Extracto
La hipoxia y la inflamación son estrictamente interconectado tanto concurrente a la progresión del cáncer de próstata. Numerosos informes ponen de relieve el papel de las células tumorales en la síntesis de moléculas pro-inflamatorias y muestran que la hipoxia puede modular un número de estos genes que contribuyen sustancialmente al incremento de la agresividad del cáncer. Sin embargo, poco se sabe acerca de la importancia del fenotipo tumoral en este proceso. El presente estudio explora cómo las diferentes características, incluyendo la diferenciación y la agresividad, del tumor de próstata líneas celulares impacto en la remodelación hipóxica de la expresión de genes pro-inflamatorios y los tumores malignos. Hemos realizado nuestros estudios en tres líneas celulares con el aumento de potencial metastásico: la LNCaP andrógeno-dependientes bien diferenciado y el DU145 y PC3 menos diferenciados y andrógeno-independiente. Hemos analizado el efecto que el tratamiento hipóxico tiene sobre la modulación de la expresión de genes pro-inflamatoria y evaluado las isoformas HIF de rol y juegos de NF-kB en el sostenimiento de este proceso. DU145 y células PC3 evidenciaron una expresión de normoxia superior y una inducción hipóxica más completa de moléculas pro-inflamatorias en comparación con la línea celular LNCaP bien diferenciado. El papel de HIF1α y NF-kB, los reguladores maestros de la hipoxia y la inflamación, respectivamente, en el mantenimiento del fenotipo proinflamatorio hipóxico era diferente según el tipo de célula. NF-kB se observó a desempeñar un papel principal en DU145 y células PC3 en el que el tratamiento con el inhibidor de parthenolide NF-kB fue capaz de contrarrestar tanto el cambio pro-inflamatoria hipóxica y la activación HIF1α pero no en células LNCaP. Nuestra datos destacan que el fenotipo de las células prostáticas tumorales contribuye en un grado diferente y con diferentes mecanismos para la expresión de genes proinflamatorios hipoxia relacionada con la progresión tumoral
Visto:. Rávena L, L Principessa, Verdina A, L Salvatori, Russo MA, Petrangeli e (2014) fenotipos distintos de células de cáncer de próstata humano asocio con diferentes adaptación a la hipoxia y la expresión de genes de pro-inflamatorias. PLoS ONE 9 (5): e96250. doi: 10.1371 /journal.pone.0096250
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Septiembre, 2013; Aceptado: 4 Abril 2014; Publicado: 6 Mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Ravenna et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Ministerio de Educación Universidad e Investigación (MIUR, COFIN 2006062242). Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata presenta una población heterogénea de células incluyendo las células de cáncer rara madre (CSC) y progenitores pluripotentes (Ps) embebidos en una masa de tipos de células en diferentes grados de diferenciación. La abundancia relativa de CSC + Ps y la diferenciación de células a granel se correlacionan con la malignidad del tumor [1], [2]. Sin embargo, están disponibles en el impacto del fenotipo de las células tumorales a granel en la adaptación al estrés ambiental y en particular a la hipoxia pocos datos. La hipoxia es una reducción en el nivel normal de la tensión de oxígeno del tejido que puede ocurrir en patologías humanas. Estudios recientes han demostrado que la hipoxia promueve un fenotipo metastásico más agresivo en los cánceres humanos como el de mama [3], glioblastoma [4], tiroides [5], colon [6], de páncreas [7] y en los tumores de próstata particulares [8] - [10] que se asocia con un mal pronóstico. Hipoxia factores inducible (HIF) son reguladores clave de la respuesta transcripcional a estrés hipóxico [11]. Ellos son heterodímeros formados por un O
2 subunidad α sensible y una subunidad β expresada constitutivamente (HIF1β). Tres isoformas inducibles de HIFa están presentes en los mamíferos. HIF1α y HIF2α son los mejores isoformas y caracterizados estructuralmente similares [12]. HIF3α es el más alejadas con numerosas variantes de empalme [13]. En presencia de oxígeno, HIF1α sufre degradación proteasomal. Bajo condiciones de hipoxia, se acumula en los núcleos de las células, forma heterodímeros con HIF1β y se une elementos de respuesta a la hipoxia en los loci del gen diana. También HIF2α y HIF3α presente estabilización hipóxica y la unión a HIF1β aunque con diferente cinética. Tanto HIF2α y HIF3α aparecen expresados de una manera específica de células y desempeñan papeles no redundantes en la adaptación a la hipoxia y en el crecimiento del tumor y la progresión hipóxica [14], [15]. aumento de la evidencia indica que el microambiente inflamatorio es un factor que contribuye más que conduce al desarrollo del cáncer en la próstata [16], [17]. respuesta de genes inflamatorios depende de varios factores de transcripción, entre los que NF-kB juega un papel central. La forma clásica de NF-kB es el heterodímero p50 /p65. Después de la activación, los dímeros de NF-kB se translocan al núcleo en el que puedan someterse a la fosforilación, los genes diana se unen y estimular la transcripción [18]. Un diafonía entre el NF-kB y las vías de HIF se ha documentado ampliamente [19] - [21]. De hecho, el p50 subunidades NF-kB y p65 interactúa directamente con el sitio consenso de NF-kB en el promotor HIF1α y contribuyen a los niveles basales de HIF1α ARNm y proteínas en algunos modelos [22], [23]. Por otro lado, la hipoxia parece activar NF-kB dependiente de la transcripción de genes [24]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que vinculan la hipoxia a la inflamación y la inflamación a la progresión del tumor aún siendo difícil de alcanzar. Informes recientes han destacado el papel de las células tumorales hipóxicas en la síntesis de moléculas relacionadas-inflamatorios en mama [3], glioblastoma [4], tiroides [25] y de próstata [26] la progresión del cáncer maligno. Además, demostraron que una vía coordinada incluyendo moléculas inflamatorias y reparadoras está presente en el tejido tumoral en ausencia de infiltrado de leucocitos detectables (CD45 +) y está regulado en las células transformadas.
El presente estudio se llevó a cabo a fin de analizar la importancia relativa de las vías de HIF y NF-kB en la modulación de la expresión de genes inflamatorios hipóxico en modelos celulares de próstata que muestra fenotipos distintos con el aumento de la diferenciación. Aclarar la participación específica de estas dos vías en las células heterogéneas intratumorales podría tener utilidad lluvia radiactiva en la investigación clínica y la terapia [27]. Con este fin, hemos realizado nuestros experimentos en la LNCaP bien diferenciado, dependiente de andrógenos y en las líneas menos diferenciadas independientes de andrógenos DU145 y de próstata tumor PC3 de células con potencial metastásico bajo, moderado y alto, respectivamente [28] - [32] . Tomamos en consideración un conjunto representativo de los genes relacionados con la respuesta inmune innata en gran medida involucrados en la progresión del tumor de próstata que fueron mostrados aumentada en el tejido tumoral [26], [33]. Estos incluyen: el receptor de daño de los productos avanzados de glicación (RAGE) y el receptor de purina (P2X7R), el factor de crecimiento epidérmico vascular A (VEGF) que participan en la angiogénesis tumoral, las enzimas inducibles ciclo-oxigenasa-2 (COX2) responsable de prostaglandinas la síntesis, la proteína de fase aguda pentraxina 3 (PTX3) y el receptor de quimioquinas CXC 4 (CXCR4) de factor derivado de células estromales, regulador de crecimiento invasivo y la formación de metástasis. Por otra parte, se analizaron los niveles de hemo-oxigenasa-1 (Ho1), la enzima limitante de la velocidad en la degradación del hemo, como un prototipo de regulador anti-inflamatoria [34], [35]. Para evaluar el impacto de NF-kB en la hipoxia impulsado la modulación de los genes pro-inflamatorios analizados, se estudiaron los efectos de la parthenolide inhibidor de NF-kB. La contribución de HIF1α y la acción combinada de NF-kB y HIF1α se analizaron en las células DU145 independientes de andrógenos de forma estable desmontables para HIF1α.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP, DU145 y PC3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection. LNCaP fueron cultivadas en medio RPM1-1640, DU145 y PC3 en medio D-MEM (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10% v /v inactivado (HyClone Thermo Scientific) y 100 U /ml de penicilina + 100 mg /ml de estreptomicina. dihydrocloride puromicina siempre se añadió (Sigma-Aldrich) 2 mg /ml al medio de clones desmontables HIF1α. Las células se mantuvieron en condiciones de normoxia estándar (95% de aire y 5% de CO
2) en un incubador humidificado a 37 ° C. Para los experimentos en condiciones de hipoxia, las células se sembraron en placas en medio de crecimiento completo a una densidad en función de la duración del tratamiento para llegar a subconfluencia cuando se realizó el análisis. En el día del experimento, el medio se reemplazó con cultivos de medio y de células hipóxicas precondicionados fueron sometidos a la hipoxia en una cámara incubadora modular sellado (Billups-Rothenberg) purgado con 1% O
2, 5% de CO
2 y 94% N
2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cultivaron a 37 ° C. Parthenolide (Sigma-Aldrich) los tratamientos se llevaron a cabo a una concentración de 5 mM durante el tiempo indicado, siempre precedido de un 2 h de pretratamiento en normoxia.
La extracción de proteínas y ensayo de western blot
Los extractos nucleares se prepararon por un kit de extracto nuclear (Active Motif). Un total de 5-20 g proteínas se resolvieron en geles de poliacrilamida Tris-HCl y se transfirió electroforéticamente a membranas de difluoruro de polivinilideno (Invitrogen). Las membranas se bloquearon en leche PBS libre de grasa 5% (Bio-Rad Laboratories) durante 1 h, se sondaron con el anticuerpo primario apropiado durante la noche a 4 ° C y posteriormente se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente. Los inmunocomplejos se visualizaron usando un kit de quimioluminiscencia mejorado (EuroClone). Las imágenes digitales de las bandas resultantes se cuantifican mediante el paquete de software Quantity One (Bio-Rad Laboratories) y se expresaron como unidades densitométricas arbitrarias
Se usaron los siguientes anticuerpos primarios y secundarios:. ratón anti-HIF1α (1:500 , BD Bioscience); ratón anti-HIF2α y conejo anti-p50 (1:500, 1:1000, Novus Biologicals); conejo anti-HIF3α (1:1000, Sistemas Biológicos Aviva); ratón anti-p65 (1:2000, Santa Cruz Biotechnology); conejo anti-fosfo-kB p65 NF (Ser 276) (1:1000, Señalización Celular); ratón anti β-actina (1:10000, Sigma Aldrich); peroxidasa de rábano conjugada anti-ratón y anti-conejo (1:2000, Bio-Rad Laboratories).
ARN aislamiento y en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
ARN total fue extraído mediante el reactivo Trizol y a transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa Superscript II y cebadores aleatorios (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. RT-PCR cuantitativa se realizó con el sistema ABI Prism 7000 de detección de secuencias (Life Technologies). TaqMan Gene kits de ensayo de expresión se utilizaron para HIF1α, HIF2α, HIF3α, VEGF, RAGE, P2X7R, COX2, PTX3, CXCR4, Ho1 y 18S rRNA (Life Technologies) con las condiciones del ciclo por defecto del fabricante. El nivel de ARNm de cada gen se cuantificó utilizando una curva estándar adecuado y normalizado a los ARNr 18S limpieza de genes.
génica estable silenciar
El glicerol bacteriana Misión shRNA de la secuencia de albergar verificada shRNA vectores plásmidos lentivirus ( los números de clones TRCN0000003810 y TCRN0000010819) que expresan ARN corto horquilla (shRNA) focalización HIF1α (HIF1α shRNA) y los plásmidos no director shRNA negativos de control (NTshRNA) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. Los cultivos bacterianos se amplificaron y los plásmidos se purificaron shRNA (PureLink, Invitrogen) y se transfectaron en células DU145. transfecciones estables se realizaron usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. En resumen, 10
6 células fueron sembradas en platos con un diámetro de 6 cm. El día siguiente, las células fueron transfectadas con 4 g de plásmido en un medio sin antibióticos. Seis horas más tarde, el medio se reemplazó con un medio estándar y, 24 h después de comenzar la transfección, se tripsinizaron y se sembró a diferentes diluciones células. Después de otras 24 h, se añadió el clorhidrato de puromicina antibiótico selectivo a la concentración final de 2 mg /ml. Diez colonias seleccionadas para cada vector plásmido se amplificaron y se probaron para la expresión HIF1α mRNA. Las colonias con un nivel reducido HIF1α mRNA (~ 20% del valor de peso promedio) para silenciar vectores de plásmido y un nivel de mRNA comparable a las células wt para NTshRNA plásmido vector se comprobaron para la proteína nuclear HIF1α por Western blot, después de 4 h de estimulación hipóxica. Para reducir la variabilidad de la respuesta hipóxica, se realizó los experimentos en tres clones desmontables diferentes y se presentan la media ± SE de los resultados obtenidos a partir de cada clon. Para el control, se utilizó una mezcla de tres de orientación de plásmidos vectores no clones transfectados. NTshRNA DU145 y células wt no mostraron diferencias significativas en los niveles de normoxia e hipoxia de todos los parámetros analizados. Por lo tanto, se indica como "peso" la media ± SE de los datos obtenidos tanto de las células WT y NTshRNA DU145.
El análisis estadístico
Cada experimento se realizó al menos tres veces y los resultados son representativos mostrado. Los valores en los gráficos de barras se dan como la media ± EE. La significación estadística para las comparaciones individuales de datos distribuidos normalmente se determinó mediante la prueba t de Student o por Mann-Whitney rango suma de prueba para los datos normalmente no distribuidos. Todas las estadísticas se analizaron mediante el programa PRISM. Los valores de p inferior a 0,05 se consideró significativo (* /° /# P & lt; 0,05, ** /°° /## P & lt; 0,01, *** /°°° /### P & lt; 0,001).
resultados
proteína translocación nuclear y la transcripción del ARNm de HIF1α HIF2α y HIF3α en células de cáncer de próstata LNCaP hipóxicas, DU145 y PC3
translocación nuclear es una medida de la activación de isoformas HIF. Por lo tanto, caracteriza el perfil de expresión nuclear de HIF1α, HIF2α y HIF3α en las líneas celulares de próstata LNCaP tumor, DU145 y PC3 siguientes privación de oxígeno (Figura 1A). En el control de normoxia, la proteína HIF1α era indetectable o presente en un nivel muy bajo. Un% de oxígeno aumentó su translocación nuclear en todas las líneas celulares examinadas con una cinética similar. la acumulación nuclear comenzó poco después de la privación de oxígeno (1 h), alcanzó un pico después de 4 horas y se redujo cerca del nivel de base por 48 h. HIF2α estaba presente en el núcleo en todos los modelos celulares también en normoxia y su cantidad no parecía modulada significativamente en cualquiera de los modelos estudiados. Una proteína de 72 kDa nuclear HIF3α era detectable sólo en las células DU145 normoxia, donde también se observó una inducción finales de partida después de 24 h de estimulación. El análisis densitométrico se evidencia un aumento máximo de 2,8 ± 0,8 pliegues comparación con las células de normoxia después de 48 h de retirada de oxígeno y una lenta disminución a valores todavía por encima de los de los controles después de 72 h de hipoxia (datos no mostrados).
Cell fueron expuestos a 1% o
2 a partir de 1 hasta 48 a 72 h, de acuerdo con el diseño experimental o no se tratan. Se detectó una expresión de la proteína en los extractos nucleares por el análisis de inmunoblot. Se muestra un experimento representativo para cada gen en cada uno de las líneas celulares estudiadas. β-actina se utilizó como control de carga. B determinaciones de ARNm se realizaron mediante PCR en tiempo real, normalizado a los de limpieza gen 18S rRNA y se expresan como veces de inducción con respecto a los controles de normoxia (establecido a 1). Los valores medios ± EE.
Los efectos de la hipoxia en los niveles HIF1α, HIF2α mRNA y HIF3α en los modelos celulares estudiadas se muestran en la Figura 1B. HIF1α ARNm se expresa en todas las células no estimuladas. En el ambiente hipóxico, el nivel de ARNm HIF1α se mantuvo sin cambios durante 4 horas y luego se disminuyó bruscamente a un 40-50% del valor base y se mantuvo de forma estable bajo y 48 h de tratamiento. También HIF2α mRNA se expresó en todas las líneas celulares de normoxia y mostró un aumento tarde y ligera sólo en el LNCaP dependiente de andrógenos después de la privación 24 y 48 h de oxígeno. HIF3α mRNA fue detectable solamente en DU145. En este modelo celular, hipoxia determinado ARNm regulación que precedió al aumento de la proteína nuclear, empezando después de 4 horas y alcanzando un pico después de 48 h de estimulación (10,8 ± 1,5 veces de inducción).
En conjunto, nuestros datos destacan que la isoforma HIF1α, de los tres analizados, es el principal jugador en la respuesta a la hipoxia independientemente del fenotipo celular. activación HIF3α es específico de célula y no parece estar relacionada con la agresividad de células de cáncer.
hipoxia activa la vía de NF-kB en DU145 y PC3 pero no en las células LNCaP dependientes de andrógenos
evaluó el efecto de la hipoxia sobre el estado de NF-kB por Western blot, la cuantificación de la cantidad de subunidades p50 y p65 nucleares en los experimentos de tiempo-por supuesto de falta de oxígeno. NF-kB activación basal se observó en todas las líneas celulares. translocación nuclear de p50 y p65 tanto se incrementaron significativamente en comparación con las células PC3 en normoxia (1-4 h) y DU145 (2-4 h), mientras que la falta de oxígeno no para modular significativamente el nivel de NF-kB nuclear en células LNCaP dentro del mismo tiempo tramo (Figura 2).
Las células se expone al 1% de o
2 desde 0,5 hasta 24 h, o se deja sin tratamiento. Después de los tiempos indicados, se procesaron las células y el contenido nuclear de p50 y p65 se detectó mediante análisis de inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control de carga. Se muestra un experimento representativo para cada gen en todas las líneas celulares estudiadas. La media de la densitometría de NF-kB p50 y p65 en relación con ß-actina ± SE también se pone de manifiesto y se expresó como unidades arbitrarias. * Las células hipóxicas
vs células de control
normoxia.
Estos resultados proporcionan evidencia de que la hipoxia tiene un impacto diferente en ruta de NF-kB acuerdo con fenotipo de las células tumorales.
hipóxico regulación al alza del fenotipo relacionado con la inflamación en las células tumorales de próstata
a continuación, estudiamos el papel de la hipoxia en la modulación de la síntesis de moléculas pro-inflamatorias en las líneas de células tumorales de próstata descritas. Con este fin, se seleccionaron un número de miembros representativos de las familias de genes implicados en la inflamación y en la reparación tisular sobreexpresa en tumor de próstata o de metástasis y su expresión en curso de tiempo de aguda (2 y 4 h) y crónica (24, 48, 72 h) la estimulación hipóxica se midió por PCR en tiempo real
.
No se observaron diferencias cualitativas y cuantitativas en el nivel de base y en la inducción hipóxica de las moléculas seleccionadas de acuerdo con el fenotipo celular y el potencial metastásico.
células LNCaP fueron los productores menos activas de las moléculas estudiadas bajo normoxia. No se detectó transcripciones de la PTX3 y COX2 y todos los otros genes, a excepción de CXCR4, fueron significativamente menos transcrito en comparación con las células DU145 independientes de andrógenos y PC3 (Tabla 1).
La hipoxia fue capaz de inducir VEGF, RAGE, CXCR4 y HO1 pero no P2X7R transcripción del mRNA. aumento mRNA RAGE estaba limitada a la estimulación aguda (4 h), mientras que la transcripción del mRNA de los otros genes alcanzó un máximo después de 24 h de privación de oxígeno y se redujo en 72 h (Figura 3A).
Las células se expusieron a 1% O
2 desde 2 hasta 72 h. los niveles de mRNA de VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 y HO1 fueron analizados por PCR en tiempo real y normalizado para la limpieza de genes 18S rRNA. Los gráficos muestran la relación entre la expresión de las células tratadas hipoxia con respecto a las células control de normoxia (fijado en 1). Los valores medios ± SE. * Las células hipóxicas
vs células de control
normoxia.
DU145 y PC3 células expresan un mayor número de los genes relacionados con la inflamación seleccionados que fueron regulados al alza en la hipoxia con una respuesta más completa y persistente en células PC3 más agresivos. En particular, DU145 evidencia transcripciones basales para todas las moléculas estudiadas, excepto para P2X7R. En la hipoxia, ARNm de la PTX3 mostró un aumento precoz y limitada en el tiempo, mientras que la transcripción de VEGF, RAGE, COX2, CXCR4 y HO1 alcanzó su punto máximo después de 24 h de estimulación y se redujo en 72 h (Figura 3B). células PC3 expresaron niveles de mRNA basales detectables de todas las moléculas pro-inflamatorias analizados. También en esta línea celular PTX3 y rabia fueron inducidos por la hipoxia aguda máximo después de 2 y 4 h de estimulación, respectivamente. A diferencia de los otros modelos de células, el aumento de la expresión del VEGF hipóxica, P2X7R, COX2, CXCR4 y HO1 todavía estaba en su punto máximo después de 48-72 horas de privación de oxígeno (Figura 3C).
En conjunto, los resultados anteriores resaltar que la expresión y la regulación positiva de moléculas hipóxico normalmente implicados en la inflamación y la metástasis de tumor de próstata en gran medida puede variar de acuerdo con el fenotipo celular.
NF-kB inhibidor parthenolide contrarresta el fenotipo proinflamatorio hipoxia inducida en DU145 y PC3 en pero no en las células LNCaP e induce la transcripción HO1 en todos los modelos celulares
la observación de que la hipoxia tiene un impacto diferente sobre la activación de NF-kB de acuerdo con el fenotipo línea celular nos llevó a investigar el papel de NF-kB, en la regulación al alza hipóxica del fenotipo relacionado con la inflamación en todas las células de la próstata utilizando el parthenolide inhibidor de NF-kB natural. En las figuras 4A, 4B y 4C de los efectos de 5 M parthenolide sobre la expresión de la hipoxia modulada genes pro-inflamatorios en LNCaP, las células DU145 y PC3, respectivamente, se representan, tanto en condiciones hipóxicas y de normoxia. Para cada gen, se presentan los datos obtenidos en el punto de tiempo en el que la hipoxia ejerce su máximo aumento en la transcripción, como se muestra en las figuras 3A, 3B y 3C. Parthenolide contrarresta significativamente la hipoxia inducida por la regulación positiva de la mayoría de estos genes en DU145 y en células PC3 a excepción de P2X7R y CXCR4 en células PC3. Por el contrario, el fármaco no mostró ningún efecto significativo en la expresión de las moléculas de la hipoxia inducida en células LNCaP menos agresivos.
LNCaP (A), PC3 (B), DU145 células (C) se mantuvieron en normoxia y se expone a 1% O
2 en presencia y ausencia de 5 mM parthenolide. los niveles de mRNA de VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 y HO1 se analizaron por PCR en tiempo real, normalizado a la limpieza de genes 18S rRNA y se expresaron como veces de inducción con respecto al control sin tratar de normoxia (fijado en 1). Para cada gen se presenta el efecto de parthenolide en los puntos de tiempo en los que la hipoxia ejerce un aumento máximo en su transcripción. * Las células hipóxicas tratadas partenolida
vs células hipóxicas
. C: células no tratadas de control de normoxia. P: células normoxic partenolida tratada. H: células hipóxicas. HP:. Partenolida células hipóxicas tratadas
La acción de parthenolide en la modulación de HO1, una enzima clave en la lucha contra el daño inflamatorio, era completamente diferente (Figura 5). Parthenolide fue capaz de inducir precozmente y fuertemente HO1 en todas las células de tumor de próstata normoxic hipóxica y con un efecto máximo después de 4 h de estimulación. Este efecto disminuye gradualmente, pero todavía estaba presente después de 24 h de tratamiento en LNCaP y DU145 y después de 48 h en células PC3. En estos puntos de tiempo el efecto de parthenolide y la hipoxia sobre la expresión de HO1 fueron aditivos.
LNCaP, PC3 y DU145 células se mantuvieron en normoxia y se expone a 1% O
2 en presencia y ausencia de 5 micras parthenolide. los niveles de ARNm para HO1 se analizaron por PCR en tiempo real, normalizado a la limpieza de genes 18S rRNA y se expresaron como veces de inducción con respecto al control sin tratar de normoxia (fijado en 1). Mostramos el efecto de parthenolide después de 4 h de tratamiento cuando el fármaco máximo expresión HO1 upregulated en cultivos de normoxia y después de 24 h (LNCaP, DU145) y 48 h (PC3) de estimulación cuando la hipoxia ejerce un aumento máximo en su transcripción. Los valores medios ± SE. * Normóxico y las células hipóxicas tratadas partenolida
vs células de control
normoxia. C: células no tratadas de control de normoxia. P: células normoxic partenolida tratada. H: células hipóxicas. HP: parthenolide tratada células hipóxicas
Estos resultados demuestran que el NF-kB desempeña un papel fundamental en el cambio de los más agresivos DU145 y PC3 pero no las células tumorales de próstata LNCaP hipóxico hacia una pro-inflamatoria, más maligna. fenotipo. Además, en todas las líneas celulares, NF-kB parece ser que participan en una inhibición por hipoxia independiente de la HO1 gen anti-inflamatoria.
Parthenolide afecta a la activación dependiente HIF1α y HIF3α hipoxia en líneas DU145 y de células PC3
El control de HIF y especialmente de HIF1α la activación de NF-kB por es una cuestión de debate. Hemos probado si parthenolide tuvo ningún impacto en la acumulación nuclear de HIF1α después de 4 h de estimulación hipóxica que indujo el nivel más alto de la translocación nuclear en nuestras condiciones experimentales. La Figura 6A muestra que la parthenolide inhibidor de NF-kB disminuyó significativamente la acumulación nuclear de proteína HIF1α en DU145 y PC3 células (~ 30%, P & lt; 0,05). Curiosamente, el nivel nuclear HIF1α no se vio afectada por la inhibición de NF-kB sólo en las células LNCaP que no mostró una significativa activación de NF-kB en la hipoxia.
A LNCaP, las células DU145 y PC3 se mantuvieron en normoxia y se expone a 1% O
2 de 4 h en presencia y ausencia de 5 mM parthenolide. contenido HIF1α se midió en la fracción nuclear mediante análisis de inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control de carga. Para cada gen se muestra un experimento representativo. La media de la densitometría de HIF1α en relación con ß-actina también se pone de manifiesto y se expresó como unidades arbitrarias. células DU145 B se incubaron en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia durante 48 h en presencia y ausencia de 5 mM parthenolide. contenido HIF3α se midió en la fracción nuclear mediante análisis de inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control de carga. Para cada gen se muestra un experimento representativo. La media de la densitometría de HIF3α en relación con ß-actina también se pone de manifiesto y se expresó como unidades arbitrarias. Los valores medios ± SE. C: células no tratadas de control de normoxia. P: células normoxic partenolida tratada. H: células hipóxicas. HP: parthenolide tratada células hipóxicas. * Las células hipóxicas tratadas partenolida
vs células hipóxicas
.
Tal como se describe en la Figura 1A, la regulación HIF3α era específico de célula y su expresión se limitaba a las células DU145 entre los modelos de tumores de próstata examinados. Hemos investigado si NF-kB juega un papel también en la activación dependiente de hipoxia de HIF3α y se observó que disminuyó significativamente parthenolide nivel nuclear HIF3α después de 48 h de estimulación hipóxica (~ 65%, P & lt; 0,01). (Figura 6B)
en conjunto, estos datos ponen de manifiesto que parthenolide puede afectar a la activación HIF1α hipóxico sólo en las células tumorales, donde NF-kB es sensible a la privación de oxígeno. Se observa un efecto inhibidor de parthenolide también en HIF3α.
Papel de HIF1α en la remodelación del fenotipo proinflamatorio en las células DU145. Acción combinada de HIF1α desmontables y parthenolide
A diferencia de LNCaP, en las células DU145 y PC3 menos diferenciadas, ruta de NF-kB estaba profundamente involucrado en la remodelación del fenotipo proinflamatorio en condiciones de hipoxia. Para definir la contribución de HIF1α en este proceso, hemos creado clones desmontables HIF1α estable (HIF1α shRNA) a partir de células DU145. La Figura 7A muestra el nivel de proteína HIF1α nuclear en peso, en las células transfectadas vector NTshRNA y en una HIF1α shRNA clon representativo transfectadas de los tres elegidos para los experimentos, después de 4 h la privación de oxígeno. El muy bajo nivel de proteína nuclear en desmontables células HIF1α deriva de 87% ± 1 gota media de HIF1α ARNm (datos no mostrados). En cuanto a células de tipo salvaje, que caracteriza NTshRNA y HIF1α shRNA clones en normoxia e hipoxia para el nivel de ARNm y proteína nuclear de HIF2α y HIF3α y para el estado de NF-kB. desmontables células HIF1α confirmaron HIF2α falta de respuesta al tratamiento de hipoxia en nuestras condiciones experimentales (datos no mostrados). Tanto mRNA HIF3α y proteínas fueron inducidos por la hipoxia sostenida en un grado mucho menor que en las células wt (figuras 7B, 7C). Por otra parte, parthenolide no afectó significativamente HIF3α nivel de proteína nuclear después de la estimulación 48 h de hipoxia (Figura 7C). También en HIF1α desmontables células hipoxia mejorado la actividad de NF-kB como se muestra por el aumento del nivel nuclear de p50 y p65 en 1% de oxígeno (Figura 7D), incluso si el tiempo de activación fue más corta que en las células WT.
a de tipo salvaje, y NTshRNA HIF1α shRNA transfectadas DU145 células se mantuvieron en normoxia y en condiciones de hipoxia (1% O
2) durante 4 h. contenido HIF1α se midió en la fracción nuclear mediante análisis de inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control de carga. C: células no tratadas de control de normoxia. H: células hipóxicas. células de tipo salvaje y B HIF1α shRNA se mantuvieron en normoxia y en condiciones de hipoxia para 24, 48 y 72 h. nivel de ARNm para HIF3α se analizó por PCR en tiempo real y normalizado para la limpieza de genes 18S rRNA. El gráfico muestra la relación entre la expresión en las células tratadas hipoxia con respecto a los cultivos de células de control de normoxia (fijado en 1). Los valores medios ± SE. las células de tipo salvaje y C HIF1α shRNA se mantuvieron en normoxia y en condiciones de hipoxia durante 48 h en presencia y ausencia de 5 mM parthenolide. El contenido de proteína nuclear HIF3α se detectó mediante análisis de inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control de carga. C: células no tratadas de control de normoxia. P: células normoxic partenolida tratada. H: células hipóxicas. HP: parthenolide tratada células hipóxicas. células D HIF1α shRNA se mantuvieron en normoxia y en condiciones de hipoxia para 1, 2 y 4 h. El contenido nuclear de p50 y p65 se detectó mediante análisis de inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control de carga. El análisis densitométrico de p50 y p65 en relación con ß-actina se expresó como unidades arbitrarias y muestra como veces de inducción con respecto a los cultivos de células de control de normoxia (establecidos en 1). Los valores medios ± SE. * Las células hipóxicas HIF1α shRNA
vs
HIF1α shRNA de control de normoxia.
A continuación, mide la expresión de los genes relacionados con la inflamación seleccionados en experimentos de evolución temporal de la aguda (2, 4 h ) y crónica (24, 48, 72 h) estimulación hipóxica en ausencia y en presencia de 5 mM parthenolide. Como era de esperar, las células NTshRNA no difirieron significativamente de las células wt en todos los parámetros analizados (datos no mostrados). Por lo tanto, se agruparon los datos obtenidos tanto en peso como en las células DU145 NTshRNA. Resultados en las células HIF1α shRNA fueron bastante diferentes. Se compararon los valores con los obtenidos en las células WT expresando los niveles de ARNm de cada gen en las células HIF1α shRNA como veces de inducción con respecto al nivel de normoxia media observada en las células WT que se estableció en 1. La figura 8A resume nuestros hallazgos para VEGF, RAGE, PTX3, COX2 y CXCR4 expresión génica en los puntos de tiempo en los que la hipoxia ejerce su máximo aumento en la transcripción (2 h para PTX3, 48 h para VEGF, COX2 y CXCR4). valores Normóxico VEGF y ARN PTX3 fueron significativamente inferiores en caída en comparación con las células WT, lo que confirma el papel de HIF1α en su expresión basal. La hipoxia significativamente upregulated VEGF, COX2 y expresión CXCR4 a niveles comparables a los observados en las células WT. PTX3 también fue inducida por la hipoxia, pero en menor medida con respecto a las células wt. No se observó la inducción hipóxica de la expresión de RAGE. Cinco M parthenolide contrarresta significativamente la regulación positiva de genes de VEGF, la PTX3, COX2 y CXCR4 en un grado similar a lo observado en las células WT.