Extracto
Los fitoquímicos son una fuente rica de fármacos de quimioprevención, pero sus efectos sobre la modulación de la vía de señalización /β-catenina vía han permanecido en gran medida sin investigar. Aberrante de señalización Wnt activado puede dar como resultado la estabilización anormal de β-catenina, un paso causal clave en un amplio espectro de tipos de cáncer. Aquí se presenta la modulación de la señalización canónica de Wnt /β-catenina-cloruro de litio activado por fitoquímicos que tienen propiedades antioxidantes, anti-inflamatorias o quimiopreventivos. Los compuestos fueron seleccionados en primer lugar con una línea celular HeLa de cáncer cervical derivados estables de Wnt reportero de señalización. éxitos positivos fueron evaluados posteriormente para la degradación de β-catenina, la supresión de β-catenina nuclear localización y regulación a la baja de los objetivos oncogénicos aguas abajo de la vía /β-catenina vía. Nuestro estudio muestra una nueva ruta de degradación de la proteína β-catenina en las células HeLa por avenantramida 2p (un polifenol) y Triptolida (un triepóxido diterpeno), respectivamente, de la avena y una planta medicinal china. Los hallazgos presentes avenantramida 2p como un compuesto alimenticio quimiopreventivo potencial que merece más estudio utilizando
in vivo y modelos de cáncer; sino que también proporcionan una nueva perspectiva sobre el mecanismo de acción de triptólido
Visto:. Wang D, Wise ML, Li F, M Dey (2012) Los fitoquímicos Atenuación aberrante La activación de β-catenina en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e50508. doi: 10.1371 /journal.pone.0050508
Editor: Yuntao Wu, de la Universidad George Mason, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Septiembre, 2012; Aceptado: 22 Octubre 2012; Publicado: 3 de Diciembre, 2012
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Financiación:. El trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R00AT4245 (a MD), USDA /SD-AES subvención 328100/318000 (a MD), SDSU AES Fondo 3AH203 (a FL) y NIH AI076125 subvención (a FL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los miembros de la familia de factores de crecimiento Wnt secretadas juegan un papel importante durante la embriogénesis por la proliferación de regulación, la migración, la polaridad del tejido, y la organogénesis, y contribuyen al desarrollo del sistema genitourinario. En la vía Wnt canónica, β-catenina actúa como el componente central [1]. La unión de Wnt a su receptor (frizzled) y co-receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP5 /6) inhibe la formación del complejo de proteína que incluye axina, la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3), y el poliposis adenomatosa coli ( APC). Esta inhibición da lugar a la acumulación de β-catenina en el citoplasma que se transloca posteriormente al núcleo [2]. En el núcleo β-catenina se une al factor de células T (TCF) que conduce a la transcripción de los genes diana de Wnt [3]. Esta señalización β-catenina aberrante se ha observado en una variedad de cánceres humanos, incluyendo la mayoría de los cánceres colorrectales, aproximadamente la mitad de los cánceres de próstata y un tercio de los melanomas [4].
La β-catenina también acelera el virus del papiloma humano tipo 16 mediada por la carcinogénesis cervical en ratones transgénicos
[
5
]
.
Curiosamente β-catenina se cree que influyen en la metastásico potencial de las células tumorales al afectar remodelación de la cromatina [6], así como modular la respuesta de estrés oxidativo en las células [7]. Por lo tanto, la atenuación de la activación constitutiva de la vía de señalización de β-catenina se ha convertido en un objetivo atractivo para la terapia contra el cáncer y la prevención.
compuestos de origen natural representan candidatos atractivos para su desarrollo como agentes quimiopreventivos cuando está respaldada por los resultados basados en la evidencia y la investigación mecanicista. En particular, los agentes dietéticos eludir la necesidad de introducción adicional de compuestos extraños en individuos asintomáticos sanos. agentes dietéticos también, en general, son menos tóxicos, más fácilmente biodisponible, más accesible, y menos caro en comparación con agentes sintéticos. En los últimos años, varios laboratorios han identificado numerosos fitoquímicos que tienen propiedades biológicas potencialmente útiles; Sin embargo, sólo unos pocos grupos han evaluado directamente la capacidad de estos agentes para perturbar la señalización de Wnt-catenina mediada por β [4]. En este estudio se presenta la modulación de cloruro de litio (LiCl), activado por Wnt /β-catenina señalización por fitoquímicos con propiedades anti-oxidantes, anti-inflamatorias y quimiopreventivos. Se propone que la inflamación crónica persistente es un factor causante de una variedad de cánceres humanos. Si bien la erradicación y /o de la vacunación son estrategias razonables, tales esfuerzos pueden dejar de prevenir el cáncer en los casos que cursan con inflamación persistente con la reorganización del tejido y los cambios epigenéticos. Debido a la sobre regulación de ligandos de la familia Wnt y la baja regulación de los inhibidores endógenos de Wnt ocurrir durante las primeras etapas de la carcinogénesis, agentes anti-inflamatorios con el potencial para inhibir la vía de señalización Wnt canónica son agentes candidatos para la quimioprevención [8].
avenantramidas (Avns) son un grupo de polifenoles naturales que se encuentran de forma única, entre los cultivos de alimentos, en la avena, un cereal saludable populares [9], [10]. AVN 2p, 2f, y 2c son tres formas principales que han sido intensamente estudiados y han comprobado que poseen propiedades anti-irritantes y antioxidantes superiores [11], [12], [13], [14]. La biodisponibilidad de Avns se ha establecido en animales y seres humanos [11], [15]. Los tres congéneres Avns parecen ser asumido y distribuido entre los tejidos diferencialmente. El orden de rango de concentración de plasma por Avns por tipo es 2p & gt; 2f & gt; 2c [16]. La inhibición de la
vitro
de colon proliferación de células cancerosas y la activación de NFkB en las células endoteliales por estos compuestos se ha demostrado [9], [17]. Aquí se investigó el potencial
in vitro
actividad antiproliferativa y mecanismos celulares de Avns en células de cáncer cervical humano.
Phenethylisothiocyanate (fenil isocianato) es un isotiocianato bien estudiado, que se producen de forma natural en la forma de su precursor de glucosinolatos, gluconasturtina, en la familia Brassicaceae de verduras como la col, la coliflor, berros y el brócoli. Fenil isocianato mostró potencial quimiopreventivo contra diversos tipos de cáncer [18] y sin aparente toxicidad incluso cuando se administra en dosis altas en ratas y perros según lo determinado por NOEL (sin efecto adverso observado a nivel) en los estudios de seguridad de fármacos [19]. Hemos informado sus efectos anti-inflamatorios y mecanismos celulares asociadas [20], [21]. También se propone que PEITC puede suprimir la metástasis del cáncer [22]. Desde β-catenina se cree que influir en el potencial metastásico de las células tumorales [6], se evaluó cualquier efecto potencial de PEITC en la señalización de β-catenina.
triptólido, un triepóxido diterpeno, es un componente activo principal de los extractos derivado de la planta medicinal
tripterygium wilfordii Hook F.
triptolida tiene múltiples actividades farmacológicas, incluyendo anti-inflamatoria, la modulación inmune, actividad antiproliferativa y pro-apoptótica [23], [24], [25]. Triptólido ha sido ampliamente utilizado en milenios de edad tradiciones médicas practicado en China para enfermedades inflamatorias y autoinmunes, y más recientemente para el trasplante de órganos y tumores [26]. Triptólido puede inducir la apoptosis de las células tumorales directamente, así como potenciar la apoptosis inducida por agentes citotóxicos, tales como TNF-α, y agentes quimioterapéuticos mediante la inhibición de la activación de NFkB. Recientemente, las dianas celulares de triptólido, tales como MAP quinasa fosfatasa-1, proteína de choque térmico, 5-lipooxigenasa, la ARN polimerasa y la histona metil-transferasas, se han demostrado [23]. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, este compuesto bien estudiado y ampliamente utilizado no ha sido evaluada en la señalización de β-catenina. Por lo tanto, se incluyeron Triptolida en nuestro estudio actual.
Objetivo general de este estudio fue establecer conocimientos sobre mecánica de los fitocompuestos seleccionados relacionados con la señalización /β-catenina vía que pueden ser relevantes para una amplia gama de tipos de cáncer. Todos los experimentos se llevaron a cabo utilizando células HeLa de origen cáncer de cuello uterino humano (ATCC, Manassas, VA). Las células HeLa se co-infectados con el virus del papiloma que contribuyen a una respuesta inflamatoria persistente dentro de las células. Se cree que los virus del papiloma ser factores causantes de cáncer cervical humano. El genoma de HeLa ha sido notablemente estable después de años de cultivo continuo; Por lo tanto, las alteraciones genéticas detectadas pueden haber estado presentes en el tumor primario y reflejar eventos que son relevantes para el desarrollo de formas de cuello uterino y de otro tipo de cáncer humano [27]. Una línea celular estable que expresa reportero luciferasa de luciérnaga bajo la influencia del promotor de TCF se produjo y optimizado para controlar la activación transcripcional del complejo /TCF β-catenina en respuesta a la intervención con los compuestos de ensayo. Las investigaciones de seguimiento incluyen efectos de los compuestos sobre la proliferación celular, la degradación citosólica β-catenina, localización β-catenina nuclear y la expresión aguas abajo del factor de transcripción c-Myc. El Myc proto-oncogén codifica el factor de transcripción c-Myc, la mutación de los cuales contribuye a la génesis de muchos cánceres humanos. Como uno de los objetivos de abajo clave de complejo β-catenina-TCF, c-Myc juega un papel clave en la alteración del metabolismo celular durante la tumorigénesis [28]. Para todos los experimentos, la estabilización de β-catenina y la señalización de Wnt canónica se activaron usando LiCl. GSK-3 es una quinasa que fosforila β-catenina en el citoplasma que resulta en la inducción de la señalización Wnt canónica [29]. LiCl activa la vía /β-catenina canónica de Wnt mediante la inhibición de GSK-3 [30], [31], que es independiente de cualquier actividad del receptor /co-receptor. FH535 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) es un inhibidor de molécula pequeña de Wnt /β-catenina señalización [32], [33]. FH535 se utilizó en todos los experimentos como un inhibidor de Wnt conocido.
Materiales y Métodos
Los plásmidos, Químicos, líneas celulares y anticuerpos
Los plásmidos 7TFP (Addgene plásmido 24308), pCMVdR8.2 (Addgene plásmido 8455), y pCMV-VSV-G (Addgene plásmido 8454) se adquirieron de Addgene (Cambridge, MA). El vector p7TFP [34] es un replicación incompetente, vector lentiviral de auto-inactivación que contiene el promotor 7XTCF, el gen indicador de luciferasa de la luciérnaga y el casete de resistencia a la puromicina para la selección [34]. El plásmido pCMV dR8.2 [35] y pCMV-VSV-G [35], proteína de la envoltura de VSV-G codificación, se utilizaron como el sistema de empaque lentiviral para producir lentivirus 7XTFP infecciosas. El vector pGL4.75 que expresa el gen de luciferasa de Renilla se adquirió de Promega Inc. (Madison, WI). Triptólido, FH535, PEITC, LiCl, Hoechst y polibreno se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Puromicina, a otros antibióticos y medios de cultivo celular se compraron de Invitrogen (Grand Island, NY). Los reactivos utilizados en la PCR cuantitativa, incluyendo enzimas fueron suministrados por Applied Biosystems (Foster City, CA). la línea celular HeLa (CCL-2) y la línea celular HEK293 T (CRL-11268) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Anti β-catenina humana y anticuerpos beta-actina humanos anti se adquirieron de Millipore (Billerica, MA). DyLight 680 anti-ratón y DyLight 800 anti-conejo secundaria de anticuerpos se obtuvieron de Li-Cor Biosciences (Lincoln, NE).
Síntesis Química de Avns 2p, 2f y 2c de avena
Avns 2p, 2f y 2c se sintetizaron por métodos reportados previamente [36]. Brevemente, 5 mmol del fenilpropanoides apropiado (
p
ácido -coumaric, ferúlico o cafeico) en piridina se acetiló con anhídrido acético en exceso. Después de la reacción, se añadió agua fría y se recogió y se secó durante la noche el precipitante. Para la phenylpropanoid acetilado en dimetilformamida, con una pequeña cantidad de trietilamina, se añadió, gota a gota, una cantidad equimolar de benzotriazol-1-iloxi) tris- (dimetilamino hexafluorofosfato) fosfonio disuelto en CH
2Cl
2. Se añadió gota a gota ácido 5-hidroxi próxima antranílico (equimolar) en dimetilformamida. La reacción se detuvo con HCl 0.5. Después de la extracción de la acetoxyavenanthramide en acetato de etilo y la evaporación rotatoria hasta sequedad, los grupos acetilo protectores se eliminaron mediante la adición de 5% en CH pirrolidina
2Cl
2. La reacción de desprotección se inactivó con HCl 1 M y AVN extrajo en acetato de etilo. La purificación del Avns se efectuó mediante cromatografía en columna LH-20.
Cell Cultura y
La línea celular de cáncer cervical humano HeLa (ATCC, CCL-2), y las células 293T de riñón embrionario humano (ATCC , CRL-11268) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. HeLa 7TFP reportero línea celular estable se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg ml de estreptomicina, suero bovino /0,5 mg /ml de puromicina y 10% inactivado por calor fetal. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 ° con 5% de CO2. Las células se subcultivaron después de tripsinización cuando 90% de confluencia con una relación 01:05 de división. Para el ensayo de proliferación celular única, las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 g de suero bovino fetal /ml de estreptomicina, 5% inactivado por calor, y 50 mM 2-mercaptoetanol. Las células se sembraron a densidades diferentes como se describe en cada experimento. el recuento de células viables se llevaron a cabo mediante tinción con azul de tripano usando un hemocitómetro.
Lentiviral Producción y Reportero Estable Línea Celular Desarrollo
La producción de Lentiviral se llevó a cabo siguiendo un protocolo modificado de Steward
et. al.
[35]. Se utilizó una línea de células HeLa que lleva de forma estable casete reportero 7TFP lentiviral que contiene un Firefly gen indicador de luciferasa controlado por el promotor del gen TCF [34]. El casete entregado lentiviral también contiene un promotor impulsado por SV40 gen de resistencia a puromicina [34]. VSV-G pseudotyped lentivirus expresar 7TFP se produjeron en células HEK293T por co-transfección de pCMV VSV-G, p7TFP, y pCMV dR8.2. células HeLa infectadas con los lentivirus se incubaron en puromicina durante 2 semanas. Las células que sobreviven la selección de antibióticos se propagaron y se caracterizaron para la actividad de reportero Wnt. El lentiviral células HeLa reportero estable 7TFP transducidas eran estables para la actividad de reportero Wnt en al menos 20 pasajes (datos no mostrados) cuando se mantiene en medio de cultivo que contiene 0,5 mg /ml de puromicina.
Wnt reportero de ensayo
a de ensayo de luciferasa dual se utilizó para determinar el grado de activación de señalización Wnt midiendo mediada por β-catenina de transcripción TCF en células HeLa reportero estable 7TFP en respuesta a los tratamientos con los compuestos. En primer lugar, se realizó la transfección transitoria como se describe anteriormente [37]. células HeLa reportero 7TFP se cultivaron en placas de cultivo de 6 cm (2 × 10
6 células cada plato). Después de 1D, para cada plato, 1 g de pGL4.75 se mezcló con solución de transfección que contenía 3 l TransIT LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) y se añadió al cultivo. A las 24 h después de la transfección, se tripsinizaron las células, se resuspendieron y se sembraron en pocillos de una placa de 96 pocillos (2 × 10
4 células por pocillo). Seis horas más tarde, medio se reemplazó con nuevos medios que contienen tratamientos o con vehículo dimetilsulfóxido (DMSO). Después de 4 h de incubación, mM LiCl 50 se añadió a cada pocillo y se incubó durante un 8 h adicional.
La activación Wnt en las diferentes muestras se determinó por medición de la actividad de la luciferasa de la luciérnaga usando un kit de ensayo de luciferasa Dual Glo ( Promega, Madison, WI). actividad de la luciferasa de la luciérnaga se midió como la luminiscencia usando un híbrido lector Sinergia H4 (BioTek, Winooski, VT) en extractos de células, normalizadas para la actividad de luciferasa de Renilla, y se expresó como porcentaje de cambio en comparación con un LiCl tratada control positivo. Las concentraciones de los compuestos de ensayo y de sus períodos de incubación fueron de tratamiento ya sea pre-determinada usando experimentos de optimización separados (datos no mostrados) u obtenidos a partir de los informes anteriores [9], [20], [24], [32]. Importancia de las actividades compuestas se compararon sobre una base de uno-a-uno con respecto al control de LiCl (control positivo). Las células tratadas con vehículo (DMSO solamente) y no activadas mediante LiCl sirvieron como control negativo para la normalización de la señal de fondo. Los datos se expresaron como porcentaje de actividad de transcripción reportero Wnt en comparación con LiCl.
Ensayo de proliferación celular
La capacidad de las células HeLa para proliferar en respuesta a diversos tratamientos se midió utilizando CellTiter 96® acuosa One Solution Ensayo de proliferación celular (Promega Inc., Madison, WI), un método colorimétrico para determinar el número de células viables en proliferación. El ensayo utiliza un compuesto de tetrazolio [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones (fenazina etosulfato; PES). las instrucciones del fabricante y fue seguido tratamientos se compararon con el control del vehículo (células tratadas con DMSO) leyendo la absorbancia a 490 nm en un lector de placa multimodo BioTek Sinergia H4 (BioTek, Winooski, VT). Todos los datos mostrados son medias ± S.E. a partir de cuatro experimentos independientes.
inmunotransferencia
Las células HeLa (CCL-2, ATCC, Manassas, VA) se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
6 cada pocillo . El día siguiente, se retiró el medio y los nuevos medios que contienen concentraciones de compuestos de ensayo indicado (AVN 2p, FH535, o triptólido) o DMSO (control vehículo) se añadieron de nuevo. Después de 4 h, LiCl a una concentración final de 50 mM se añadió a los pocillos para un 8 h adicionales de incubación. La inmunotransferencia se llevó a cabo siguiendo un protocolo descrito por
Gao et. al.
[38]. Brevemente, las células fueron lisadas en helado RIPA [NaCl 150 mM, 50 mM Tris pH 8,0, EDTA 0,4 mM, 10% de glicerol, 1% Nonident P-40 (NP-40)], seguido por una breve agitación en vórtex y rotación para 30 min a 4 ° C. El sobrenadante se transfirió, y se aclaró por centrifugación. Cantidades iguales (v /v) de los lisados celulares se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, bloqueado y de doble sondaron durante la noche con el ratón anti β-catenina humana (1:2000 v /v) y de conejo anti β-actina humana ( 1:5000 v /v) de anticuerpos, y después se incubaron con 680 DyLight anti-ratón (1:5000 v /v) y 800 DyLight anti-conejo (1:5000 v /v) anticuerpos. Las transferencias fueron imágenes con un LI-COR sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).
Inmunofluorescencia y Nuclear Localization Ensayo
Las células HeLa fueron sembradas en una placa de 12 pocillos en una densidad de 2 × 10
5 cada pocillo. El día siguiente, el medio de cultivo se eliminó y se añadió de nuevo una concentración indicada de cada compuesto (AVN 2p, FH535, o triptólido) o DMSO. La concentración óptima de cada compuesto se pre-determinado por el ensayo de indicador de Wnt. Después de 4 h de incubación, mM LiCl 50 se añadió a los pocillos para un 8 h adicionales de incubación. La inmunofluorescencia se midió como se describe anteriormente [37]. Las células fueron immunostained con el ratón anti β-catenina (1:2000 v /v) anticuerpos secuencialmente. (1:1000 v /v) y de cabra anti-ratón DyLight 488 Los núcleos se tiñeron con colorante Hoechst (0,1 g /ml). Las imágenes se recogieron en
un microscopio de epifluorescencia EVOS FL (AMG, Bothell, WA)
.
Los datos de imágenes se expresaron como DyLight 488 (que indica la localización de β-catenina), Hoechst (núcleo indica) y Merge (superposición de DyLight 488 y la tinción de Hoechst para el mismo punto de vista). localización Núcleo de β-catenina se determinó por DyLight 488 tinción en el núcleo. Las células con presencia de β-catenina en el núcleo se contaron entre las 100 células para cada tratamiento.
Total RNA extracción, purificación y síntesis de cDNA
Extracción de ARN total, la purificación y la síntesis de ADNc eran realizado como se describe por Dey
et. Al
. anteriormente [21]. ARN total fue extraído a partir de células HeLa usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN fue tratado con ADNasa I (Invitrogen, Grand Island, NY) para eliminar cualquier rastro de contaminación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. RNA se cuantificó espectrofotométricamente por mediciones de absorción a 260 y 280 nm usando el sistema de Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Científicos, Waltham, MA). Los ADNc se sintetizaron usando 3 g de ARN para cada muestra usando MultiScribe transcriptasa inversa (Applied Biosystems, Foster City, CA), siguiendo el protocolo del fabricante.
cuantitativa en tiempo real PCR
cuantitativa en tiempo real PCR se realizó como se describe anteriormente [21]. Los ADNc sintetizados se diluyeron 2,5 veces. Se añadieron dos microlitros de cada muestra diluida a 0,5 l cebadores específicos de genes (6 M; oligos sintetizados por IDT Inc., Coralville, IA) y 12,5 l de SYBR Verde brillante mezcla maestra de PCR (2X) (Applied Biosystems, Foster City, CALIFORNIA). ROX se utilizó como un tinte interno. Para evitar la interferencia debida a la contaminación de ADN genómico, sólo se seleccionaron cebadores intrón-superpuestas usando el software versión 2.0 Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) como sigue (de avance y retroceso pares de los cebadores se indican como "F" y " R ", respectivamente): c-Myc (GenBank ID: NM_002467), F: 5'-caccagcagcgactctga-3 ', R: 5'-gatccagactctgaccttttgc-3'; β-actina (GenBank ID: NM_007393), F: 5'-ccaaccgcgagaagatga-3 ', R: 5'-ccagaggcgtacagggatag-3'. Las amplificaciones por PCR se realizaron en un sistema de Mx3005P (Stratagene, Santa Clara, CA). Un control no plantilla fue incluido en el programa de PCR como una etapa de control de calidad. Método estándar ΔΔCt se utilizó para el cálculo de cantidad de ARNm relativo con respecto al control provocada-LiCl (control positivo), que se normaliza a un valor de 1,0 como se describe por Dey
et. Al
. [21]. Un valor de menos de 1,0 indica transcripcional baja regulación (inhibición de la expresión génica) en comparación con el control positivo LiCl, que muestra la inducción genética máxima (1.0). Por lo tanto, los valores más bajos indican una mayor actividad inhibidora de Wnt. La amplificación de las transcripciones específicas se confirmó mediante la obtención de perfiles de curvas de fusión. Todas las muestras se realizaron por duplicado.
Análisis estadístico
Las observaciones experimentales se expresan como la media ± S.E. En todas las figuras, el significado de cualquier tratamiento sobre el control sin tratar (DMEM para la Fig. 1C, LiCl para la Fig. 2, DMSO para la Fig. 3, y LiCl para Figs. 4B, 5B y 6) se determinó por el estudiante de
t
prueba. Los tratamientos se consideraron significativamente diferentes si p & lt; 0,05 *, altamente significativo si p & lt; 0,01 * *, o extremadamente significativo si p & lt; 0,001 * * *
A.. Lentiviral vector 7TFP contiene el promotor 7XTCF, la luciferasa de la luciérnaga y el gen de resistencia a puromicina bajo el control del promotor SV40. LTR, repetición terminal larga; RRE, Rev elemento de respuesta; FFluc, luciferasa de luciérnaga; SV40, virus Simian 40 vacuolating; PuroR, resistencia a la puromicina; WPRE, virus de la hepatitis de la marmota elemento regulador post-transcripcional; PECADO; auto de inactivación. B. representaciones esquemáticas de la producción 7TFP lentiviral mediante transfección, infección lentiviral, y la selección reportero línea celular estable. C. Validación de respuesta reportero Wnt dependiente de la concentración de la línea celular productora estable después de la inducción LiCl (8 h) se midió utilizando la actividad de luciferasa. Pliegues de Wnt reportero de la actividad respecto al control negativo (tratado con vehículo) se muestran como media ± SE
Resultados
Producción y Optimización de Reportero Estable línea celular HeLa 7TFP para la selección de alto contenido de fitoquímicos para Anticancer Propiedades
para identificar moduladores químicos de origen natural de la señalización de Wnt, hemos desarrollado un ensayo de alto contenido para medir la activación, la translocación nuclear y la posterior unión de β-catenina al complejo TCF transcripción en células HeLa. La inhibición del complejo de GSK-3 en el citoplasma conduce a la producción de β-catenina aberrante que se transloca posteriormente al núcleo para unirse a la activación aguas abajo de disparo TCF-complejo de genes de la ruta de Wnt. Se utilizó una línea de células HeLa que lleva de forma estable un casete reportero 7TFP lentiviral que contiene un Firefly gen indicador de luciferasa controlado por el promotor del gen TCF (Fig. 1A). Para demostrar significado funcional de la línea celular HeLa reportero 7TFP, se utilizó LiCl, un inhibidor farmacológico de la GSK-3 [31], [39], como un activador de Wnt. Como se muestra en la Fig. 1C, 8 h después de las células de tratamiento 7TFP LiCl mostró una estimulación dependiente de la dosis de respuesta de señalización Wnt, como se indica por la actividad de la luciferasa de la luciérnaga. En 50 mM, LiCl provocó una cerca de 1.000 inducción reportero veces en relación con el control negativo (DMEM). Por lo tanto, para todos los experimentos posteriores se usó LiCl a una concentración de 50 mM. Hemos validado aún más la capacidad del sistema de ensayo para identificar compuestos que afectan a la señalización de Wnt utilizando un conocido inhibidor de Wnt de señalización, un FH535 molécula pequeña sintética obtenida a partir de Sigma Chemicals (St. Louis, MO) (datos de validación independientes no mostrados). Por lo tanto, la FH535 fue utilizado como un control de referencia para todos los experimentos posteriores, como se muestra en las Figs. 2-6.
Reportero y actividades de luciferasa de Renilla se midieron usando un kit de ensayo de luciferasa Dual Glo. valores porcentuales normalizados relativos al control de LiCl se muestran como la media ± S.E (n = 4). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el compuesto
- tratada
células y el control inducida por LiCl:. *** P≤0.001, p≤0.01 **, * p = 0.05
Selección los compuestos destinados a su capacidad para inhibir la transcripción de inducción de la señalización Wnt
para identificar moduladores naturales de señalización Wnt canónica y, además validar nuestro sistema de ensayo de indicador, se realizó un piloto y concentrados de cribado con cinco compuestos de nuestro laboratorio de recogida de producto natural. El uso de inhibición superior al 25% a la concentración más alta probada combinado con curva de inhibición dependiente de la concentración en comparación con el control positivo LiCl, se identificaron tres compuestos que downregulated activación mediada por la señalización de Wnt TCF (Fig. 2). Avns 2p y 2f atenuada 30% de la activación en 40 mM concentraciones mientras que el mismo nivel de atenuación se consigue por 22,24 nM triptólido. El FH535 sintético logra un mayor grado de atenuación Wnt de señalización en 10 concentración M. No mostró ninguna actividad a niveles nanomolares (datos no mostrados). Se debe mencionar que no se observaron efectos citopáticos celulares obvias usando un microscopio de contraste de fases durante 12 h la exposición de células a todos los compuestos ensayados. No se observaron cambios significativos en los niveles de activación transcripcional en respuesta a los Avn 2p o Triptolida con incubaciones prolongadas (12 h), en comparación con 8 tratamientos h.
La atenuación de la proliferación de células HeLa por agentes de pruebas
activación de señalización Wnt se ha relacionado con la proliferación celular no controlada durante la carcinogénesis [3]. En nuestro experimento de selección utilizando células HeLa reportero Wnt estable, 2P, 2f y triptólido suprimida LiCl activa la transcripción mediada por TCF de una manera dependiente de la concentración. Desde la proliferación celular desregulado es una característica de las células cancerosas, se determinaron los efectos antiproliferativos de la prueba tres compuestos positivo en el ensayo de selección (Fig. 2). Tanto triptolida y Avns 2p mostraron significativa, dependiente de la concentración actividad antiproliferativa (Fig. 3). AVN 2f no mostró actividad antiproliferativa durante 24 h de cultivo, por lo tanto, sólo se 2p y Triptolida fueron estudiados en experimentos posteriores.
Las células HeLa se cultivaron con medio de cultivo MTS. Se leyó la absorbancia a 490 nm y los datos se expresaron como porcentaje de viabilidad celular en comparación con el control de DMSO (vehículo). valores porcentuales normalizados relativos al control de DMSO se muestran como la media ± S.E (n = 4). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre el compuesto
- tratada
células y de control:. *** ** P≤0.001, p≤0.01, * p = 0.05
Avns 2p y Triptolida promovido celular
β-catenina
la degradación de proteínas
La investigación adicional mecanicista en la perturbación de señalización Wnt por triptolida y 2p se llevaron a cabo. Desde Wnt de señalización de activación que fue suprimida por los compuestos, requiere la producción celular de β-catenina y su unión a complejo de transcripción TCF en el núcleo [3], se analizó la capacidad de los compuestos para mejorar celular degradación de la proteína β-catenina. se observó dependiente de la concentración inducida por LiCl degradación de la proteína β-catenina en respuesta a 2p y triptólido en células HeLa (Fig. 4B). Disminución de la expresión de β-catenina también se observó en las células tratadas con FH535 (Fig. 4B). En particular, la expresión de actina endógena no se alteró en las células tratadas con 2p o FH535, lo que indica que la reducción observada de β-catenina no era debida a la toxicidad del fármaco (Fig. 4A).
A. β-catenina expresión de la proteína: Western blot fue el doble palpada con el ratón anti β-catenina humana (1:2000 v /v) y conejo (1:5000 v /v) de anticuerpos, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato, anti humano β-actina y incubaron adicionalmente con DyLight 680 anti-ratón (/v 1:5000 v) y DyLight 800 anti-conejo (1:5000 v /v) anticuerpos. LI-COR Odyssey sistema de imágenes de infrarrojos se utiliza en la detección de señales de inmunotransferencia. B. Análisis densitométrico de los niveles de proteína β-catenina (media ± SE, n = 3): ß-actina se utilizó como control de limpieza para la normalización. El asterisco indica los niveles de expresión de β-catenina en las células tratadas con compuestos que son significativamente diferente de la de control de LiCl inducida:. *** P≤0.001, p≤0.01 **, * p = 0.05
Avns 2p y triptolida abrogó la localización nuclear de
β-catenina
respuesta de señalización Wnt depende de la localización nuclear de β-catenina donde interactúa con la familia TCF /LEF de factores de transcripción para activar la vía de Wnt. Por lo tanto, hemos querido confirmar si la degradación celular de β-catenina por 2p y Triptolida (Fig. 4) lógicamente conduce a la reducción de la localización nuclear de β-catenina.
Como se demuestra en la Fig. 5A, la localización nuclear de β-catenina se inhibió de manera significativa en las células HeLa tratadas con tanto los compuestos en comparación con las células no tratadas. El análisis cuantitativo del número de células que muestran la tinción de β-catenina nuclear de 100 células contadas al azar de control de LiCl tratada o apoyado además nuestra observación (Fig. 5B). Aproximadamente el 30% de las células no tratadas poseía la translocación nuclear de β-catenina en contraste con 14% en 2p- y 8% en las células tratadas con triptólido.
A. detección microscópica de la localización de β-catenina por inmunofluorescencia: células HeLa fueron tratados sólo con vehículo (DMSO, panel superior), 15 mM FH535 (segundo desde la parte superior), 80 mM Avns 2p (tercero desde la parte superior) o 22 nM Triptolida (abajo) antes a 50 mM LiCl inducción para cada uno.