Extracto
El cáncer de endometrio es la neoplasia ginecológica más comúnmente diagnosticado en todo el mundo; sin embargo, el microentorno del tumor, especialmente las células de fibroblasto que rodean las células del cáncer, es poco conocida. Establecimos cuatro cultivos primarios de fibroblastos de tejidos humanos de cáncer de endometrio (fibroblastos asociados al cáncer, CAF) mediante el aislamiento de perlas magnéticas anticuerpo conjugado. Estos cultivos de fibroblastos relativamente homogéneas expresan marcadores de fibroblastos (CD90, vimentina y alfa-actina de músculo liso) y hormonales (estrógeno y progesterona) receptores. Los medios condicionados recogidos de CAF indujeron una proliferación dependiente de la dosis tanto de cultivos primarios y líneas celulares de cáncer de endometrio
in vitro
(175%) en comparación con células no tratadas, en contraste con los de células de fibroblasto normal del endometrio línea (51%) (
P Hotel & lt; 0,0001). Estos efectos no se observaron en cultivo de fibroblastos derivadas de tejidos de hiperplasia endometrial benignas, lo que indica la especificidad de los CAF en que afecta a la proliferación de células de cáncer de endometrio. Para determinar el mecanismo subyacente a los efectos diferenciales de fibroblastos, se comparó la activación de las vías en las células de cáncer de endometrio después del tratamiento con los medios de comunicación fibroblasts- y normal CAF acondicionado de PI3K /Akt y MAPK /ERK. Western blot mostró que la expresión de ambas formas fosforiladas de Akt y Erk fueron significativamente las reguladas en las células normales fibroblastos tratados, pero fueron reguladas /mantenido en las células tratadas con CAF. El tratamiento con inhibidores específicos LY294002 y U0126 invirtió la proliferación celular mediada por los CAF (
P
& lt; 0,0001), lo que sugiere un papel para de estas vías en la modulación de la proliferación de células de cáncer de endometrio. La rapamicina, que se dirige a una molécula de aguas abajo en la vía PI3K (mTOR), también suprimió la proliferación celular inducida por los CAF mediante la inducción de la apoptosis. el análisis de citoquinas de perfiles reveló que CAF secretan niveles más altos de proteína quimioatrayente de macrófagos (MCP) -1, la interleucina (IL) -6, IL-8, RANTES y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que fibroblastos normales. Nuestros datos sugieren que, en contraste con los fibroblastos normales, CAF pueden exhibir un efecto pro-tumorigénicos en la progresión del cáncer de endometrio, y PI3K /Akt y MAPK /ERK señalización pueden representar reguladores críticos en la forma endometrial células cancerosas responden a su microambiente.
Visto: Subramaniam KS, Tham ST, Mohamed Z, Woo YL, Mat Adenan NA, Chung I (2013) asociada al cáncer fibroblastos promover la proliferación de células de cáncer de endometrio. PLoS ONE 8 (7): e68923. doi: 10.1371 /journal.pone.0068923
Editor: John W Glod, Robert Wood Johnson Medical School Estados Unidos de América
Recibido: 8 Febrero 2013; Aceptado: June 3, 2013; Publicado: July 26, 2013
Derechos de Autor © 2013 Subramaniam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está financiado por la Universidad de Malaya Ayudas a la investigación RG336 /11HTM (Chung), HIR UM /MoHE /MED-12 (Chung) y HIR-MoHE e-00025 a 20001 (Mohamed). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio (CE) es el sexto cáncer más comúnmente diagnosticado entre las mujeres a nivel mundial, con aproximadamente 288.000 nuevos casos y 50,327 muertes que ocurren en todo el mundo cada año [1]. Es la neoplasia ginecológica más común en los Estados Unidos, con una estimación de 47.100 nuevos casos diagnosticados en 2012 [2]. De importancia, las tasas de incidencia y mortalidad por EC han ido en aumento en los países desarrollados y en desarrollo y se espera que aumente aún más con la creciente envejecimiento de la población y la prevalencia de la obesidad [3]. Aunque la supervivencia de cinco años para la CE es & gt; 85%, un subconjunto de tumores endometriales presentan un fenotipo agresivo, caracterizado por el alto grado histológico, la invasión linfovascular regional y metástasis a distancia. El pronóstico para este tipo de tumor es relativamente pobre, con una supervivencia de cinco años que van desde 16-66% [4].
Aproximadamente el 90% de los casos son esporádicos y la CE se clasifican en tipo 1 y tipo 2, de acuerdo con su etiología y comportamiento clínico [5]. Tipo 1 EC representa la mayoría de los casos esporádicos, que representan el 70-80% de los nuevos casos [5]. Tipo 1 cánceres, sobre todo en la histología endometrioide, a menudo son tumores de bajo grado con un pronóstico favorable. Estos cánceres a menudo se presentan con PTEN, K
ras Opiniones y mutaciones de beta-catenina y aumento de la expresión de los receptores de estrógenos [6]. Se sugiere que la exposición excesiva de estrógenos puede conducir a la hiperplasia atípica del endometrio (EH), una condición benigna de la glándula del endometrio proliferativo [7,8]. Por otra parte, atípica EH ha sido fuertemente asociada con la CE invasivo en las muestras de biopsia de endometrio hasta un 62%, lo que sugiere que atípica EH puede ser el precursor directo de endometrioide tipo 1 CE [9]. Sin embargo, la principal razón para el fracaso del tratamiento, tanto en el tipo 1 y 2 cánceres de endometrio es la propagación a distancia de los tumores primarios (metástasis) [10]. El mecanismo que conduce a esta transformación agresiva está aún por definir. Sin embargo, los estudios sobre otros tipos de tumores sugiere que los fibroblastos circundantes pueden tener un papel importante en la progresión del tumor [11,12].
En el tracto reproductor femenino, los fibroblastos pueden promover el desarrollo y la diferenciación epitelial [13,14]. Son responsables de la remodelación de la matriz extracelular y la producción de factores de crecimiento paracrinos que controlan la proliferación celular, la supervivencia y la muerte [15]. De hecho, la contribución de los fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) en la progresión de diversos tipos de cáncer se ha estudiado, por ejemplo, en el cáncer de próstata [16 a 18], cáncer de páncreas [12], cáncer de cabeza y cuello [19] y de mama cáncer [20]. En estos modelos de tumores, CAF mejoran la proliferación de células tumorales, la invasión y la quimio-resistencia. Por otra parte, también se cree CAF tener un papel importante en la modulación de la angiogénesis tumoral, infiltración de células inmunes y la colonización metastásica [21-23]. La participación de los fibroblastos en la progresión de la CE, sin embargo, es relativamente poco estudiada.
Caracterización de los factores de fibroblastos en el cáncer de endometrio, mientras que unos pocos, son principalmente de los análisis patológicos. factor de crecimiento de hepatocitos y la expresión cMet se correlacionó significativamente con etapas superiores de la CE, aunque no era pronóstico de peor supervivencia [24]. Otro estudio observó que la expresión de CXCR4 fue significativamente mayor en los tumores con infiltración muscular, un indicador de metástasis [25]. Curiosamente, el uso de cultivos primarios de los tejidos del endometrio, Arnold et al demostraron que la secreción a partir de células de fibroblastos endometriales normales inhibe la proliferación de células de Ishikawa, una línea celular CE humana [26]. Esta observación fue apoyada además por el grupo de Zhao en el que sugieren que tal efecto anti-proliferativo podría ser debido a la inhibición de PI3K señalización [27]. Sin embargo, todavía no se sabe si los CAF en CE exhibirán una propiedad anti-tumor como con fibroblastos endometriales normales, o un pro-tumor característico como con CAF de otros tipos de tumores.
Por lo tanto, en este estudio, se establecidas varios cultivos primarios de células de fibroblastos humanos de endometrio por los tejidos de la CE, para investigar los efectos de la CAF sobre la proliferación celular CE. Demostramos además que, al contrario de los fibroblastos normales del endometrio, CAF promueven la proliferación celular CE, en parte mediante la modulación de PI3K /Akt y MAPK /ERK vías de señalización. También probamos la utilización de la rapamicina, un inhibidor de mTOR, como un agente terapéutico potencial en la inhibición de la proliferación celular mediada por los CAF. El estudio proporciona nuevas pruebas dilucidar el papel pro-tumorigénicos de los fibroblastos en la tumorigénesis de la CE.
Materiales y Métodos
productos químicos y reactivos
U0126 y LY294002 se obtuvieron a partir de la célula Tecnología de señalización (MA, EE.UU.), y rapamicina (sirolimus) se adquirió de Clearsynth Labs (Mumbai, India).
declaración de Ética
el estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Malaya Médico Centro (Ref Nº 865.19). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes.
Los tejidos humanos y líneas celulares
Los tejidos de los cuatro tipos de cáncer de endometrio y una hiperplasia de tejido se obtuvieron de mujeres sometidas a cirugía para extirpar la parte del tumor de endometrio. Alrededor de 1 g de tejido se transportó al laboratorio en los medios de comunicación que consiste en RPMI 1640 (Life Technologies, NY, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Life Technologies, NY, EE.UU.) y 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies , Nueva York, EE.UU.). Los tejidos se desmenuzaron con el tamaño de 1 mm
3 y después se digirió con 2 mg /ml de colagenasa II para los tejidos de la CE y con colagenasa I para el tejido de hiperplasia (Worthington, Nueva Jersey, EE.UU.) en un rotador durante 1 hora a 37
° C. digestión Post, los tejidos se lavaron y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina a 37
° C. Los cultivos fueron mantenidos por los medios de comunicación cambian cada 72 horas y sub-cultivadas después de alcanzar la confluencia. líneas celulares de cáncer de endometrio humano, ECC-1 (CRL-2923) y HEC-1-A (HTB 112) y línea celular inmortalizada de fibroblastos endometrial humana normal, T-HESC (CRL-4003) se adquirieron de la American Type Culture Collection (Bethesda , MD, EE.UU.) y se cultivaron en los medios de comunicación de acuerdo con el protocolo del fabricante.
El aislamiento de las células epiteliales y estromales primarias
Todas las células primarias cultivadas obtenidas a partir de tejidos quirúrgicos fueron sometidos a aislamiento de células del estroma utilizando anti microperlas magnéticas -fibroblast (Miltenyi Biotech, Colonia, Alemania). En pocas palabras, 1x10
6 células fueron centrifugadas a 300x
g
durante 10 minutos. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 l de tampón que contiene una concentración final de 0,5% de albúmina de suero bovino y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético disueltos en pH 7,2, calcio y solución salina tamponada con fosfato libre de magnesio y se incubaron con 20 l de anticuerpo microperlas anti-fibroblastos humanos (Miltenyi Biotec, CA, EE.UU.) durante 1 hora. Las células se separaron entonces usando MiniMACS ™ separador de células (Miltenyi Biotec, CA, EE.UU.). a continuación, se continuaron siendo cultivadas en los medios mencionados anteriormente células aisladas. Las células epiteliales de la población también se recolectó usando un método similar, usando CD326 humana (EpCAM) anticuerpo microperlas magnéticas (Miltenyi Biotec, CA, EE.UU.).
La citometría de flujo análisis
se tripsinizaron las células cultivadas y 1x10
6 única suspensión celular se bloqueó con 10% de suero normal de cabra (BioWest, Nuaillé, Francia) antes de la tinción con AlexaFluor 647 (AF647) y conjugado con la molécula de adhesión celular epitelial humana (EpCAM) y PE conjugado con anticuerpos CD90 humano (BioLegend, San Diego, EE.UU.). controles de isotipo utilizados fueron AF647 ratón IgG2b, κ y PE ratón IgG1, κ, respectivamente. a continuación, se analizó mediante tinción de flujo BD FACSCanto II citómetro y los resultados fueron vistos usando el software FACS Diva (BD Bioscience, California, EE.UU.).
PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR)
El ARN total se extrajeron a partir de células cultivadas utilizando Trizol (Invitrogen, California, EE.UU.) y 1 mg de ARN se convirtió en ADNc usando Dynamo cDNA síntesis kit (Finnzymes, Vantaa, Finlandia). Secuencia de cebadores utilizados para detectar marcadores de células epiteliales (EpCAM, E-cadherina, citoqueratina 8) y marcadores de células de fibroblastos (alfa-actina de músculo liso (α-SMA) y vimentina) se enumeran en la Tabla 1. QRT-PCR se realizó utilizando ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, California, EE.UU.) en 35 ciclos utilizando 5x CALIENTE FIREPol EvaGreen qPCR Mix (Solis Biodyne, Tartu, Estonia), 10 pmol /l adelante y atrás cebador, 10 ng /l plantilla de ADNc y PCR grado H
2O. Los ensayos se realizaron al menos por triplicado, y los valores medios se utilizaron para calcular los niveles relativos de expresión utilizando el método ΔΔC (t). Los niveles de expresión se normalizaron primero a la limpieza gen GAPDH. A continuación, la expresión de genes a prueba en las células epiteliales se comparó con el nivel de ARNm correspondiente observado en una células de fibroblastos representativos (T-HESC), y de manera similar, los genes reportados expresado en células de fibroblastos se compararon con su nivel de ARNm correspondiente en una células epiteliales representativos ( ECC-1).
génica
cebadores
Fuente
EpCAMForward5'-AATGTGTGTGCGTGGGA-3 '[79] Reverse5'-TTCAAGATTGGTAAAGCCAGT-3'E-cadherinForward5'-TTTGTACAGATGGGGTCTTGC-3' [80] Reverse5 '-CAAGCCCACTTTTCATAGTTCC-3'Cytokeratin 8Forward5'-CTGGTGGAGGACTTCAAGAAC-3' [81] Reverse5'-GACCTCAGCAATGATGCTGTC-3'αSMAForward5'-GACGAAGCACAGAGCAAAAGAG-3 '[82] Reverse5'-TGGTGATGATGCCATGTTCTATCG-3'VimentinForward5'-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3' [83 ] Reverse5'-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3'Table 1.
Los cebadores secuencias y usados para QRT-PCR.
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Preparación de fibroblastos de células acondicionado medios
células
fibroblastos se sin semillas y se cultivaron en medio completo durante 24 horas, antes de ser cultivadas en un medio que contiene 2% de FBS durante las siguientes 72 horas. El medio acondicionado se recogió mediante Amicon filtros centrífugos Ultra (Merck Millipore, Massachusetts, EE.UU.) mediante centrifugación a 5000x
g
a las 4
° C durante 1 hora. La proteína en los medios de comunicación concentrado se cuantificó usando el ensayo de Bradford (Biorad, CA, EE.UU.).
Metil tiazolilo tetrazolio (MTT) ensayo de
proliferación de las células epiteliales se evaluó por metilo tiazolilo tetrazolio (MTT) prueba. Brevemente, las células se sembraron en medio completo en 1-3 x10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos. A las 24 horas después de la siembra, las células se trataron con cualquiera de los medios completos, medios de comunicación con 2% de FBS, los medios de fibroblastos acondicionado y /o inhibidores durante 72 horas. Al final del tratamiento, se añadieron 20 l de solución de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo. Después de 4 horas de incubación a 37
° C, se añadieron 100 l de 10% de dodecil sulfato de sodio para disolver los cristales de formazán por 4 horas adicionales de incubación a 37
° C. La absorbancia se midió usando el espectrómetro a 575 nm con referencia de 650 nm.
Total de la extracción de proteínas y Western blotting
células ECC-1 se sembraron a 1x10
4 células /pocillo en 6- pocillos en medio completo. A las 24 horas después de la siembra, las células se trataron con medio completo, los medios de comunicación con 2% de FBS, los medios de comunicación y /o inhibidores de fibroblastos acondicionado durante 72 horas. Proteína lisados se recogieron por raspado de las células en tampón de lisis frío que contenía concentración final de 0,1% de Triton-X, SDS al 0,1%, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 1x fosfatasa e inhibidores de proteasa 1X. La concentración de proteína se cuantificó usando el ensayo de Bradford (BioRad, CA, EE.UU.). Aproximadamente 20 g de proteína se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10% antes de ser transferido a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Los anticuerpos utilizados fueron conejo anti-Akt, fosfo-Akt, Erk, fosfo-ERK y β-actina (Cell Signaling Technology, EE.UU.). Las transferencias se visualizaron utilizando ECL primer reactivo de detección de transferencia Western (Amersham, GE Healthcare Lifesciences, Suecia) utilizando el sistema de documentación de geles (BioSpectrum 410, UVP) y el software Vision Obras LS (CA, EE.UU.)
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Los niveles de fosforilados-Akt y Erk-fosforilada en células ECC-1 tratados con 1 mg /l de medios acondicionado de T-HESC y CAF se cuantificaron utilizando kits de ELISA (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.). Brevemente, placas de 96 pocillos se recubrieron con anticuerpo de captura diluido durante la noche, antes de bloqueo y la incubación con lisados de células durante 2 horas cada una. anticuerpo de detección diluido se incubó durante 1 hora antes de la incubación de anticuerpo secundario durante otros 30 minutos. A continuación se añadió sustrato TMB a cada pocillo durante 15 minutos para el desarrollo del color antes terminados con solución STOP. Se leyó la absorbancia a la longitud de onda de 450 nm usando el espectrómetro (Tecan Systems, CA, USA). Los datos mostrados son la media de al menos tres réplicas se normalizaron con las lecturas de las células ECC-1 tratados con medios que contenían FBS al 2%.
Identificación y medición de los niveles de citoquinas
Las citocinas secretadas por los fibroblastos normales (T -HESC) y fibroblastos asociados al cáncer (CAF de CE6, 7 y 11) se midieron utilizando RayBiotech Quantibody citocina humana array (RayBiotech, Georgia, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, el medio acondicionado se preparó a partir de fibroblastos de 72 horas-cultivadas como se describe anteriormente. Se añadió 100 g de proteína de cada una secreción de fibroblastos en respectiva matriz pocillo y se incubó durante la noche a 4 ° C. Cada pocillo se lavó, se incubaron con cóctel de anticuerpos reconstituida durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavó otra vez, antes de la adición de estreptavidina-Cy3 conjugado. Después de un extenso lavado adicional, la señal de fluorescencia se midió utilizando el escáner de alta resolución de microarrays Agilent (modelo C), y datos de la señal en bruto se extrajeron de imagen TIFF con GenePixPro 6.1 antes analizada con Q-Analyzer. Los niveles de citocinas de cada secreción de fibroblastos se compararon con los medios de comunicación que contiene 2% de FBS (control). Los datos mostrados para cada muestra eran de la media de la intensidad de fluorescencia de cuatro pozos de matriz.
El análisis estadístico
El análisis estadístico que evalúa las diferencias entre las medias de grupo de control y de ensayo se realizó a través de Student
t
test de IBM SPSS Statistics 20. Un
P-valor
. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
resultados
el aislamiento de los fibroblastos asociados con el cáncer las células de los tejidos de cáncer de endometrio humano
Para establecer células de fibroblastos primarios a partir de tejidos de endometrio, cáncer de endometrio (CE) tejidos humanos (EC6, 7, 11 y 14) se digirieron con colagenasa, seguido de aislamiento de células usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo anti-fibroblastos. Para EC6 y EC14, las células seleccionadas negativamente se sometieron luego a perlas magnéticas conjugadas-CD326 anti por enriquecimiento de la contraparte epitelial. Los aislados de células epiteliales y fibroblastos fueron designados como 'Ep' y 'Fib', respectivamente. Como se muestra en la Figura 1, había una clara diferencia en la morfología entre las células epiteliales (CE6-EP y EC14-EP) y células de fibroblastos (CE6-Fib, EC7-Fib, Fib-EC11, EC14-Fib). Las células epiteliales expuestas aumentaron morfología en forma de pétalos y tienden a crecer en colonias, mientras que las células del estroma muestran rasgos alargados en forma de huso
hematoxilina & amp.; eosina (H y E) tinción de los tejidos y las imágenes de contraste de fase de células primarias establecidas aislados de cáncer de endometrio: EC6 (A), EC14 (B), EC7 (C) y EC11 (D). Ampliación: 100x. Posteriormente éstos fueron digeridos con colagenasa y se cultivan, antes de la epiteliales y fibroblastos de aislamiento de células CD326 usando (EpCAM) y anti-fibroblastos marcado perlas magnéticas.
Para determinar la pureza de los cultivos de células epiteliales y fibroblastos aislados , las células teñidas con ambos marcadores epiteliales, Alexa Fluor 647 conjugado con EpCAM y fibroblastos marcador, anticuerpos CD90 conjugado con PE. línea celular de cáncer de endometrio humano adenocarcinoma, ECC-1 mostró una elevada expresión de EpCAM (98%), mientras que, la línea celular de fibroblastos de endometrio humano normal, T-HESC demostró una alta expresión de CD90 (74%) (Figura 2 A, D). La tinción con controles de anticuerpos de isotipo mostró una unión mínima, lo que indica la especificidad de los anticuerpos primarios (datos no mostrados). Las células epiteliales aisladas de EC6 y 14 (EC6-Ep y EC14-Ep) mostraron una expresión moderada de EpCAM (55%) sin evidencia de expresión CD90, lo que indica que esta cultura epitelial no estaba contaminado con células de fibroblastos (Figura 2B, C). Por el contrario, las células de fibroblastos aislados de tejidos CE (CE 6-Fib, EC7-Fib, Fib-EC11, EC14 y-Fib) fueron negativas para la expresión de EpCAM pero altamente positivo para el CD90 marcador de fibroblastos (75-81%), lo que indica que las células de fibroblastos aislados eran relativamente puro y libre de contaminación de células epiteliales (Figura 2E-H). Todas las células primarios utilizados fueron a continuación paso 10 posterior cultivo, para mantener el fenotipo más cerca de los tejidos primarios.
citometría de flujo de las células epiteliales y fibroblastos primarios aislados a partir de tejidos de cáncer de endometrio se realizó después de etiquetado de las células con anticuerpo de CD326 conjugada con AlexaFluor647 y CD90-anticuerpo conjugado con PE. Epitelial línea de células de endometrio, ECC-1 (A), las células epiteliales EC6-Ep (B) y EC14-Ep (C), la línea de células del estroma endometrial normal de primaria, T-HESC (D) y células de fibroblastos primarios, EC6-Fib ( e), caracterización molecular EC7-Fib (F), EC11-Fib (G) y EC14-Fib (H).
de cultivos primarios de endometrio
Para caracterizar mejor el aislado células epiteliales y fibroblastos, se realizó RT-PCR cuantitativa para determinar la expresión de varios marcadores epiteliales y fibroblastos. Epitelial EC6-EP y EC14-EP células mostraron alta expresión de EpCAM, citoqueratina 8 y E-cadherina, con baja expresión de vimentina y α-SMA (Figura 3A, B). El nivel de expresión se muestra se normalizó con el nivel de GAPDH. Por el contrario, las cuatro células de fibroblastos aislados de los tejidos de cáncer de endometrio (CE6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib y EC14-Fib) mostraron una mayor expresión de vimentina y α-SMA, con baja expresión de EpCAM, E-cadherina y citoqueratina 8 (Figura 3A-C). Estos datos sugirieron que hemos tenido éxito en el aislamiento de las células epiteliales relativamente puros con sus homólogos de fibroblastos de los tejidos de cáncer de endometrio
.
El ARN total fue sometido a cuantitativa en tiempo real PCR análisis de marcadores epiteliales (EpCAM, citoqueratina 8, E -cadherin), los marcadores de fibroblastos (músculo actina alfa-liso (αSMA), vimentina) (A-C), receptor de estrógeno 1 y 2 (ER1, 2), receptor de progesterona (PR), progestágenos asociada a la proteína endometrial (PAEP) y metaloproteinasa de la matriz 1 y 9 (MMP1, 9) (D-F). Los datos, la media; barras de error, s.e.m. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Además, también se determinó que tanto las células epiteliales y fibroblastos a partir de los tejidos de la CE expresaron diversos grados de receptores de estrógeno y progesterona (ER1, ER2 y PR) (Figura 3D-F), en consonancia con la observación de que la CE son tumores sensibles a hormonas. Se midió la expresión de ARNm de tres proteínas comúnmente secretadas por el endometrio, la proteína progestágeno asociado endometrial (PAEP) y metaloproteinasas de matriz 1 y 9 (MMP1, 9) en estas células. Como se muestra en la figura 3D-F, PAEP se expresa principalmente por los fibroblastos, y se observó una mayor expresión MMP1 comparación con la de MMP9 tanto en las células epiteliales y fibroblastos. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren fuertemente que estas células epiteliales y fibroblastos primarios se mantienen sus
in vivo
fenotipos.
Efectos diferenciales de la secreción de fibroblastos de endometrio en las células de cáncer de endometrio
se había demostrado previamente que las secreciones de células de fibroblastos normales del endometrio eran inhibidor del crecimiento de la línea celular de cáncer endometrial, Ishikawa células [26]. Consistentemente, medio condicionado de la línea celular T-HESC fibroblastos endometrial normal, inhibió la proliferación de ECC-1 y HEC-1A, de una manera dependiente de la dosis (Figura 4A, B). A 2 g /l, se observó una inhibición significativa del crecimiento del 51% y 69% en ECC-1 y HEC-1A, respectivamente. Del mismo modo, las células de cáncer de endometrio primarias, EC6-EP y EC14-EP eran el crecimiento inhibido por T-HESC medio condicionado (CE6-Ep: 60%; EC14-Ep: 67%). (Figura 4 C, D)
ECC-1 (A) y HEC-1A (B) líneas celulares y EC6-Ep (C) y EC14-EP (D) células de cáncer de endometrio primarios fueron probados con medio acondicionado preparado a partir de los fibroblastos asociados con el cáncer (EC6-Fib , EC7-Fib, Fib-EC11 y EC14-Fib) y normal línea celular de fibroblastos de endometrio (T-HESC) durante 72 horas. La viabilidad celular se examinó mediante ensayo de MTT y se normalizaron con el control (medio que contiene 2% de FBS). CAF que se muestran son la media de todas las cuatro fibroblastos asociados con el cáncer probados. Los datos, la media; barras de error, s.e.m. *,
P Hotel & lt; 0,005 ;. **,
P Hotel & lt; 0,0001. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Para determinar y comparar los efectos de las secreciones CAF sobre las células de cáncer de endometrio, que cosecharon los medios condicionados a partir de células de fibroblastos de 72 horas-cultivadas, y luego trataron ECC-1 y líneas celulares de cáncer de HEC-1A humanos endometriales durante 72 horas. Curiosamente, los medios condicionados a partir de fibroblastos asociados al cáncer (CE6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib y EC14-FIB) indujo un efecto de contraste: los crecimientos tanto de las células de cáncer de endometrio primarios (CE6-EP y EC14-Ep) y las células de cáncer de endometrio comerciales (ECC-1 y HEC-1A) fueron marcadamente mejorado de una manera dependiente de la dosis (Figura 4A-D). mayores efectos se observaron con líneas de células HEC-1A ECC-1 y que en los cultivos primarios, EC6-EP y EC14-Ep. Entre las CAF, EC-11-Fib demostró los efectos de la mayoría de las promotoras del crecimiento, que van del 135% al 274% de crecimiento en comparación con las células no tratadas. Cuando se combinaron estos efectos CAF individuales (etiquetado como CAF), no hubo una diferencia significativa del crecimiento celular mediado por ciento CAF y T-HESC a 2 g /l de tratamiento (
P
& lt; 0,05) (Figura 4A -D).
para excluir la posibilidad de que el CAF-efectos promotores del crecimiento se debió a nuestros procedimientos de cultivo celular, se aisló de fibroblastos de un tejido hiperplasia atípica, una condición benigna endometrio, con el enfoque similar. Los fibroblastos aislados (EH-Fib), presentaron una morfología fibroblástica similares
in vitro
, y expresó alto nivel de CD90 (65%) (Figura 5A-C). El uso de los medios condicionados a partir de estas células, se examinaron sus efectos sobre la proliferación celular tanto de las líneas celulares de cáncer (ECC-1 y HEC-1A) y células epiteliales primarias (CE6-EP y EC14-EP). Como se muestra en la Figura 5D, EH-Fib medio condicionado no afectó significativamente la proliferación de células ECC-1 y HEC-1A. Sin embargo, cuando se probó en células epiteliales primarias EC6-EP y EC14-EP, EH-Fib inhibe el crecimiento de una manera dependiente de la dosis, con un promedio de 69% a 2 g /l de concentración (Figura 5D). Estos datos sugieren que los efectos de estimulación del crecimiento por CAF es específico, y no debido a la selección por nuestro procedimiento experimental.
hematoxilina y eosina (A) y la imagen de contraste de fase (B) de células de fibroblasto humano aislado a partir de hiperplasia atípica (EH-Fib); Magnificación, 100x. (C) La citometría de flujo análisis de EH-Fib teñidas con marcadores epiteliales CD326-Alexa Fluor 647 y el marcador de fibroblastos CD90-PE. (D) ensayo de viabilidad celular determinar los efectos de EH-Fib medio condicionado de las líneas celulares de cáncer de endometrio (ECC-1 y HEC-1A) y células epiteliales primarias (EC6-Ep y EC14-Ep) después del tratamiento de 72 horas. Los datos, la media; barras de error, s.e.m. *,
P Hotel & lt; 0,01. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
La activación de PI3K /Akt y MAPK /ERK vías de proliferación de las células del cáncer endometrial de fibroblastos mediada asociada al cáncer
Para dilucidar el mecanismo subyacente el crecimiento efectos de promoción de la secreción de CAF en CE, se determinó la activación de PI3K /Akt y MAPK /ERK, dos importantes vías de supervivencia implicado en el cáncer de endometrio. De acuerdo con el estudio anterior [27], el tratamiento de fibroblastos normales medios T-HESC acondicionado marcadamente reducida fosfo-Akt y expresión de la proteína fosfo-ERK en células ECC-1, como se muestra con Western blot y ensayos de ELISA (Figura 6A, B). Por el contrario, el nivel de proteína fosfo-Akt fue moderadamente elevado cuando las células CEC-1 se trataron con EC6-Fib, EC7-Fib, Fib-EC11 y EC14-Fib (Figura 6 A, B). Además, los CAF-tratada ECC-1 en las células demostró también aumentó el nivel de fosfo-ERK, en comparación con los tratados con los medios de control (Figura 6 A, B).
(A) Western blot de phosphorylated- Akt (Ser473) y la expresión de la proteína en las células -Erk ECC-1 después de tratarse con cualquiera de las células T-HESC fibroblastos normales de endometrio o células de fibroblastos asociados al cáncer (CE6-Fib, EC7-Fib, Fib-EC11 y EC14-FIB). Densitometría análisis comparó el nivel de expresión relativa de p-Akt y Erk-p a su nivel de proteína total. (B) Análisis cuantitativo de fosforilados-Akt (Ser473 y Thr308) y los niveles-ERK fosforiladas en células ECC-1 después de tratarse con cualquiera de T-HESC o CAF, en comparación con las células tratadas con control (medio que contiene 2% de FBS). ECC-1 (C) y EC6-EP (D) las células se trataron con PI3K vía inhibidor selectivo (LY294002) o Erk vía inhibidor selectivo (U0126) en presencia de los fibroblastos asociados con el cáncer acondicionado medios de comunicación (1 g /l) para 72 horas. Los datos mostrados son la viabilidad celular después normalizaron con el control (medio que contenía FBS al 2%). Los datos, la media; barras de error, s.e.m. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,0001. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes.
Para investigar más a fondo el papel funcional de PI3K /Akt y MAPK /ERK vías en la proliferación celular mediada por CAF, el próximo trataron ECC-1 y EC6-Ep células con inhibidor selectivo de PI3K (LY294002) y ERK inhibidor selectivo (U0126), en presencia de CE6-Fib y los medios EC11-Fib acondicionado durante 72 horas. Tanto LY294002 y U0126 reducen significativamente la proliferación celular mediada por CAF en estas células (
P
& lt; 0,0001) (Figura 6C, D). Notablemente, U0126 causó un mayor efecto inhibidor del crecimiento en células EC tratados con EC11-Fib medio acondicionado. Los efectos de LY294002 y U0126 en la inhibición de la proliferación de células de cáncer endometrial sólo fue evidente en presencia de medios de comunicación secreción CAF, ya que estos inhibidores afectados mínimamente la proliferación celular en los medios de control (Figura S1). Estos inhibidores también ejercen efectos similares sobre otras células EC, HEC-1A y EC14-EP (Figura S1). Estos datos sugieren que el estado de activación de PI3K /Akt y /o vías de MAPK /ERK puede ser el punto clave por la cual los fibroblastos de ambas condiciones normales y cancerosas regulan la proliferación de células de cáncer de endometrio.
Además, evaluó si la rapamicina, un inhibidor de PI3K conocido aguas abajo, puede ser clínicamente útil en la inversión de la proliferación celular mediada por los CAF CE. En presencia de EC11-Fib acondicionado medios de comunicación, el tratamiento de la rapamicina por 72 horas efectivamente inhibida ECC-1 y la proliferación de células EC6-Ep (
P
& lt; 0,0001) (Fig. 7A, B). A la dosis más alta probada (2 M), la rapamicina reduce las células de un 180% (acondicionado de tratamiento medio solo) a 40% (medios de comunicación y la rapamicina acondicionado de tratamiento) (
P Hotel & lt; 0,0001) 1-ECC, mientras que el mínimo se observó una inhibición cuando las células se cultivaron en medio de control (figura 7A, B). resultado similar se observó con los efectos de la rapamicina sobre otras células CE, HEC-1A y EC14-Ep (Figura S2). El uso de etiquetado anexina V, se determinó además que la rapamicina inhibe CAF-proliferación celular mediada CE
a través de
inducción de la apoptosis (Figura 7C-E). El tratamiento de ECC-1 con 1 g /l EC11-Fib medio condicionado durante 72 horas no afectó significativamente el porcentaje de células apoptóticas;