoma colorrectal en ratones NOD /SCID hembra. Cuando los xenoinjertos de tumores crecieron, los tumores se procesaron en suspensiones de células individuales, y que luego lo solucionaron dos poblaciones de células (es decir, EpCAM
+ CD133
+ y EpCAM
+ CD133
- /lo) basado en la expresión del marcador epitelial (es decir, EpCAM) y el putativo marcador CSC (es decir, CD133) (Fig 1A) .La pureza de EpCAM
+ CD133
+ y EpCAM
+ CD133
- /células del lo era a la vez & gt; 96% (figura 1B). Para confirmar que EpCAM
+ CD133
+ células enriquecer células madre cancerosas, se realizaron ensayos de dilución limitante. Como era de esperar, la EpCAM
+ CD133
+ células demostrado una mayor capacidad de generación de tumores (
P Hotel & lt; 0,001) (Figura 1C). Del mismo modo, se purificó CD133
+ SW620 células, una línea celular CRC ampliamente utilizado, también inició más (
P
& lt; 0,001) (Fig 1C). Consistente con LDAs, ensayos de esfera de formación de serie demostraron que purificada EpCAM
+ CD133
+ células fueron capaces de ser pasado por al menos tres generaciones y mostraron un aumento de la capacidad esfera de propagación, mientras que EpCAM
+ CD133
- células /Lo formados y mucho menos en las esferas 1
o generación (
P Hotel & lt; 0,001) y EpCAM
+ CD133
sup - esferas iniciada por células /Lo abortadas por 2
o generación (figura 1D y 1E). Además, purificada CD133
+ células SW620, también se exhibieron un aumento progresivo de la capacidad de propagación de la esfera cuando se compara con CD133
- /lo SW620cells (
P Hotel & lt; 0,001) (Figura 1F y 1G ). Estos datos indicaron que CD133
+ células CRC poseían clonogenicidad a largo plazo, tanto en los xenoinjertos de tumores y las células SW620, lo que sugiere que CD133
+ células CRC, en nuestro sistema experimental, puede enriquecer en células madre cancerosas putativas. En aras de la simplicidad, de aquí en adelante, nos referiremos a EpCAM
+ CD133
+ o CD133
+ y EpCAM
+ CD133
- /Lo o CD133
- /lo células como células madre cancerosas y no las CSC, respectivamente
(A) Esquema de CD133
+ y CD133
-. células /tumorales he aquí la clasificación de xenoinjertos de tumores colorrectal disociada por FACS. (B) Un ejemplo representativo de la clasificación post análisis de la ordenada CD133
+ y CD133
-. Células /lo XhCRC (C) Tumor iniciadoras frecuencia de CD133
+ y CD133
- /Bajo CRC células en ratones inmunodeficientes (DG) Serial ensayos de formación de la esfera por CD133 purificada
+ y CD133
- /loCRC células (es decir, XhCRC y SW620). Se enumeraron las esferas (D, F) e imágenes representativas se muestran (E, G) .Scale bares, 100μm ***
P
. & Lt; 0.001.
Los CCC exhibición de células autónomas quimio-resistencia
A medida que los CAC se han notificado a ser relativamente resistentes a la quimioterapia [13-16], se interrogaba la respuesta de las células madre cancerosas y no las CSC a los agentes quimioterapéuticos convencionales (5-FU o OXA) por ensayos de actividad de CCK-8. De hecho, en tanto XhCRC y las células SW620, la muerte celular inducida por la quimioterapia se redujo significativamente en los CAC con respecto a la no-células madre cancerosas (Figura 2A,
P Hotel & lt; 0,01 en el grupo 5-Fu,
P
& lt; 0,001 en el grupo de OXA, 2B,
P
& lt; 0,001), indicando que las CSC puede ser inherentemente resistentes a los agentes quimioterapéuticos. Para determinar el fenotipo celular definitiva responsable de esta diferencia, se trataron células SW620 y XhCRC granel con 5-Fu o OXA durante 3 días, y luego se detectó el porcentaje de células que expresan CD133 mediante citometría de flujo. Como era de esperar, CD133
+ células aumentaron 0,5-1 veces después del tratamiento quimioterapéutico (Figura 1D y 1E), y además, las células CRC residuales (es decir, que contiene más CD133
+ células) también mostraron un aumento esfera- formación de capacidad (Fig 2E,
P
& lt; 0,01, 2F,
P
& lt; 0,001), lo que sugiere que la quimioterapia, de hecho, enriquece células madre cancerosas en el cáncer colorrectal a través de la quimiorresistencia CSC de célula autónoma.
(A, B) análisis de muerte celular de las células madre cancerosas y no las CSC de XhCRC o células SW620 se evaluó mediante el ensayo de CCK-8 actividad ante el tratamiento quimioterapéutico (5-Fu o OXA). **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0.001. (C, D) el enriquecimiento de células madre cancerosas en las células a granel de XhCRC (C) y las células SW620 (D) se determinó mediante análisis FACS basada en la expresión CD133 en la quimioterapia. capacidad de las células a granel (XhCRC o células SW620) (E, F) de formación de esferas pre-tratados por los agentes quimioterapéuticos o DMSO (Ctrl). **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0.001.
fibroblastos derivados de medio condicionado preparado SW620 células madre cancerosas y por lo tanto contribuyó a la resistencia a fármacos
Los estudios recientes han demostrado que el microambiente tumoral media la resistencia a los medicamentos [17], y fibroblastos de carcinoma asociada (CAF), como un componente importante del microambiente, están profundamente implicados en la resistencia a la quimioterapia [18, 19]. Los CSC De hecho, tras el tratamiento de quimioterapia, los CAF podría ser activado y mantenido piscina contribuyendo así a la resistencia a los medicamentos [20]. Sin embargo, un estudio reciente ha demostrado que los CAF, incluso sin la activación de los agentes quimioterapéuticos, promover stemness tumor en el cáncer de colon [21], lo que implica que CAF puede células CRC principales para aumentar stemness tumor antes de la quimioterapia, y que puede por lo tanto contribuir a la resistencia terapéutica.
para determinar si los CAC fibroblastos primarios contribuyendo así a la resistencia a los medicamentos, que cosechó el medio condicionado a partir cultivaron 18Co (18Co-CM) sin la administración de agentes quimioterapéuticos. a continuación, se realizaron ensayos de formación de esferas con 18Co-CM en SW620 células madre cancerosas después de la administración de 5-FU o OXA. Como era de esperar, 18Co-CM tratada SW620 células madre cancerosas genera más y más grandes esferas que SW620 células madre cancerosas en medio de control (
P Hotel & lt; 0,001) (Figura 3A). Para confirmar aún más los efectos de 18Co-CM in vivo, se implantaron por vía subcutánea en 50.000 células madre cancerosas espaldas bilaterales de ratones BALB /c hembras-nu (n = 5), que fueron inyectados por vía intraperitoneal con agentes quimioterapéuticos cada semana y también recibieron inyección de 18Co- CM o medio de control cada 2 días. En concordancia con
in vitro
resultados, 18Co-CM ratones tratados manifiesta mayor incidencia tumoral, crecimiento tumoral más rápido y tumores de mayor tamaño, que ilustra que 18Co-CM es capaz de proteger los tumores de xenoinjertos de la quimioterapia (Fig 3B y 3C). estos hallazgos sugieren que el medio acondicionado derivado de fibroblastos y sin tratamiento de quimioterapia puede prime células madre cancerosas y promover así la quimio-resistencia en el CCR.
la capacidad de SW620 células madre cancerosas tratadas con CM-18Co derivada durante la quimioterapia (a) de formación de esferas (5-Fu o OXA). Se muestran imágenes microscópicas representativas. Las barras de escala, 100μm. (B, C) 18Co de crecimiento derivado de tumor afectada medio condicionado de células madre cancerosas SW620 en ratones /c-nu hembra Balb tratados con OXA. curvas de crecimiento del tumor se muestran en la C, que se muestra en D son pesos de los tumores y las imágenes al final de los experimentos. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; *
P Hotel & lt; 0,1; **
P Hotel & lt; 0,05; ***
P Hotel & lt; 0.001.
derivados de CAF medio condicionado preparado XhCRC células madre cancerosas y promovido la quimio-resistencia
Para explorar si los CAF células madre cancerosas aisladas de xenoinjerto de primera derivada del paciente (XhCRC) contribuyendo así a la resistencia a los medicamentos. Nos primero separados y fibroblastos de carcinoma asociado primarias cultivadas (CAF) de una paciente con Duke B adenocarcinoma colorrectal, y la inmunotinción confirmó que estas células eran positivas para los marcadores de fibroblastos tales como la vimentina [22], α-SMA [23] y FAP [ ,,,0],24] y negativo para epitelial EpCAM marcador de células [25] (Fig 4A). a continuación, cosechamos medio condicionado de CAF CAF-cultivadas (CM) y ensayos de esfera de formación realizadas con la CAF-CM o medio de control en XhCRC células madre cancerosas. De acuerdo con resultados en SW620 células madre cancerosas, CAF-CM también promovió la capacidad de generación ámbito de XhCRC células madre cancerosas y los protegía de la quimioterapia (5-FU o OXA) (Figura 4C,
P Hotel & lt; 0,001 en 5-FU grupo ,
P Hotel & lt; 0,01 en el grupo OXA). Como se informó anteriormente, la quimioterapia no sólo podía inducir la apoptosis de células de cáncer, sino también alterar microambiente tumoral en tumores sólidos [20, 26]. Para evaluar si la quimioterapia hace que algunas diferencias en los efectos inductores de tumores de CAF, se trataron los CAF con 5-FU /OXA o DMSO durante 12 horas, y después de enjuagar agentes quimioterapéuticos, medio acondicionado se cosechó como se describe en
Materiales y Métodos
. Sin embargo, nuestros datos revelaron que no hubo diferencia significativa entre los CAF tratados con quimioterapia y cafés tratados con DMSO, todos CAF-CM podría mejorar la capacidad de formación de esferas de XhCRC células madre cancerosas (Fig 4D,
P
& lt; 0,001 DMSO -CM /5-Fu vs. control,
P
& lt; 0,01 OXA-CM vs. control), lo que implica que CAF ya CSC principales a través de manera paracrina antes de la quimioterapia. Para explorar más a fondo los efectos de la CAF-CM sobre el crecimiento tumoral de células madre cancerosas XhCRC, se inyecta por vía subcutánea 50.000 XhCRC células madre cancerosas en la espalda bilaterales de NOD hembra /ratones SCID (n = 4), que recibió a la vez OXA y CAF-CM. En consonancia con
hallazgos in vitro, se trató-CAF-CM XhCRC células madre cancerosas generan crecimiento más rápido y más grandes tumores en comparación con el medio de control (figura 4E y 4F). Del mismo modo, tras el tratamiento con 5-Fu, tratado-CAF-CM XhCRC CSC inició más tumores en comparación con medio de control (Fig 4G).
CAF (A) derivados de la muestra del paciente se validaron mediante inmunotinción positiva para CAF marcadores (α-SMA, vimentina y FAP) y la inmunotinción negativa para un marcador epitelial (EpCAM). Las barras de escala, 30 micras. (B) XhCRC células madre cancerosas fueron validados por inmunotinción positiva para el marcador epitelial (EpCAM) y el marcador CSC (CD133), barras de escala, 10μm. capacidad de las células madre cancerosas en XhCRC CAF-medio condicionado derivado (por ejemplo, 5-FU, OXA, CAF tratados con DMSO) (C) de formación de esferas. capacidad de XhCRC células madre cancerosas tratadas con CM derivados de CAF durante la quimioterapia (5-Fu o OXA) (D) de formación de esferas. Se muestran imágenes microscópicas representativas. Las barras de escala, 50 micras. (E, F) CM derivados de CAF afectada sobre el crecimiento tumoral de células madre cancerosas en XhCRC hembra NOD /SCID tratados con OXA. curvas de crecimiento del tumor se muestran en la E, que se muestra en F son pesos de los tumores y las imágenes al final de los experimentos. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; *
P Hotel & lt; 0,1; **
P Hotel & lt; 0.05. (G) CAF-CM deriva afectada sobre el crecimiento tumoral de células madre cancerosas XhCRC trasplantado en ratones NOD hembra /SCID después del tratamiento con 5-FU.
En conjunto, estos resultados demuestran claramente que las células madre cancerosas CAF primos y así promover quimiorresistencia en cáncer colorrectal a través de la secreción de factor de (s) soluble.
Los fibroblastos derivados de exosomas CSC principales a ser más quimiorresistencia
evidencia reciente sugiere que los exosomas, factores solubles que son secretadas por una variedad de células , han sido implicados en la metástasis y la resistencia a los medicamentos [8, 27, 28]. La hipótesis de que los exosomas también podrían contribuir a la resistencia a los medicamentos en nuestro sistema experimental. Por lo tanto, lo primero que purificamos exosomas de 18Co-CM y CM-CAF como se describe en
Materiales y Métodos
, y luego confirmado su naturaleza estructural bajo el microscopio electrónico de contraste de fase (figura 5A) y por inmunotransferencia de la proteína marcadora exosome CD81 (Fig 5B). Para investigar si los exosomas fibroblastos-secretada pueden transferir a las células CRC, etiquetamos exosomas con Dil, un colorante lipófilo fluorescentcarbocyanine. Hemos observado que se tomaron exosomas marcadas con Dil derivadas de células 18Co por las células SW620 después de 12 horas de co-incubación (Figura 5C). a continuación, se trataron células madre cancerosas con exosomas purificados en lugar de CM, y se encontró que tanto SW620 y XhCRC células madre cancerosas tratadas con exosomas generados más esferas (
P Hotel & lt; 0,01) (Figura 5D y 5E), lo que sugiere que los exosomas, que son derivado de los fibroblastos, células madre cancerosas pueden primos a ser más quimio-resistencia. Para confirmar aún más que los exosomas fibroblastos-secretada en lugar de otros factores solubles toman los efectos anteriores, adoptamos ultracentrifugación diferencial estándar, en lugar del kit de aislamiento total de exosomas, para aislar los exosomas. Al igual que en los exosomas purificados kit, pellet-SW620 tratadas con CM células madre cancerosas forma más esferas en comparación con pastillas de control (
P Hotel & lt; 0,001 en el grupo 5-Fu,
P Hotel & lt; 0,01 en grupo OXA), y el sobrenadante agotado en exosoma de 18Co-CM no tomaron este efecto (
NS de control pellet vs sobrenadante
) (Fig 5F). Para confirmar aún más si los exosomas fibroblastos derivados de mediar en la resistencia a los medicamentos, se trataron fibroblastos (18Co y CAF) con GW4869, un inhibidor de la esfingomielinasa neutra específica (nSMase), que bloquea la liberación exosomas, y luego obtuvo el CM (es decir, CM exosome-agotado) . En concordancia con los hallazgos anteriores, exosome empobrecido CM disminuyó notablemente la quimio-resistencia de células madre cancerosas (Figura 5G,
P Hotel & lt; 0,001, 5H, en el grupo 5-Fu,
P Hotel & lt; 0,001 en OXA grupo). Además,
in vivo
experimentos también mostraron que XhCRC células madre cancerosas, mientras trata con exosomas derivados de la CAF, genera más rápido crecimiento (Figura 5I y 5K) y los tumores de mayor tamaño (
P Hotel & lt; 0,05 ) (Fig 5J y 5L) durante la quimioterapia (5-Fu o OXA). Estos datos muestran claramente que los exosomas fibroblastos derivados de células madre cancerosas a ser más resistencia a los medicamentos preparados.
(A) La transmisión electrónica de imagen microscópica de los exosomas derivados de células 18Co y CAF. Las barras de escala, 100 nm. (B) Western Blot de CD81 en exosomas. (C) microscopía Representante de células SW620 expuestos a exosomas marcadas con DiI durante 12 h. capacidad de SW620 o XhCRC CSC tratados con exosomas derivados de CAF 18Co /durante la quimioterapia (5-Fu o OXA) (D, E) de formación de esferas. capacidad de CSC SW620 tratadas con exosomas derivados de 18Co de ultracentrifugación purificado durante la quimioterapia (5-Fu o OXA) (F) de formación de esferas. (G, H) Los fibroblastos fueron tratados con 10 mM GW4869 (se disuelve en DMSO) durante 24 h. El CM derivado de GW4869 /fibroblastos pretratados con DMSO se añadieron a células madre cancerosas. (I-L) exosomas derivados de CAF afectados sobre el crecimiento tumoral de células madre cancerosas XhCRC en ratones NOD /SCID hembra tratados con 5-Fu o OXA. curvas de crecimiento del tumor se muestran en I (5-FU) y K (OXA), y pesos de los tumores y las imágenes al final de los experimentos se muestran en L (5-FU) y J (OXA). Los datos se presentan como media ± desviación estándar; *
P Hotel & lt; 0,1; **
P Hotel & lt; 0.05.
Los exosomas células madre cancerosas a través de los principales vía de señalización Wnt
Se ha demostrado previamente que la actividad de señalización Wnt es un marcador funcional de las células madre del cáncer y es de vital importancia en el mantenimiento de troncalidad en el colon tipos de cáncer. De una manera similar a las células madre intestinales normales, la actividad de Wnt no es simplemente una característica intrínseca de las células que se pueden utilizar para definir la célula madre de cáncer de colon (CSC) de la población, sino que también está regulada por el microambiente extrínseca [29-32] . la actividad de Wnt es asociados con el factor del factor de células T /potenciador linfoide (TCF /LEF) la familia de factores de transcripción que activan genes específicos Wnt objetivo [33, 34].
Para interrogar si exosomas células madre cancerosas principales a través de la señalización de Wnt