Extracto
Los mecanismos moleculares que subyacen a la patogénesis cordoma son desconocidos. Por lo tanto, hemos tratado de identificar nuevas mutaciones para entender mejor la biología cordoma y para identificar dianas terapéuticas potencialmente. Teniendo en cuenta los costos relativamente altos de secuenciación del genoma completo, se realizó un análisis genético enfocado utilizando asistida por matriz de desorción /ionización por láser en tiempo de vuelo espectrómetro de masas (Sequenom IPLEX genotipado). Probamos 865 mutaciones de punto de acceso en 111 oncogenes y genes supresores de tumores seleccionado (OncoMap v. 3.0) de 45 muestras de tumores humanos cordoma. De las muestras analizadas, se identificaron siete con al menos una mutación. Seis de ellas eran de muestras congeladas frescas, y uno era de una muestra en parafina. Estas observaciones fueron validados mediante el uso de una plataforma independiente masa homogénea se extienden MALDI-TOF (Sequenom HME Genotipado). Estas alteraciones genéticas incluyen: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A), las ANR (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), y SMARCB1 (R40 *). Este estudio informa sobre la mayor análisis mutacional exhaustivo de los cordomas realizados hasta la fecha. Para centrarse en las mutaciones que tienen la mayor probabilidad de relevancia clínica, hemos probado sólo oncogenes y genes supresores de tumores que han sido previamente implicadas en la tumorigénesis de los tumores malignos más comunes. Se identificaron cambios genéticos raros que pueden tener importancia funcional de la biología subyacente y terapéuticos potenciales para los cordomas. Las mutaciones en el gen CDKN2A y PTEN se produjeron en áreas de pérdida de copia cromosómica. Cuando estos datos se empareja con los estudios que muestran 18 de 21 muestras de cordoma que muestran pérdida de copia en el locus de CDKN2A, 17 de 21 muestras de cordoma que muestran pérdida de copia en PTEN, y 3 de 4 muestras cordoma que muestran deleción en el locus SMARCB1, podemos inferir que una pérdida de heterocigosidad en estos tres loci puede jugar un papel importante en la patogénesis cordoma
Visto:. Choy E, MacConaill LE, Costa de GM, Le LP, Shen JK, Nielsen GP, et al. (2014) Los genes asociados con el cáncer de Genotipado en Cordoma identifica las mutaciones en oncogenes y Áreas de pérdida cromosómica que implican CDKN2A, PTEN, y SMARCB1. PLoS ONE 9 (7): e101283. doi: 10.1371 /journal.pone.0101283
Editor: Anette Duensing, Universidad de Pittsburgh Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Octubre, 2013; Aceptado: 4 Junio 2014; Publicado: 1 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Choy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado en parte por la Fundación Jennifer Hunter Yates, el Fondo L. Harris cordoma Stephan, la baya del sarcoma fondo de donaciones Cassandra Moseley, los Fondos Gategno y Wechsler, y la concesión KL2 Investigación médica Formación Investigador (mérito) adjudicado a la CE a través de Harvard catalizador /The Harvard clínica y traslacional Centro de Ciencias (National Institutes of Health conceder 1KL2RR025757-01), y por las contribuciones financieras de la Universidad de Harvard y sus centros académicos afiliados de atención médica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. CE ha recibido honorarios de consultoría de Amgen, Bayer, NPS, y Pfizer. LG es un consultor para Novartis y la Fundación Medicina y un soporte de la equidad en la Fundación Medicina. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cordoma es un tumor maligno primario agresiva del esqueleto axial que se cree que se origina a partir de tejido notocordal [1]. La mayoría de estos tumores se presentan ya sea en la base del cráneo (35%) o en el sacro (50%), y estos son típicamente con cirugía y /o radiación [2] - [10]. Su comportamiento clínico se caracteriza por un crecimiento lento y una predilección a recurrir a pesar de la resección quirúrgica. La mayoría de los pacientes con cordoma recurrente y casi todos los pacientes con metástasis finalmente morirán a causa de esta enfermedad [11], [12]. Por desgracia, no hay ningún agente sistémico eficaz para controlar el cordoma no resecable o metastásico y el desarrollo de nuevos tratamientos está limitada por nuestro pobre entendimiento de su biología [12] - [15]
La identificación de mutaciones conductor de malignidad. , tales como cánceres de EGFR mutado pulmonares, c-KIT mutante tumores del estroma gastrointestinal, y los tumores translocados-ALK, entre otros, ha cambiado drásticamente el panorama tratamiento para estas enfermedades [15] - [20]. Se postula, por lo tanto, que para que un tumor típicamente quimiorresistente como cordoma donde no existe una terapia sistémica efectiva, para la que no existe la identificación de mutaciones en genes de una estrategia terapéutica puede informar sobre el desarrollo de nuevos fármacos. Sin embargo, debido a la rareza de los pacientes con estos tumores, la comprensión de la patogénesis molecular global cordoma es actualmente incompleta.
cordomas estudios de cariotipo observado con la pérdida en el cromosoma 1p 3p y ganancias y afectan a los cromosomas 7q, 20, 5q, y 12q [21], [22]. Mobley et al. identificó una cohorte de cordomas pobremente diferenciados que carecen de SMARCB1 /INI1 expresión [23]. Evaluación citogenética mediante FISH mostraron que 3 de las 4 muestras tenían eliminación en este locus. la secuenciación de genes no reveló mutaciones puntuales. Recientemente, Le et al. realizado la hibridación genómica comparativa en 21 muestras de tumores cordoma para mostrar pérdida frecuente de regiones cromosómicas 9p21 y 10q23.3 [24]. También genotipo de 56 mutaciones puntuales que ocurren en 13 genes comúnmente asociados con el cáncer, incluyendo CDKN2A (situado en 9p21) y PTEN (situado en 10q23.3), pero no identificó ninguna alteración en su cohorte. Hemos tratado de ampliar estas observaciones mediante el análisis de 45 muestras cordoma a través de genotipado de alto rendimiento de los genes asociados con el cáncer sabe que desempeñan un papel importante en el cáncer.
Métodos
Declaración de Ética
aprobación de la junta de revisión institucional se obtuvo para estudiar retrospectivamente estas muestras tumorales de la Comisión de Socios de Investigación humana, 116 Huntington Avenue, suite 1002, Boston, MA 02116. el número de protocolo es 2007p-002464. La junta de revisión institucional renunciado a la necesidad de dar su consentimiento. las muestras de tumor se obtuvieron de los archivos clínicos del Dr. Francis Hornicek (Departamento de Cirugía Ortopédica, Hospital General de Massachusetts) y el repositorio de Tejidos del Hospital General de Massachusetts (http://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id = 31).
muestras tumorales Cordoma
tumor especímenes fueron obtenidos de los archivos clínicos del Dr. Francis Hornicek (Departamento de Cirugía Ortopédica, hospital general de Massachusetts) y el repositorio de Tejidos del hospital general de Massachusetts ( http://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id=31).
Extracción de ADN genómico
La extracción de ADN a partir de tejidos tumorales y líneas celulares cordoma eran realizado utilizando el kit QIAamp DNA Micro (Qiagen) como se describió previamente en las publicaciones anteriores [25]. La extracción se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se conserva a -20 ° C hasta su uso.
Selección de cáncer y mutaciones genéticas OncoMap v3 Ensayo diseño em
La selección de mutaciones de los genes del cáncer para el diseño del ensayo y el genotipado de espectrometría de masas se realizaron como se ha descrito previamente [25] - [27]. Múltiples bases de datos, incluyendo la base de datos del Instituto Sanger CÓSMICO, PubMed y The Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), se les preguntó por conocidas mutaciones de oncogenes y genes supresores de tumores somáticas. Las mutaciones se clasifican en importancia por la frecuencia en los cánceres ya través de los subtipos de cáncer, y los genes con modificadores terapéuticos existentes fueron seleccionados preferentemente.
Los cebadores para la amplificación por PCR y la sonda de extensión fueron diseñados utilizando Sequenom MassARRAY diseño de ensayo 3.0 y el ADN resultante secuencias fueron (1) consultar en la base de datos dbSNP para evitar la incorporación de SNPs durante el diseño del ensayo, (2) confirmaron a través de una herramienta de alineación BLAST-como (Blat) y modificar cuando sea necesario para evitar la amplificación pseudogene [28], y (3) sintetizado sin modificar el uso de purificación estándar (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA).
espectrometría de masas Genotipado
los cebadores y sondas se agruparon y se validaron en el ADN de control derivada desde el panel de CEPH humana HapMap ADN ( Coriell Institute), así como un panel de líneas celulares humanas con el estado mutacional conocida, como se describe anteriormente [26]. El ADN genómico se cuantifica usando Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, California), sometido a la amplificación de todo el genoma (WGA) usando el kit Qiagen Repli-g, y un paso de limpieza post-WGA se llevó a cabo usando un kit de purificación de Nucleofast (Macherey-Nagel). genotipado de espectrometría de masas usando químicas IPLEX se llevó a cabo según lo publicado anteriormente [27].
mutaciones candidatos se filtraron aún más por la revisión manual y seleccionados para su confirmación utilizando la química de extensión de base múltiple homogénea de masa-Extend (HME) con Plexing de ≤ 6 ensayos por grupo. Condiciones para la validación HME fueron consistentes con los métodos descritos por MacConaill et al. 2009 [27].
Array de hibridación genómica comparada (CGH) Análisis
Array CGH utilizando el Agilent microarray CGH 4x180k + SNP (Santa Clara, CA) fue descrito anteriormente [24]. el número de copias aberraciones llamadas fueron hechas con una base de registro mínimo absoluto de la región media de 2 ratio de 0,25 y un mínimo recuento de sondeos contigua de 5. Todos los datos de la matriz fueron revisados manualmente por cambios sutiles.
Resultados
Características de muestras de tumores clínicos
Un total de 45 muestras de ADN se obtuvieron de 40 pacientes que habían sido sometidos a resecciones operativas de su cordoma. fecha de la cirugía el paciente (DOS), edad, sexo, localización del tumor, recurrencia y metástasis son catalogados en la Tabla 1. 28 muestras se obtuvieron a partir de tejido fresco congelado, y 17 fueron derivados de FFPE bloques.
genotipo y el análisis de CGH
los ejemplos de las lecturas de espectrometría de masas se muestran en la Figura 1. los resultados de mutación están catalogados junto con las características del paciente en la Tabla 1. las mutaciones identificadas incluyen: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A) también conocida como β-catenina, las ANR (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), y SMARCB1 (R40 *).
productos de PCR difieren en masa en función de si la extensión de la sonda detecta una citosina (C) o timina (T). La figura de la derecha muestra el gráfico de espectro de masas de un alelo en SMARCB1 presentan un pico en ambos C y T. El panel izquierdo muestra que la mayoría de las muestras analizadas eran homocigotos con C, y 2 muestras eran heterocigóticos.
Entre probaron las 28 muestras frescas congeladas, se identificaron 6 mutaciones. De las 17 muestras de FFPE probados, se identificó solamente 1 mutación (en ALK). Al igual que en nuestras tarifas ya se ha informado de la detección de una frecuencia similar de mutaciones entre los recién congeladas y muestras de tumores de osteosarcoma embebidos en parafina [25], no pareció haber una diferencia en la tasa de mutaciones en las muestras que fueron recién congelados en comparación con las muestras de FFPE preparados (prueba exacta de Fisher, p = 0.22 dos colas). Dos muestras (muestras nº 7 y 8 en la Tabla 1), tomadas del mismo paciente en diferentes localizaciones anatómicas y quirúrgicas fechas, cada uno tenía las mismas mutaciones, tanto en SMARCB1 y CDKN2A. Cuando se realizó un análisis CGH sobre las muestras con mutaciones CDKN2A y PTEN, se observó pérdidas número de copias en los loci respectivos (Figura 2), lo que demuestra que estas mutaciones ocurrieron en las regiones de la pérdida cromosómica.
medidas de eje X ubicación a lo largo cromosoma 9 (Panel A) o 10 (Panel B). medidas del eje Y con relación recuento de sondeos. R: aCGH que muestra la pérdida de copia heterozyogous en CDKN2A; B:. ACGH que muestra la pérdida de PTEN en la copia heterozyogous
Discusión
Cordomas se han descrito anteriormente para tener aberraciones cromosómicas y se caracterizan por las ganancias y pérdidas cromosómicas en varias regiones del genoma [ ,,,0],21], [22], [24], [29]. Un estudio exhaustivo de todo el genoma en busca de mutaciones de alto rendimiento aún no se han realizado a través de una gran colección de cordomas. La gama de hibridación genómica comparada (aCGH) se utilizó para analizar 21 muestras tumorales cordoma [14] y observó grandes pérdidas número de copias afectan a los cromosomas 1p, 3, 4, 9, 10, 13, 14 y 18 [24]. En ese estudio, un análisis enfocado de 11 genes relacionados con el cáncer no reveló nuevas mutaciones en la secuencia de ADN. Díaz et al. Realizamos un genoma completo de un solo nucleótido análisis de polimorfismo de microarrays de 21 muestras cordoma clival para confirmar los hallazgos CGH por otros que aneuploidía cromosoma 3 y deleción del cromosoma 9p se produce (aunque con menor frecuencia que en los cordomas sacros) [29].
con la tecnología actual, la secuenciación de todo el genoma de las grandes colecciones de cordomas es costoso y laborioso. Por lo tanto, nuestro objetivo de ampliar nuestra pantalla mutacional mientras se centra únicamente en aquellas alteraciones genéticas que se han implicado previamente como tumorigenisis conductores en otros tipos de tumores con el objetivo general de la identificación de nuevas mutaciones que podrían dirigir la investigación adicional en cordoma descubrimiento terapéutico. Algunas de las mutaciones identificadas en este estudio se encuentran en los genes conocidos por su papel como supresores de tumores, como PTEN y CDKN2A. Curiosamente, ambos de estos genes se encuentran en las regiones cromosómicas que se encuentran con frecuencia a tener pérdidas de número de copias en el reciente análisis de CGH array (9p21 para CDKN2A y 10q23.3 para PTEN) a una velocidad de & gt; 80% para cada uno. Por lo tanto, hemos realizado CGH en las muestras que contienen mutaciones en el gen PTEN y CDKN2A y encontramos la pérdida cromosómica en cada loci en las muestras respectivas. Curiosamente, 33% de las muestras analizadas en Le et al. colección encontró pérdida completa de ambas copias del gen CDKN2A - argumentando que, o bien una mutación puntual en el gen CDKN2A o pérdida copia completa del gen CDKN2A pueden conducir a LOH en este locus [24]. Por lo tanto inferimos que la pérdida de heterocigosidad (LOH) en estos loci potencialmente puede ser un evento tumorigénico para el desarrollo de cordoma.
SMARCB1 es una subunidad de la cromatina dependiente de ATP remodelación complejo SWI /SNF, un poderoso epigenética supresor de tumores, que antagoniza directamente la histona metiltransferasa EZH2. Las mutaciones en los miembros SWI /SNF se reconocen cada vez en tumores malignos en los que ahora se piensa por algunos grupos a ser más comunes de lo que la inactivación de mutaciones en p53 [30], [31]. SMARCB1 también regula el ciclo celular mediante la activación de CDKN2A, y su pérdida conduce a la regulación positiva de EZH2 una molécula que está siendo el objetivo de varios inhibidores que están experimentando actualmente ensayos clínicos [32] - [34]. SMARCB1 es conocido por ser interrumpido en los tumores malignos rabdoideos, sarcomas de células redondas tejidos blandos (la mayoría eran un subgrupo de tumores se asemejan a condrosarcoma mixoide extraesquelético con características rabdoideos, sarcomas epitelioides y schwanomatosis [34] - [38].
Estos tumores, como los cordomas, son grupos de neoplasias raras para las que no se conoce un tratamiento eficaz. Mobley et al. observaron que, en mal cordomas diferenciadas, la expresión de SMARCB1 también es deficiente. utilizaron FISH para evaluar el locus SMARCB1 en el cromosoma 22q y encontrado supresión en 3 de 4 muestras [38]. por lo tanto, también inferir que cuando las mutaciones SMARCB1 coinciden en áreas de pérdida cromosómica, la pérdida de heterozigosidad también puede ser un evento tumorigénico.
Varias de las mutaciones encontradas en nuestro estudio , tal como ALK, PIK3CA, y CTNNB1, tienen cada uno inhibidores que están disponibles comercialmente, tales como el inhibidor de ALK Xalkori (crizotinib), o tener múltiples inhibidores actualmente en desarrollo clínico activo [39] - [44]. Observaciones como el nuestro sugerir la utilidad clínica de la realización de un genotipo dirigida ensayo clínico para probar nuevos inhibidores de la quinasa en esta población enfermedad.
en conclusión, se observó cordomas con mutaciones puntuales en los genes supresores de tumores en áreas de pérdida cromosómica frecuente y en oncogenes con inhibidores disponibles en el mercado. El primero sugiere posibles mecanismos para la tumorigénesis cordoma, este último sugiere posibilidades de nuevas terapias. Otros estudios necesitan ser hechos con el fin de establecer estos genes como marcadores biológicos importantes u objetivos en cordoma. El estudio ideal sería un esfuerzo de secuenciación del genoma completo que involucra muchas más muestras cordoma. Esperamos que este signo inicial de genotipado éxito en la mayor colección de muestras de tumores humanos hasta la fecha cordoma puede encender el entusiasmo a nuevas investigaciones sobre la patología molecular de esta enfermedad que actualmente no tiene tratamiento médico eficaz.