Tumor
Extracto
Antecedentes
Nos informó recientemente que el tumor de colon células estimulan los macrófagos para liberar IL-1β, que a su vez inactiva GSK3 y mejora la señalización Wnt en células de cáncer de colon, la generación de un bucle auto-amplificación que promueve el crecimiento de células tumorales.
Principales conclusiones
Aquí se describe que los macrófagos protegen a las células HCT116 y hke-3 de cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL. La inactivación de IL-1β mediante la neutralización de anticuerpos de IL-1β, o el silenciamiento de IL-1β en los macrófagos inhibe su capacidad para contrarrestar la apoptosis inducida por TRAIL. De acuerdo con ello, IL-1β era suficiente para inhibir la apoptosis inducida por TRAIL. colapso inducida por TRAIL del potencial mitocondrial membrana (Δψ) y la activación de las caspasas se impidió por los macrófagos o por IL-1β recombinante. La inhibición farmacológica de la liberación de IL-1β de macrófagos por la vitamina D
3, un agente quimiopreventivo potente para el cáncer colorrectal, restauró la capacidad de TRAIL de inducir la apoptosis de las células tumorales cultivadas con macrófagos. Los macrófagos y IL-1β no lograron inhibir la apoptosis inducida por TRAIL en las células HCT116 que expresan dnIκB, dnAKT o dnTCF4, lo que confirma que se oponen a la muerte celular inducida por TRAIL mediante la inducción de la señalización de Wnt en las células tumorales. Hemos demostrado que los macrófagos y de IL-1β se estabilizaron Snail en células tumorales en una forma dependiente de NF-kB /Wnt y que las células tumorales deficientes caracol no fueron protegidos de la apoptosis inducida por TRAIL por los macrófagos o por IL-1β, lo que demuestra un papel crucial de Snail en la resistencia de las células tumorales a RUTA
Importancia
Hemos identificado un bucle de retroalimentación positiva entre las células tumorales y los macrófagos que se propaga el crecimiento y promueve la supervivencia de células de cáncer de colon:. células tumorales estimulan macrófagos que secretan IL-1β, que a su vez, promueve la señalización de Wnt y estabiliza Caracol en las células tumorales, que confiere resistencia a TRAIL. La vitamina D
3 paradas de este bucle de amplificación al interferir con la liberación de IL-1β de los macrófagos. En consecuencia, la vitamina D
3 sensibiliza a las células tumorales a la apoptosis inducida por TRAIL, lo que sugiere que la eficacia terapéutica de TRAIL podía aumentarse mediante este agente quimiopreventivo fácilmente disponibles
Visto:. Kaler P, Galea V, L Augenlicht , Klampfer L (2010) asociado a tumor macrófagos proteger las células del cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL mediante la estabilización dependiente de IL-1β- de Snail en células tumorales. PLoS ONE 5 (7): e11700. doi: 10.1371 /journal.pone.0011700
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 13 Abril, 2010; Aceptado: June 27, 2010; Publicado: July 22, 2010
Derechos de Autor © 2010 Kaler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por CA 111361 (LK), U54 CA 100926 (a los Ángeles) y P30-13330 del Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la inflamación contribuye a la progresión del tumor mediante el establecimiento de condiciones que apoyan el crecimiento de células tumorales y la supervivencia e incrementar su potencial metastásico. De hecho, la inflamación crónica se ha demostrado que predisponen al desarrollo de una variedad de tumores, un ejemplo notable es la enfermedad inflamatoria intestinal, que se asocia con un riesgo elevado de cáncer de colon [1]. Por otra parte, parece que los cánceres de colon que no se desarrollan como una complicación de la enfermedad inflamatoria intestinal también son impulsados por la inflamación, ya que se ha demostrado que el uso regular de AINE reduce la mortalidad por cáncer de colon esporádico y los resultados en la regresión de adenomas en pacientes con PAF , que heredan una mutación en el gen APC [2]. factores solubles que se propagan la inflamación pueden ser producidos por las células tumorales en sí o, más a menudo, por las células reclutadas en el microambiente del tumor, tales como macrófagos asociados al tumor (TAM). Se requiere la señalización coordinada entre las células tumorales y las células no malignas en el microambiente tumoral para la progresión de tumores, y las vías que regulan la diafonía entre las células de tumor de colon y el estroma, tales como NF-kappa B y STAT3 señalización, se han convertido en importantes objetivos para quimiopreventivo y agentes quimioterapéuticos [3], [4]. Del mismo modo, los antagonistas de TNF están en fase I de ensayos clínicos y /II han demostrado ser bien tolerado en pacientes con tumores sólidos [5], [6].
Recientemente hemos establecido que los macrófagos promueven la señalización Wnt en cáncer de colon las células y por lo tanto mejorar su proliferación, y demostraron que los macrófagos ejercen su actividad protumorigénicos principalmente a través de la liberación de IL-1β [7], [8]. Aquí nos muestran que los factores derivados de macrófagos, además de apoyar el crecimiento de las células tumorales, también promueven su supervivencia tras el tratamiento con TNF-relacionados con la apoptosis ligando inductor (TRAIL), un potente iniciador de la vía extrínseca de la apoptosis.
TRAIL inicia la apoptosis mediante la unión a dos receptores de muerte, DR4 y DR5, mientras que la unión a los receptores señuelo que carecen del dominio de muerte, tales como DCR1, DCR2 y osteoprotegerina, inhibe su actividad pro-apoptótica [9]. La unión de TRAIL a la muerte receptores resultados DR4 /DR5 inducir en el reclutamiento del dominio Fas -asociado muerte (FADD) a los receptores, que inicia la unión de la procaspasa 8 y la procaspasa 9, y la formación de la muerte inducir complejo de señalización (DISC) [9]. En las células de tipo I, la activación de caspasa-8 es suficiente para activar las caspasas efectoras 3, 6 y 7, mientras que en las células de tipo II, la cascada apoptótica requiere la integración de la vía mitocondrial mediada por la caspasa-8 inducida por escisión de la subasta.
Las células tumorales son significativamente más sensibles a la apoptosis inducida por TRAIL que las células normales, el establecimiento de TRAIL y DR4 o DR5 anticuerpos agonistas como atractivos fármacos contra el cáncer. De hecho, en marcado contraste con otros miembros de la familia del TNF, el tratamiento de ratones y primates con una regresión significativa TRAIL recombinante inducida de los tumores sin toxicidad sistémica [10], [11]. Recientemente, la combinación de TRAIL con todo acetato de trans-retinilo (rac) se ha demostrado que induce la apoptosis selectivamente en la poliposis adenomatosa (APC) de células epiteliales deficiente sin dañar cellsαα normal y tratamiento de Apc
Min
ratones con RUTA y la apoptosis inducida por el RAC en los pólipos intestinales y prolongada supervivencia de los animales [12].
Sin embargo, existen diferencias significativas en la sensibilidad TRAIL entre las células cancerosas humanas. La resistencia a TRAIL se ha demostrado que el desarrollo en células con mutante DR5 [13] o en la reparación de desajuste tumores deficientes con mutaciones Bax [14]. Por el contrario, c-Myc promueve la capacidad de respuesta a TRAIL mediante la inhibición de la expresión de FLIP, un inhibidor de TRAIL de señalización [15], y contrarrestando inducida por TRAIL upregulation de MCL-1 y cIAP2, dos proteínas con capacidad intrínseca para inhibir la apoptosis [ ,,,0],dieciséis]. Además, las células estromales y factores solubles presentes en el microambiente tumoral se han demostrado tener un impacto significativo en la sensibilidad de las células tumorales a los agentes terapéuticos [17], [18].
TRAIL ratones deficientes mostrar una mayor susceptibilidad a la tumorigénesis inducida por carcinógeno y han aumentado el potencial metastásico [19], [20], lo que demuestra que TRAIL ejerce la actividad supresora de tumores, y sugiere un papel importante de TRAIL endógena en la vigilancia tumoral. De hecho, los autores mostraron que TRAIL es, al menos en parte, responsable de las células NK mediada, IFN dependiente, mecanismo de la eliminación del tumor.
En este estudio hemos demostrado que la apoptosis inducida por TRAIL de células de cáncer de colon es inhibida por macrófagos deriva IL-1β, y mostró que la apoptosis macrófagos y IL-1β recombinante contrarrestar inducida por TRAIL mediante la activación de Wnt de señalización y la estabilización de Snail en células tumorales. Por último, se presentan datos que indican que la "normalización" del microambiente del tumor por la vitamina D
3, un agente quimiopreventivo potente, restaura la sensibilidad de las células de cáncer de colon a TRAIL, lo que sugiere que la eficacia terapéutica de TRAIL se puede mejorar en gran medida por los agentes que inhiben la diafonía entre las células tumorales y el microambiente tumoral.
Materiales y Métodos
líneas celulares y de co-cultivo experimentos
el HCT116 y las líneas celulares de carcinoma colorrectal-3 hke , que se diferencian sólo por la presencia del alelo mutante k-Ras [21] y SW480 células se cultivaron en MEM, mientras que las células 293T se cultivaron en DMEM. La línea celular de monocitos humanos, THP1, se cultivó en RPMI. monocitos humanos normales, & gt; 90% CD14 y CD11c positivo y receptor de células T contra menos de 1% positivo, se adquirieron de
Astarte Biológicos
(Redmond, WA). Las células tumorales y los monocitos /macrófagos fueron co-cultivadas separados por transwell insertos de una membrana de policarbonato con tamaño de poro 0,4 m, que impiden el contacto directo célula-célula, pero permiten el intercambio de factores solubles (Corning Incorporated, Lowell, MA).
para el ensayo clonogénico, HCT116 y las células hke-3 se sembraron a una densidad de 200 células por pocillo de una placa de seis bien solo o junto con THP1 macrófagos o monocitos de sangre periférica durante 7 días. Las células tumorales se cultivaron con THP1 monocitos directamente (1.600 por pocillo de una placa de 6 pocillos), como THP1 células no se adhieren y forman colonias. La relación óptima entre las células tumorales y los macrófagos se estableció anteriormente [7], [8]. Las colonias se fijaron y tiñeron con 6% de glutaraldehído y 0,5% de cristal violeta y se contaron usando total software Lab 1.1 (Dinámica no lineal, Durham, NC, EE.UU.).
Apoptosis ensayo
Las células fueron tratadas con TRAIL recombinante (50 ng /ml, lo que se determinó era la concentración óptima) solo o en presencia de macrófagos, IL-1β (5 ng /ml) o TNF (10 ng /ml) durante 7 horas. Las células se resuspendieron en tampón hipotónico (0,1% Triton X-100, 0,1% de citrato de sodio) y se tiñeron con yoduro de propidio (50 g /ml) durante 4 horas a 4 ° C como se describe [22]. Las muestras se analizaron por citometría de flujo y la distribución del ciclo celular y la extensión de la apoptosis (células con un contenido de ADN subG1) se analizaron por el
Modfit
software. potencial de membrana mitocondrial se determinó por citometría de flujo utilizando el colorante fluorescente JC-1 (
Invitrogen
). Las células se tiñeron con 1 M de JC1 durante 1 hora a 37 ° C, se lavaron con PBS y se analizaron por fluorescencia en el canal FL2. Las células fueron tratadas con RUTA, durante unos 7 horas y se recogieron para la evaluación basada en criterios morfológicos. Sin embargo, como la tinción PI puede subestimar la cantidad de la apoptosis [23], se confirmó la naturaleza apoptótica de las células mediante el análisis bioquímico de los lisados celulares. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student para datos independientes, con valores & lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo
células
Transfección transitoria y ensayo de gen reportero
HCT116 y hke-3 fueron transfectadas transitoriamente con las láminas superior. FLASH o TOP-FOP plásmidos informadores luciferasa utilizando el método de fosfato de calcio. La eficacia de transfección se normalizó por co-transfección con pTK-Renilla y se determinó la actividad de luciferasa de acuerdo con el protocolo del proveedor (ensayo de indicador Dual Luciferase, Promega, Madison, WI). I? B? Dominante negativo se expresó a partir de un plásmido que codifica I? B? Con las serinas 32 y 36 mutado a alanina, que confiere resistencia a los estímulos degradación inducida [24]. Los plásmidos que expresan constitutivamente activa AKT, (HA-mdelta (4-129) PH-AKT), y AKT dominante negativo (HA-AKT-K179M) fueron proporcionados por Richard Roth [25], [26]. dnTCF4 se describió anteriormente [27].
Los macrófagos fueron transfectadas con 20 nM de ARNsi no específica (NSP) o siRNAs específico para VDR, IL-1β o STAT1 (Dharmacon, Lafayette, CO) usando Lipofectamina LTX (Invitrogen , Carlsbad, CA). La eficiencia de silenciamiento se monitorizó mediante inmunotransferencia (por STAT1 y VDR), o por ELISA (por IL-1β), como se informó [7], [8].
inmunofluorescencia
Para el detección subcelular de β-catenina por inmunofluorescencia, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Las células se incubaron con anticuerpo anti-β-catenina (1:100) durante 1 hora a 37 ° C y con anticuerpo anti-conejo secundario conjugado con FITC durante 45 min a 37 ° C. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara SPOT CCD y se analizaron por software SPOT.
Western Blot
transferencias de Western se realizaron utilizando procedimientos estándar. Las membranas se bloquearon con 5% de leche en TBS que contiene 0,1% de Tween 20 y se incubaron con anticuerpos específicos para la caspasa 8 (Abcam), caspasa 9, PARP, Snail (Cell Signaling Technology), pGSK3β (Millipore, Billerica, MA), beta total de catenina (BD Biosciences, San Jose, CA), y β-actina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia (Amersham ECLTM western blotting kit de detección, Piscataway, NJ).
Resultados
macrófagos y IL-1β a proteger las células de cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL
Hemos demostrado que los macrófagos inducen varias vías de señalización prosurvival en células de cáncer de colon, incluyendo NF-kappa B, AKT y Wnt de señalización [7], [8], lo que sugiere que la presencia de macrófagos podría afectar a la respuesta de las células tumorales a los agentes terapéuticos. células de cáncer de colon HCT116 son muy susceptibles a la apoptosis inducida por TRAIL [16]. En consecuencia, TRAIL inhibió significativamente el crecimiento clonogénico de HCT116 y hke-3 células (Fig. 1A y B), líneas de células que se diferencian sólo por la presencia de los mutantes KRAS [21]. No hubo ninguna diferencia reproducible entre la capacidad de respuesta de las células HCT116 y hke-3 a TRAIL (Fig. 1 y 2), lo que demuestra que la presencia de mutantes Kras no regula la capacidad de respuesta de las células a TRAIL. Para determinar si los macrófagos alteran la sensibilidad de las células tumorales a TRAIL, se trataron las células HCT116 y hke-3 con TRAIL en ausencia o en presencia de THP1 macrófagos. Sorprendentemente, la presencia de THP1 macrófagos o el tratamiento con IL-1β, una citoquina producida en cocultivos de células tumorales y los macrófagos [7], restauran el crecimiento clonogénico de las células de cáncer de colon TRAIL tratados (Fig. 1).
a y B: células HCT116 y hke-3 se sembraron a una densidad de 200 células por pocillo de una placa de seis pocillos en ausencia o en la presencia de macrófagos (1.600 /pocillo) o IL-1β, y se trataron con TRAIL para 4 horas. Los resultados mostrados en B representan la media de dos experimentos independientes cada uno realizado por duplicado.
Los macrófagos no inhibió la expresión de DR4 o DR5, o modular los niveles de receptores de reclamo DcR1 o DcR2 en HCT116 /hke-3 células (Figura S1), lo que sugiere que no modulan la capacidad de respuesta al sendero a través de la regulación de los receptores TRAIL.
a continuación nos mostró que los macrófagos y la IL-1β inhibe la apoptosis inducida por TRAIL de HCT116 y Hke- 3 células (Fig. 2A). macrófagos THP1 y IL-1β excluida colapso inducida por TRAIL de la potencial de membrana mitocondrial (MMP) (Fig. 2B) y ha impedido la activación inducida por TRAIL de la caspasa-8 y la caspasa-9 (Fig. 2C). La línea celular de monocitos humanos THP-1 se obtuvo a partir de la sangre periférica de un paciente con células de leucemia monocítica aguda y THP1 tiene propiedades de macrófagos derivados de monocitos humanos [28]. Estas células tienen varias características de los macrófagos asociados al tumor (TAM), incluyendo la activación alterada de NF-kappa B, la falta de producción de óxido nítrico en respuesta a LPS /IFN (no mostrado) y de alta señalización constitutiva STAT1 [7], [8]. Sin embargo, para confirmar que los resultados obtenidos utilizando células THP1 son biológicamente relevantes, mostramos que los monocitos de sangre periférica normales, precursores de los macrófagos asociados a tumores, protegidos un panel de líneas celulares de cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL (Fig. 2D). Al igual que los macrófagos THP1, monocitos de sangre periférica normales restauraron la MMP y la activación de la caspasa 8 impedido y la escisión de PARP en las células tumorales tratadas con TRAIL (datos no mostrados, la figura S2), que es consistente con la capacidad de las células de cáncer de colon para inducir IL liberación 1β a partir de monocitos de sangre periférica [7]
a:. HCT116 (media de 5 experimentos independientes) y las células hke-3 (promedio de 4 experimentos independientes) se trataron con TRAIL en la ausencia o la presencia de macrófagos o se determinó la IL-1β (5 ng /ml) como se indica y la extensión de la apoptosis después de 7 horas. B: El potencial de membrana mitocondrial (MMP) se determinó por tinción JC1 5 horas después del tratamiento. C: La activación de la caspasa 8 y la caspasa-9 se determinó en células de cáncer de colon tratados con TRAIL (50 ng /ml) en las condiciones indicadas. D: TRAIL líneas celulares de cáncer sensibles se trataron con TRAIL en la ausencia o la presencia de los monocitos humanos de sangre periférica (Mo) y el grado de apoptosis se determinó 7 horas después del tratamiento. Los datos mostrados representan la media de 2 o 3 experimentos independientes.
monocitos de sangre periférica inhibieron la apoptosis inducida por TRAIL también en células 293T (Fig. 2D), lo que demuestra que los factores derivados de macrófagos son inhibidores potentes y generales de la muerte celular inducida por TRAIL.
Los macrófagos proteger frente a la apoptosis inducida por TRAIL través de la IL-1β
Nos mostró que la IL-1β es suficiente para inhibir la apoptosis inducida por TRAIL (Fig. 2). Para establecer si se requiere IL-1β por los macrófagos mediada por la protección de las células tumorales frente a la apoptosis inducida por TRAIL, primero silenciados IL-1β en THP1 macrófagos. Estos experimentos revelaron que la IL-1ß macrófagos deficientes no protegen a las células tumorales de la apoptosis inducida por TRAIL (Fig. 3A y 3B). De acuerdo con estos datos, la neutralización de IL-1β por el anticuerpo específico de IL-1β, o el silenciamiento de STAT1, un factor de transcripción que hemos mostrado que se requiere para la liberación de IL-1β de los macrófagos [7] también inhibió la actividad anti-apoptótica de macrófagos (Fig. 3A y 3B). Como se esperaba, el anticuerpo neutralizante de IL-1β inhibió la actividad prosupervivencia de IL-1β, que demuestra la especificidad del anticuerpo. En conjunto, estos datos establecen que los macrófagos asociados a tumores protegen a las células tumorales de la apoptosis inducida por TRAIL en una manera dependiente de la IL-1β
A y B:. Células HCT116 se cultivaron con THP1 macrófagos con silenciado IL-1β o expresión STAT1 y se trataron con TRAIL como se indica. IL-1β se neutralizó por el anticuerpo específico anti-IL-1β. Se tomaron las imágenes (A) y se determinó la cantidad de apoptosis (B) después de 7 horas. Los datos mostrados en B representan la media de tres experimentos independientes. C y D: Los estudios realizados por Gyorffy
y col gratis ([29], C) y por Khambata-Ford
y col gratis ([30], D) fueron encuestados a través Oncomine e indican que las células líneas (C) y los cánceres primarios de colon (D) con los niveles más altos de resistencia IL-1βdisplay a los agentes terapéuticos, tales como vinblastina, doxorrubicina y cetuximab (CTX).
para determinar si la capacidad de IL -1β para interferir con la apoptosis inducida por la terapia se limita a TRAIL, inspeccionamos Oncomine (www.oncomine.org), que es un conjunto de estudios de microarrays de tumores humanos. El análisis de 30 líneas de células por Gyorffy
et al
[29] reveló que la alta expresión de IL-1β en líneas de células tumorales se correlaciona fuertemente con la resistencia de las células a la vinblastina y doxorrubicina (Fig. 3C). El análisis de los 70 tumores de colon metastásico [30] reveló que los tumores de colon que albergan KRAS mutantes tienen niveles más altos de IL-1β que los tumores con KRAS WT (Fig. 3D, panel izquierdo). Si la IL-1β es producida por las células estromales o células tumorales en sí no puede concluir, sin embargo, el análisis de esta base de datos reveló que los niveles más altos de IL-1β en los tumores se correlacionan con la resistencia a cetuximab [30] (Fig. 3D, panel derecho). En resumen, estos datos establecen que los niveles de IL-1β son elevados en un subconjunto de tumores de colon humanos, y que la IL-1β modula la respuesta de las células tumorales a una variedad de agentes terapéuticos tanto
in vitro
y
in vivo
.
la inhibición farmacológica de la estimulación de IL-1β por la vitamina D
3 inhibe la actividad de los macrófagos prosupervivencia
recientemente hemos demostrado que la diafonía entre el tumor células y macrófagos se interrumpe por la vitamina D
3, un agente quimiopreventivo importante para el cáncer colorrectal. La vitamina D
3 inhibió la capacidad de las células tumorales para estimular la liberación de IL-1β de los macrófagos [7] y, posteriormente, la vitamina D
3 macrófagos tratados no inducir la señalización Wnt en las células tumorales [7]. Estos datos sugieren que la vitamina D
3 también puede regular la apoptosis inducida por TRAIL. células HCT116 se cultivaron solo o en presencia de macrófagos, y se trataron con TRAIL en la ausencia o la presencia de vitamina D
3. La vitamina D
3 no afectó a la apoptosis inducida por TRAIL en HCT116 o hke-3 células (datos no presentados), lo que es consistente con la falta de respuesta de estas células a la vitamina D
3 [31]. Sin embargo, hemos demostrado que la capacidad de los macrófagos para proteger las células de cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL fue inhibida por la vitamina D
3 (Fig. 4A). La adición exógena de IL-1β impidió la capacidad de la vitamina D
3 para regular la apoptosis inducida por TRAIL, lo que confirma que la vitamina D
3 restauró la sensibilidad de las células tumorales a TRAIL mediante la inhibición de la liberación de IL-1β de los macrófagos, y no al afectar la señalización de IL-1β. El silenciamiento de VDR VDR siRNA en los macrófagos no afectó a su capacidad para inhibir la apoptosis inducida por TRAIL en células tumorales, sin embargo vitamina D
3 no pudo restaurar la apoptosis inducida por TRAIL de células tumorales cocultured con VDR macrófagos deficientes (Fig. 4A) . Estos datos demostraron que la vitamina D
3 afecta a la diafonía entre las células tumorales y los macrófagos por la orientación macrófagos y no las células tumorales, y que, en consecuencia, se requiere la expresión de VDR en los macrófagos, consistentes con nuestros datos publicados [7].
a: se determinó la cantidad de apoptosis en las células HCT116 tratados con TRAIL en las condiciones indicadas. Las barras de error se derivaron a partir de 2 experimentos independientes. B: El efecto de la vitamina D
3 sobre la activación inducida por TRAIL de las caspasas y la escisión de PARP y β-catenina se determinó por inmunotransferencia
El análisis bioquímico confirmó que mientras que los macrófagos inhibidas TRAIL. inducida por la activación de la caspasa 8 y la caspasa-9 y la escisión de PARP y β-catenina, el tratamiento con vitamina D
3 promovido la activación mediada por TRAIL de la cascada de la apoptosis en las células tumorales que fueron cultivadas en la presencia de WT, pero no VDR macrófagos deficientes (Fig. 4B). Como vitamina D
3 actúa como un inhibidor de la liberación de IL1-β, su actividad fue impedido por exógena IL1β y era dependiente de la expresión de VDR en los macrófagos (Fig. 4A, Fig. 4B) y no en las células tumorales (datos no se muestra).
vitamina D
3 sensibilidad también restaurado a TRAIL en células de cáncer de colon que se cultivaron en presencia de monocitos de sangre periférica. Se mejora la activación de la caspasa 8 y la posterior escisión de PARP y β-catenina en HCT116 que la resistencia adquirida a TRAIL debido a la presencia de monocitos de sangre periférica (Figura S2).
Estos datos sugieren que la eficacia terapéutica de TRAIL podría mejorarse en gran medida por la vitamina D
3 en los cánceres que se infiltraron por los macrófagos.
es necesaria la señalización de Wnt para la actividad de los macrófagos prosupervivencia
recientemente hemos demostrado que los macrófagos y la IL-1β inducir la señalización Wnt en células de cáncer de colon a través de la activación de la señalización de AKT NF-kB dependiente de [8], las vías que se han demostrado para proteger las células tumorales de la apoptosis. Para determinar si los macrófagos y IL-1β de inhibición de apoptosis inducida por TRAIL mediante la activación de estas vías de señalización pro-supervivencia, que expresan en células HCT116 dnIκB (un inhibidor de la señalización de NF-kB), dnAKT (un inhibidor de la señalización de AKT) y dnTCF4 ( un inhibidor de la señalización de Wnt). La inhibición de NF-kB o AKT no tuvo impacto en la apoptosis inducida por TRAIL. Sin embargo, las células transfectadas con dnTCF4 mostraron reproduciblemente una cantidad modesta reducción de la apoptosis inducida por TRAIL (diferencias no fueron estadísticamente significativa), que puede ser compatible con el requisito de la vía de Wnt para una óptima apoptosis inducida por TRAIL [32] (Fig. 5A) . Sin embargo, el punto crítico es que en contraste con las células transfectadas con un plásmido vacío, macrófagos y IL-1β no protegen a las células con alteración de NF-kappa B, AKT o Wnt de señalización de la apoptosis inducida por TRAIL (Fig. 5A). Se confirmó que los macrófagos y IL-1β no lograron contrarrestar la activación inducida por TRAIL de la caspasa-8 y la caspasa-9 y la posterior escisión de PARP en las células que expresan ya sea dnIκB, dnAKT o dnTCF4 (Fig. 5B). De particular interés, los macrófagos y la IL-1β evitado la escisión inducida por TRAIL de β-catenina, pero sólo en las células intactas con NF-kB /AKT /señalización Wnt (figura 5B).
A y B:. HCT116 expresando dnIκB, dnAKT o dnTCF4 se trataron con TRAIL en las condiciones indicadas y la cantidad de apoptosis se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. A: Los datos representan la media de 5 experimentos independientes. B: El grado de activación de la caspasa y la escisión de PARP y β-catenina se determinó en los lisados celulares por inmunotransferencia. C:. La localización de β-catenina se determinó por inmunofluorescencia en células HCT116 tratados con TRAIL en la ausencia o la presencia de IL-1β o TNF
La escisión de β-catenina fue mediada por caspasas, ya que se podía evitar su procesamiento por ZVAD, un inhibidor de pan-caspasa (Figura S3). Escindido β-catenina se ha demostrado que presentan alteración de la actividad transcripcional [33]. Hemos demostrado que inhibe TRAIL TCF4 /β-catenina actividad transcripcional y que los macrófagos y la IL-1β podrían restaurar parcialmente la β-catenina actividad transcripcional en las células tratadas con TRAIL (Figura S3).
Al igual que en informes publicados [34] hemos encontrado que, a pesar del hecho de que las células HCT116 llevan un alelo β-catenina mutante, la mayor parte de β-catenina se localiza en las membranas en células HCT116. En consonancia con la escisión de β-catenina por TRAIL, localización membranosa de β-catenina fue severamente disminuida en las células tratadas con TRAIL (Fig. 5C). Tanto la IL-1β y TNF restauran la localización membranosa de β-catenina en las células HCT116 en las células tratadas con TRAIL (Fig. 5C), de acuerdo con su actividad prosurvival.
En conjunto, estos datos demuestran que los macrófagos asociados a tumores (TAM) a proteger las células tumorales de la apoptosis inducida por TRAIL a través de su capacidad para estabilizar β-catenina y para promover la señalización Wnt en células de cáncer de colon.
macrófagos, TNFa e IL-1β se estabilizan Snail en un NF-kappa B y AKT forma /WNT dependiente
a pesar de que los macrófagos y las células tumorales protegida IL-1 a partir de la apoptosis inducida por TRAIL, no se regulan los niveles de los miembros de la familia Bcl-2 en las células tumorales, tales como Bcl-x o MCL1 , o alterar la expresión de Ciaps, que han sido mostrados para modular la respuesta de las células a la apoptosis inducida por TRAIL [16] (datos no mostrados). Sin embargo, se demostró que los niveles de proteína Snail se incrementaron en las células HCT116 tratadas con IL-1β o en células HCT116 cultivadas en presencia de los macrófagos (Fig. 6A). TNFa, otro factor macrófagos derivados que puede inducir la señalización Wnt en las células tumorales [7], [35], también eleva los niveles de Snail en células tumorales (Fig. 6A). Hemos demostrado que los macrófagos, IL-1β y TNF elevados Snail a través de NF-kappa B, AKT y la señalización de Wnt, ya que fallaron en aumentar los niveles de Snail en células que expresan dnIκB, dnAKT o dnTCF4 (Fig. 6A). Los niveles de RNAm de Snail en HCT116 o células hke-3 no se incrementaron por los macrófagos (no mostrados), lo que sugiere que los factores de macrófagos derivados de estabilizar la proteína Snail en células tumorales. La inducción de c-jun por la IL-1β y TNF también requiere NF-B, de acuerdo con los datos publicados (Fig. 6A). Hemos demostrado que TNF y IL-1β también fracasaron para inducir c-jun en células que expresan dnTCF4, lo que confirma la importancia de la señalización de Wnt para la actividad biológica de estas citoquinas y para la interacción de las células tumorales con macrófagos
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A : Los macrófagos, IL-1β y TNF estabilizan Caracol de manera NF-kB /AKT /Wnt dependiente. HCT116 células fueron transfectadas con dnIκB, dnAKT o dnTCF4 y fueron tratados con IL-1β o TNF, o se cultivaron con THP1 macrófagos como se indica. Los niveles de Snail y c-jun se determinaron por inmunotransferencia. B: Los niveles de Snail y pGSK3β se determinaron por inmunotransferencia en células hke-3 que fueron tratados con IL-1β, TNF o se co-cultivaron con macrófagos en la ausencia o la presencia de LY 294002 durante 24 horas. C: células HCT116 y hke-3 fueron tratados con TRAIL en la ausencia o la presencia de IL-1β y LY294002, como se indica. El experimento se realizó tres veces.
GSK3 es una quinasa que fosforila importante Caracol e induce su degradación [36], [37]. Debido a que se informó de que los macrófagos e IL-1β inactivan GSK3 en células tumorales [7], [8], el próximo examinó si macrófagos /IL-1β se estabilizan caracol a través de la inhibición de GSK3. células HCT116 y hke-3 fueron tratados con LY294002, un inhibidor de PI3K - y por lo tanto activador de la GSK3 (phoshorylation de GSK3 en la serina 9 inhibe su actividad). Como se muestra en la Fig. 6B, el tratamiento de células con LY294002 macrófagos en efecto impedido /IL-1ß /inactivación mediada por TNFa de GSK3, y estabilización completamente impedido de Snail por los macrófagos, TNF y IL-1β. Este resultado demuestra que la inhibición de GSK3 regula la estabilidad de Snail en células HCT116 y fuertemente sugiere que los macrófagos, TNFa e IL-1β se estabilizan Snail a través de su capacidad para inhibir la GSK3. De hecho, la inhibición farmacológica de GSK3 por LiCL o por GSK3 inhibidor específico, AR-A014418, era suficiente para estabilizar Snail en células tumorales (figura S4).
Finalmente, el tratamiento de las células con LY29004 previno completamente la capacidad de IL -1β para proteger a las células de cáncer de colon de la apoptosis inducida por TRAIL (Fig. 6C), lo que implica que los macrófagos e IL-1β protegen de la apoptosis inducida por TRAIL mediante la estabilización depende GSK3 de caracol.
Los macrófagos e IL-1β protegerlo de la apoptosis inducida por TRAIL mediante la estabilización de Snail
Caracol se ha demostrado que interactuar con β-catenina y para promover la expresión de los genes Wnt objetivo [38]. De acuerdo con estos datos, se encontró que la sobreexpresión de Snail promueve la actividad TOP-FLASH guiado tanto en HCT116 y hke-3 células (Fig. 7A). Con el fin de determinar si la estabilización de Snail por los macrófagos /IL-1β contribuye a su capacidad para conducir la señalización de Wnt, que silenciados Snail en células tumorales (Fig. 7B), y examinamos la capacidad de los macrófagos y de IL-1β para inducir la señalización de Wnt en caracol HCT116 células deficientes y hke-3. El experimento se realizó por triplicado.