Extracto
El pronóstico muy sombrío de cáncer de páncreas (PC) se atribuye, al menos en parte, a la falta de un diagnóstico precoz. Por lo tanto, la identificación de genes expresados diferencialmente en múltiples etapas de la tumorigénesis de PC es de gran interés. En el presente estudio, un 7,12-dimethylbenzanthraene (DMBA) inducida por el modelo de PC se estableció en ratas Sprague-Dawley macho. El perfil de expresión génica se tamizó utilizando un microarray de oligonucleótidos, seguido de la reacción en tiempo real en cadena de polimerasa cuantitativa (QRT-PCR) y la validación tinción inmunohistoquímica. Un total de 661 genes expresados diferencialmente se identificaron en etapas de la carcinogénesis pancreática. De acuerdo con la clasificación GO, estos genes estaban involucrados en múltiples vías moleculares. Utilizando el análisis de dos vías de la agrupación jerárquica, páncreas normal, pancreatitis aguda y crónica, PanIN, inicial y avanzado cáncer de páncreas fueron completamente discriminado. Por otra parte, 11 y 142 upregulated genes downregulated (sondas) fueron encontrados por la tendencia de Mann-Kendall prueba Monótono, indicando genes homólogos de rata y humano. La qRT-PCR y análisis de inmunohistoquímica de CXCR7 y UBe2c, dos de los genes identificados, confirmaron los resultados de los microarrays. En líneas celulares humanas de PC, desmontables de CXCR7 dio lugar a la migración y la invasión disminuido. En conjunto, nuestros datos identificaron varios marcadores y dianas terapéuticas prometedoras de PC basado en una proyección integral y validación sistémica
Visto:. Guo JC, Li J, Yang YC, Zhou L, Zhang TP, Zhao YP (2013) microarray de ADN identifica los genes expresados diferencialmente durante el proceso tumoral en el cáncer pancreático inducido por DMBA en ratas. PLoS ONE 8 (12): e82910. doi: 10.1371 /journal.pone.0082910
Editor: William B. Coleman, Universidad de Carolina del Norte Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Agosto, 2013; Aceptado: 29 de octubre de 2013; Publicado: December 23, 2013
Derechos de Autor © 2013 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por el fondo especial de investigación para la industria de bienestar público de la salud, la investigación traslacional del diagnóstico precoz y el tratamiento integral del cáncer de páncreas (número 201202007). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de páncreas (CP) es un tumor maligno sólido humano con muy mal pronóstico [1]. Se han identificado varios factores clínicos y patológicos para PC, incluyendo el estadio T, ganglio linfático /metástasis a distancia, antígeno carbohidrato (CA) 19-9 y perineural /invasión intraneural; sin embargo, los factores que afectan el pronóstico de PC aún no se han aclarado [2], [3], [4], [5]. Además, los eventos moleculares implicados en la patogénesis y progresión de la PC, tales como Kras mutación, han sido descubiertos como puntos calientes [1]. Sin embargo, se requiere más investigación identificar los factores celulares que afectan al pronóstico.
Uno de los principales inconvenientes de los estudios previos en muestras humanas y líneas celulares es la dificultad para recoger muestras en todas las etapas de la tumorigénesis. Por lo tanto, los modelos animales presentan ventajas únicas en este aspecto. inductores químicos de PC incluyen N-nitrosobis (2-oxopropil) amina, azaserina, y 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA) [6], [7], [8], [9], [10]. Estos modelos pueden inducir toda la gama de la carcinogénesis, a través de etapa avanzada y la metástasis. DMBA ha sido ampliamente utilizado en el establecimiento de modelos de PC de rata [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. En nuestros estudios anteriores, se encontró que las células acinares pueden transdiferenciarse a las células ductales en el proceso de tumorigénesis en el modelo de rata inducido por DMBA PC [18]. Hoy en día, el concepto y la importancia de la metaplasia acinar a ductal (ADM) se han aceptado gradualmente [19]. Estudios previos han examinado diversas características de estos modelos de PC, incluyendo histológicos /características histoquímicas [11], [12], [14], alta en grasa /dieta alta en proteínas como promotor de la carcinogénesis [13], el metabolismo de la glucosa [15] y alteraciones en diversas proteínas [16]. Una reciente investigación realizada análisis proteómico en el modelo de rata PC [17]. Hasta el momento, no se ha informado de la detección de genes expresados diferencialmente en este modelo.
En el presente estudio, nuestro objetivo era detectar los genes expresados diferencialmente en PC utilizando el modelo de rata inducido por DMBA PC.
Materiales y Métodos
Animales
Sprague-Dawley (SD) ratas fueron proporcionados por el Centro Experimental de Animales, Union Medical College hospital de Pekín, Beijing, china. Las ratas fueron alojadas bajo condiciones estándar, incluyendo un entorno libre de patógenos y el acceso libre a comida y agua potable. las muestras de orina de veinticuatro horas se recogieron con jaulas metabólicas en las que sólo se proporcionó agua, pero no la comida. La Institucional Cuidado de Animales y el empleo en el Hospital del Colegio Médico Unión de Pekín específicamente aprobado este estudio y el uso de ratas. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Establecimiento de DMBA inducida en ratas Modelo PC
El modelo PC inducido por DMBA fue establecida en ratas SD macho de acuerdo con nuestro método anterior [14]. Un total de 75 ratas se dividieron en los grupos sham experimental, control y. DMBA o cristales de NaCl (5 mg) se utilizaron para las ratas en los grupos experimentales y de control, respectivamente, mientras que no se aplicó agente en el grupo de tratamiento simulado. En los grupos experimentales y de control, las ratas fueron sacrificados a los 7 días, 2 semanas, 1 mes y 3 meses después de la implantación. Cinco ratas en el grupo de tratamiento simulado se sacrificaron a 1 mes. Agrupación de todas las ratas se muestra en la Tabla 1.
La extracción de RNA y análisis de microarrays
ARN total fue extraído de -80 ° C congeladas muestras de tejido pancreático tomadas en todos los puntos de tiempo utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. La concentración total de muestra de ARN y la pureza se examinaron y se estima por mediciones de la densidad óptica a 260/280 nm usando un espectrofotómetro NanoDrop y electroforesis en gel de agarosa. La evaluación detallada de medición de datos y la calidad se muestra en la Tabla 2. El kit de transcripción inversa Superscript II (Invitrogen, EE.UU.), kit de GeneChip (Affymetrix, EE.UU.) y un ciclo Meta Etiquetado y reactivos de control (Affymetrix) también fueron utilizados en los análisis . La hibridación se realizó utilizando la expresión Genechip Rat Conjunto 230 (Affymetrix), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis de expresión génica se realizaron utilizando el Affymetrix genoma Rat 230 Un array (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.). Secuencias utilizadas en el diseño de la matriz se seleccionaron de GenBank, dbEST y RefSeq. Un gen chip 230 contiene un total de 15166 sonda fija que representa aproximadamente 4700 genes de rata conocidos y 10460 etiquetas de secuencias expresadas no anotadas. El número de acceso en la órbita geoestacionaria es GPL1355.
cuantitativo de transcripción inversa reacción en cadena de polimerasa (QRT-PCR)
El ARN total fue extraído por medio de TRIzol (Invitrogen). La transcripción inversa se realizó usando el kit de transcripción inversa Superscript II (Invitrogen, EE.UU.). Se utilizó el kit TaqTM R-PCR SYBR Green I (Takara, Tokio, Japón) para la PCR. pasos de amplificación fueron las siguientes: 95 ° C durante 30 s (pre-desnaturalización), y 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 61 ° C durante 31 s. Beta-actina fue designado como el control interno. Todos los experimentos se repitieron tres veces. Primers se enumeran en la Tabla 3.
La inmunohistoquímica y Evaluación de tinción
Los anticuerpos contra CXCR7 y UBe2c se adquirieron forma R & amp; D y Abnova, respectivamente, y el kit de tinción de dos pasos PowerVisionTM (PV-9000) era de Pekín de Zhongshan Biotech Co., china. Brevemente, las secciones se montaron, deparaffinized por xileno y rehidratada por etanol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en el microondas muestras durante 3 min. Después de bloquear la peroxidasa endógena, los portaobjetos se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario a una dilución de 1:200. Después del lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS), los portaobjetos se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) marcada con anticuerpo secundario durante 30 min a temperatura ambiente. Diaminobencidina se utilizó como cromógeno. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina. coloración marrón en el citoplasma o el núcleo se define como una señal positiva. El porcentaje de relación de tinción de las células teñidas positivas más del 50% se clasificó como la fuerte señal positiva.
Cultivo de células y Derribo de cxcr7
Dos líneas celulares de cáncer pancreático humano (PANC-1 y SU86.86) fueron regalos de tipo profesor Helmut Freiss, Universidad de Heidelberg, Alemania [20], [21]. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 y medio DMEM. con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Las células sembradas en placas de 6 pocillos se transfectaron con CXCR7 o control (scramble) pequeños ARN de interferencia tanto a una concentración de 40 nM usando Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El CXCR7 RNAi se adquirió de Invitrogen y la secuencia es la siguiente: AGAUGUAGCAGUGCGUGUCAUAGCC
Western Blotting
Las células se lavaron con PBS y se recogieron por raspado en tubos individuales.. Las proteínas se extrajeron de acuerdo con los protocolos de extracción de proteínas, y las concentraciones de proteína se determinaron usando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, Meridian Rd, Rockford). Los extractos de proteína (80 mg /carril) se sometieron a electroforesis en 10% geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido de la transferencia a membranas de PVDF y el bloqueo con leche en polvo no grasa 5% durante 2 h. Las membranas se incubaron con el anticuerpo primario contra CXCR7 (Abgent, San Diego, CA) durante la noche a 4 ° C. El anticuerpo secundario (IgG anti-conejo) se incubó durante 1 h a 37 ° C. Las transferencias se lavaron tres veces con PBS, se expone a reactivos de quimioluminiscencia (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania), y se expusieron a película fotográfica. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
La migración celular y la invasión Ensayos
insertos
Transwell (tamaño de 8,0 micras de poro) (CORNING, Chelmsford St) se utilizaron para los ensayos de migración e invasión. La cámara inferior se llenó con 500 l de medio RPMI 1640 o medio DMEM con 10% de FBS. células PANC-1 y SU86.86 se resuspendieron en el medio de migración (RPMI 1640 libre de suero o DMEM) y 4 × 10
se añadieron 5 PANC-1 o SU86.86 células en 200 l de medio a la cámara superior después de se lavaron dos veces con PBS. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, las células de la superficie superior de la membrana se rasparon suavemente y cuidadosamente a cabo utilizando puntas de algodón. Las células migrantes que eran adherentes a la superficie inferior de la membrana fueron fijadas en formalina al 10% a temperatura ambiente durante 30 min, y luego se tiñeron con H & amp; E (hematoxilina y eosina). Los resultados del ensayo de migración celular se evaluó contando el número de células en la superficie inferior de la membrana bajo un microscopio invertido en cinco campos diferentes con un aumento de 200 ×
.
Para los ensayos de la invasión de células, la superficie inferior de la membrana se revistió con gel de ECM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) en PBS durante 5 horas a 37 ° C. células PANC-1 o SU86.86 (8 × 10
5 células) en medio libre de suero RPMI 1640 o medio DMEM se sembraron en cámaras superiores con recubrimiento de gel de ECM, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células que habían cruzado el ECM y pasado a través de los poros del filtro se contaron en cinco campos en × 200. Los resultados son representativos de tres experimentos diferentes.
Para obtener resultados de microarrays, se llevaron a cabo una corrección de fondo y la normalización análisis estadísticos
. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) y las pruebas de Student-Newman-Keuls (SNK) se utilizaron para detectar genes expresados diferencialmente estadísticamente entre los diferentes grupos. En el análisis bioinformático, los genes expresados diferencialmente fueron sometidos a análisis GO agrupación jerárquica, análisis de componentes principales, SOM y el test de Mann-Kendall. Las pruebas de la t de Student y Chi-cuadrado se aplican para mostrar las diferencias de medición y los datos categóricos. Se utilizó el SPSS13.0 paquete de software estadístico (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Un estadísticamente significativa
valor de p
se definió como
P
. & Lt; 0,05
Resultados
establecimiento exitoso de DMBA inducida en ratas Modelo PC
pancreatitis aguda se observó en ratas (7 días después de la implantación), tanto en los grupos experimental y control. neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN) estuvo presente en 6 de cada 15 ratas (40%) en el grupo experimental 2 semanas después de la implantación, mientras que no se encontró PC en ratas en el grupo de control. Un mes y 3 meses después de la implantación, 12 de los 15 (80%) y 14 de 14 (100%) ratas en el grupo experimental, respectivamente, PC desarrollado (fig. 1A, 1B). Cuatro ratas del grupo 3-meses desarrollaron metástasis pequeño intestino o la metástasis de hígado (Fig. 1C, 1D). Sin embargo, PC estaba ausente en las ratas en los grupos de control. La tasa de formación de PC en el grupo experimental fue mayor que en el grupo control (
P
& lt; 0,05). Una rata murió antes del final del estudio (3 meses), provocando una tasa de mortalidad del 6,7% (1/15).
(A) del tumor pancreático del grupo 1-mes. (B) tumor pancreático de grupo 3-mes. (C) nódulos de metástasis intestino pequeño de tumor pancreático. nódulos (D) metástasis hepáticas de tumor pancreático.
Los cambios histológicos fueron evaluados utilizando tinción HE y microscopía de luz. páncreas normal (Fig. 2A), la pancreatitis aguda (Fig. 2B), pancreatitis crónica (Fig. 2C), PanIN 2a (Fig. 2D), PanIN 2 (Fig. 2E), PanIN 3 (Fig. 2F), bien se observaron diferenciada PC (Fig. 2G) y PC pobremente diferenciado (Fig. 2H).
(A) del páncreas normal (aumento original × 60). (B) La pancreatitis aguda (aumento original x 150). (C) La pancreatitis crónica (aumento original x 150). (D) PanIN 1a (aumento original × 60). (E) PanIN 2 (aumento original x 150). (F) PanIN 3 (aumento original × 60). (G) PC bien diferenciado (aumento original × 60). (H) PC pobremente diferenciado (aumento original × 60).
Los genes expresados diferencialmente en inducida por DMBA rata Modelo PC
Se detectaron un total de 661 genes expresados diferencialmente en condiciones normales páncreas del grupo control y los grupos experimentales (tabla 4). Según IR clasificación, los genes estaban involucrados en varias categorías funcionales y múltiples procesos biológicos, incluido el transporte de gas, el proceso metabólico de hidratos de carbono, el procesamiento y presentación de antígenos (Fig. 3A). Por análisis de dos vías de agrupación jerárquica, páncreas normal, pancreatitis aguda y crónica, y PanIN temprana y avanzada muestras de cáncer de páncreas fueron discriminados por completo (Fig. 3B). Hubo 11 genes regulados positivamente (sonda) y 142 genes regulados negativamente (sonda) mediante la prueba de Mann-tendencia monótona Kendall (
P Hotel & lt; 0,05) (Fig. 3C). Los 20 genes upregulated y downregulated en el grupo DMBA 3 meses cuyos niveles de expresión fueron cambiados por dos veces en comparación con el grupo control (P
Hotel & lt; 0,01) se muestran en la Tabla 5. Además, los genes homólogos en la rata y humano en diferentes etapas de el modelo de rata fueron seleccionados con éxito (Tabla 6, Fig. 3D).
(a) IR genes de clasificación que muestra que participan en diferentes categorías de función molecular. (B) de dos vías de análisis de agrupamiento jerárquico. (C)
P
valores de tendencia de Mann-Kendall prueba monótono. (D) Los genes homólogos en ratas y humanos en las diferentes etapas del modelo de rata.
Los genes expresados diferencialmente Validación de
Se seleccionaron tres de los genes expresados diferencialmente, CXCR7, ATP6v1g2 y UBe2c, un examen más detenido. En primer lugar, hemos examinado sus perfiles de expresión de QRT-PCR. Los valores de Ct de CXCR7 disminuyeron gradualmente, junto con el tratamiento prolongado DMBA (
P
& lt; 0,05) (Tabla 5), indicando la expresión upregulated. No hubo diferencias significativas para ATP6v1g2 y UBe2c (
P Hotel & gt; 0,05) (Tabla 7). El uso de inmunohistoquímica, a través del diagnóstico y la confirmación de un patólogo, mejora de forma significativa se detectaron CXCR7 y expresión UBe2c, junto con la progresión de la PC en ratas (
P
& lt; 0,05). (. Tabla 8, Figs 4)
(aumento original × 200). (A), (C) páncreas de rata normal, tinción HE. (B), (D) Rata PC, tinción HE. (E), (G) páncreas de rata normal, CXCR7 tinción inmunohistoquímica. (F), (H) de la rata PC, Ube2c inmunohistoquímica manchas.
Disminución de la migración y la invasión después de la transfección de siRNA CXCR7 en PANC-1 y SU86.86 líneas celulares
la expresión de CXCR7 se downregulated con éxito en las dos líneas celulares humanas de PC, PANC-1 y Su86.86 (Fig. 5A), después de la transfección con siRNA CXCR7, en comparación con la transfección con el control de siRNA. Se observaron diferencias significativas en la migración celular y la invasión en las células transfectadas CXCR7 siRNA en comparación con células de control (P & lt; 0,05) Desmontables (Figs 5B y 5C.)
(A) de CXCR7 por siRNA transfección.. (B) La migración después de la transfección de CXCR7 o el control de siRNAs. (C) La invasión después de la transfección de siRNAs cxcr7 o de control.
Discusión
Varias alteraciones en las vías moleculares han sido conocidos por jugar un papel importante en la iniciación y progresión de la PC [1 ]. Sin embargo, una de las complicaciones en los estudios basados en muestras humanas es que las características de cada fase de la enfermedad no se pueden visualizar fácilmente. En este aspecto, los modelos animales llevan una ventaja única. En el campo de la investigación de PC, los modelos principales han incluido inducido por DMBA y modelos transgénicos [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [22]. En los estudios sobre el modelo de rata inducido por DMBA, se han reportado diferentes dosis DMBA y ritmos de desarrollo de PC [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. El estudio actual, que se basa en nuestro método se informó anteriormente [14], alcanza resultados satisfactorios inducción PC. Por lo tanto, estos resultados indican establecimiento exitoso del modelo.
Los microarrays se han aplicado ampliamente en la detección de genes expresados diferencialmente en PC [23], [24], [25], [26]. Sin embargo, esta técnica no se ha utilizado en el modelo de PC inducido por DMBA. El presente estudio examinó el perfil de expresión génica en este modelo de rata PC. el análisis de microarrays de Affymetrix identificó un total de 661 genes que son expresados diferencialmente en páncreas normal desde el grupo control y los grupos experimentales. Estos genes incluyen facilitadores críticos de importantes funciones durante la tumorigénesis pancreática [27], como Kras, CDKN2A, SMAD4 y TP53. Estos genes se upregulated o downregulated durante la duración de la formación de tumores de páncreas. GO clasificación, análisis de agrupamiento jerárquico de dos vías y prueba de tendencia monótona de Mann-Kendall genes se determinaron nuevos, incluyendo nm23, ciclina B1 y FGFR3. Un estudio previo mostró que nm23 se asoció con el potencial metastásico de las líneas celulares PC humanos [28]. En el estudio actual, mostramos que la expresión de nm23 fue significativamente diferente entre páncreas normal y el grupo de DMBA 1 mes, lo que sugiere que la molécula también podría estar involucrado en la primera etapa de la patogénesis de PC. Hay pocos datos disponibles sobre los papeles de ciclina B1 y FGFR3 en PC [23], [29]. Por lo tanto aquí, nos proporcionan una prueba que fundamente su participación en esta enfermedad. Se requieren más investigaciones sobre los mecanismos detallados que subyacen a su participación en la PC.
Los patrones de expresión de tres genes expresados diferencialmente, CXCR7, ATP6v1g2 y UBe2c, fueron evaluadas por QRT-PCR y tinción inmunohistoquímica. Los resultados mostraron regulados por incremento gradual expresión CXCR7 en el ARNm, y una mayor expresión positiva de CXCR7 y UBe2c, junto con DMBA tratamiento prolongado. Estos hallazgos mayoría siguieron los datos de microarrays. CXCR7 fue demostrado previamente para tener un impacto en el crecimiento, la apoptosis, invasión /metástasis y el pronóstico en muchos tipos de cáncer [30], [31], [32], [33]. Un estudio reciente reveló que CXCR7 promueve el crecimiento celular en PC [34]. Sin embargo, su importancia pronóstica en el PC sigue siendo controvertida [35], [36]. En el modelo de rata y de líneas celulares humanas utilizadas en nuestros experimentos, se indicó la asociación de CXCR7 y la progresión así como proclividad invasivo de PC. Por lo tanto, se justifican nuevos estudios mecanísticos para los factores moleculares implicados en la pena PC.
UBe2c se estableció para ser asociado con el crecimiento y la inhibición de la apoptosis en células de cáncer, jugando así un papel en la tumorigénesis y que muestra potencial para ser un marcador biológico tanto de diagnóstico y pronóstico [37]. Sin embargo, UBe2c no se ha investigado previamente en el PC. En el presente estudio, encontramos una mayor expresión positiva de UBe2c junto con DMBA tratamiento prolongado, lo que sugiere su posible papel en la progresión de la PC. En particular, la expresión de ARNm UBe2c no se alteró significativamente, lo que indica que después de la regulación de la transcripción podría estar involucrado en los cambios de su expresión. Se requiere datos de mecanismos detallados que subyacen a esta activación.
En resumen, nuestros datos identificaron varios marcadores potenciales de PC basado en una proyección integral y su posterior verificación.