Extracto
El cáncer gástrico (CG) es una de las neoplasias más comunes en todo el mundo. Nuevas pruebas han demostrado que la expresión aberrante de los microARN (miARN) juega un papel importante en la progresión del cáncer. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel potencial de miR-217 en GC. En este estudio, se investigó el papel de miR-217 en la proliferación celular y la invasión GC. La expresión de miR-217 se redujo reguladas en las células y tejidos GC GC humanos. la expresión forzada de células GC inhibe el miR-217 proliferación e invasión. Por otra parte, Glipicano 5 (GPC5), un nuevo ocncogene, fue identificado como el objetivo potencial de miR-217. Además, la sobreexpresión de miR-217 deteriorado promoción GPC5 inducida por la proliferación e invasión en células GC. En conclusión, estos resultados revelaron que el miR-217 funciona como un supresor de tumores y se inhibe la proliferación e invasión de células GC apuntando GPC5, que por lo tanto podrían servir como una diana terapéutica para pacientes con cáncer gástrico
Visto:. Wang H , Dong X, X Gu, Qin R, H Jia, Gao J (2015) El microARN-217 Funciona como un supresor tumoral en el cáncer gástrico Potencial de focalización GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10.1371 /journal.pone.0125474
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, CHINA
Recibido: 10 Octubre, 2014; Aceptado: March 24, 2015; Publicado: 22 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto neoplasias humanas más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo, con un estimado de un millón de nuevos casos por año [1-4]. A pesar de los recientes avances en método de diagnóstico, técnica quirúrgica y los nuevos regímenes de quimioterapia, la tasa de supervivencia a largo plazo para la GC es todavía bastante baja [5, 6]. En muchos pacientes, la GC se diagnostica en etapa avanzada con extensa invasión y metástasis linfática. El éxito de las estrategias terapéuticas son limitadas y la mortalidad es alta [7]. Por lo tanto, es urgente para investigar los mecanismos moleculares fundamentales que subyacen a la resistencia a los medicamentos, la heterogeneidad histológica, y el desarrollo de metástasis para identificar nuevos marcadores para el diagnóstico y tratamiento de GC
.
Los microARN (miRNA) son pequeñas, aproximadamente el 22 -nucleotide, los ARN que funcionan como reguladores negativos de genes de codificación de proteínas a nivel postranscripcional no codificante [8, 9]. Mediante la unión a las secuencias complementarias en las regiones 3 'no traducidas (UTR en 3') de sus ARNm diana, miRNAs pueden inducir la degradación de ARNm o inhibición de la traducción [10 a 13]. aumento de la evidencia ha indicado que miRNAs están implicados en muchos procesos biológicos importantes, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, la angiogénesis y la respuesta inmune. La desregulación de miRNAs puede dar lugar a la expresión aberrante de genes en varias enfermedades, incluyendo el cáncer gástrico [14-16]. Sin embargo, la comprensión del papel y la función de miRNAs en el GC se encuentra todavía en la etapa inicial. Del mismo modo, las funciones de muchos otros miRNAs expresadas aberrantemente en el desarrollo de GC son todavía desconocidos.
regulación a la baja de miR-217 es un evento frecuente en varios tipos de cáncer, lo que sugiere su importante papel en la tumorigénesis [17-19]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel potencial de miR-217 en GC. En este estudio, la expresión de miR-217 se redujo en líneas celulares de GC y tejidos. Además, una menor expresión de miR-217was asocia con la etapa pTNM. La sobreexpresión de miR-217 suprime la invasión y proliferación de las células GC. Por otra parte, el ensayo indicador de luciferasa y Western Blot confirmó que la función de miR-217might como un supresor tumoral en GC por targetingGlypican-5 (GPC5).
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los pacientes participaron en el estudio y dieron su consentimiento informado por escrito. Este estudio y el consentimiento fue aprobado por el comité de ética del Instituto de YanAn El Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming y cumplimiento de la Declaración de Helsinki.
Las muestras de tejido
Las muestras de tejidos humanos y GC emparejados tejidos no tumorales gástricas-Junto que estaban a más de 5 cm de los tumores se obtuvieron de 50 pacientes que fueron sometidos a resección de la cirugía en el hospital el Afiliado YanAn de la Universidad de Medicina de Kunming. Las muestras frescas se snap nitrógeno inliquid congelados inmediatamente después de la resección y se almacenan a -80 ° C. Todas las muestras se obtuvieron con consentimiento informado de los pacientes y se confirmaron histológico mediante tinción con hematoxilina-eosina. El grado histológico de los cánceres se evaluó de acuerdo con los criterios establecidos por la Organización Mundial de la Salud. Ninguno de los pacientes recibió radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Las características de los pacientes se describen en la Tabla S1.
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de cáncer gástrico humano SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 y uno normal, línea de células epiteliales gástricas GES-1 (como control) se adquirieron en el Instituto de Bioquímica y Biología celular de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 se propagaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y GES-1 ha sido reproducida en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen). Todos los medios se complementaron with10 de suero bovino fetal%. Las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en un incubador humidificado de 5% de CO2.
extracción de RNA y QRT-PCR
ARN total fue extraído a partir de muestras congeladas (o las células) usando Trizol ( Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. 1 ml de ARN se utilizó para medir la expresión de miR-217 por RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) con los TaqMan miARN kit de transcripción inversa andtheTaqMan miARN-ensayo específico de cebadores de RT para miR-217 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). La expresión de U6 se utilizó como control interno. PCR en tiempo real se realizó con 1 ml de cada ADNc en un Paso uno System Plus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) en los duplicados. La expresión de miR-217 se definió en base al ciclo umbral (Ct), y los niveles relativos de expresión se calcularon AS22
- [(Ct de miR-217) - (Ct de U6)] después de la normalización con referencia a la expresión de U6 pequeños ARN nucleares [20, 21] (Tabla S2).
Western blot
la proteína total fue extraído de muestras congeladas (o las células) utilizando un kit de extracción de proteínas totales (KeyGen, Nanjing , china) según las instrucciones del fabricante. Medición de la concentración de proteínas se realizó utilizando un Kit de ensayo de proteínas BCA (KeyGen). Se realizó análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [22]. Los anticuerpos primarios utilizados para la transferencia de western fueron policlonal de conejo anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), monoclonal de ratón anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.).
Cell transfección
El miR-217 mímico, imitador de control (scramble), inhibidor de miR-217, el control inhibidor, Pez-GPC5 y vector de control fueron adquiridos de RiboBio (Guangzhou, china). Las células HGC-27 fueron sembradas en placas de seis pocillos a 30% de confluencia un día antes de la transfección. Lipofectamine2000 (Invitrogen) se utilizó para la transfección de plásmido solo o junto con oligonucleótidos de ARN.
ensayos de luciferasa
células de 8 × 10
3 se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 24-hincubation, una mezcla de 100-ng pLUC-3'-UTR, control negativo 5-pmol, miR-217mimic se cotransfectó con 20 ng de Renilla en las células usando Lipofectamina 2000. Veinticuatro hoursafter transfección, luciérnaga y Renilla luciferase actividades eran medida con un Sistema Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La eficiencia de transfección se normalizó por cotransfección con un vector reportero de Renilla.
La proliferación celular
Las células (3.000 /pocillo) se recogieron y se sembraron en 96-wellplates y se incubaron a 37 ° C después de la transfección. Después de la incubación durante 1 a 5 días, se añadió a los medios de comunicación de cada pocillo 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japón), y las placas se incubaron adicionalmente durante otras 3 horas a 37 ° C. A continuación, el medio se reemplazó con 150 ml de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich), y la absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas (Sunrise). El ensayo se repitió 3 veces con seis repeticiones.
transferencia de Northern
ARN total se aisló de cada tejido utilizando reactivo Trizol (Invitrogen Life Technologies) y la transferencia de Northern se realizó como se describe anterior [23] . Después de la hibridación perfecta Hyb Plus a 68 ° C, las membranas fueron desarrolladas y analizadas. Las transferencias Northern se hibridaron con un ARN 18S ribosomal (rRNA) de ADNc se utilizaron como controles.
invasión de células
Invasión ensayos se realizaron por triplicado utilizando Transwell cámaras de invasión recubiertas con Matrigel (BD, EE.UU.) como se describe en el protocolo del fabricante. Las células fueron transfectadas withmiR-217 imita, inhibidor o un oligonucleótido de control negativo, se cultivaron durante 48 h, y se transfieren en la parte superior de las cámaras de invasión recubiertas con Matrigel en un DMEM libre de suero (1 × 10
5 células por Transwell). que contiene suero de ternero fetal DMEM 10% se añadió a las cámaras inferiores. Después de la incubación durante 24 h, las células que permanecieron en la parte superior del filtro fueron lavadas y fuera de las células que migraron a la superficie inferior se fijaron in90% de alcohol y seguido por tinción con cristal violeta.
Histología
el diagnóstico histológico fue de acuerdo con el método de biopsia gástrica triple sitio. Los tejidos se fijaron durante la noche en formalina tamponada, se incluyeron en parafina, corte con el espesor de 3 m, y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H & amp; E). Tinción
El análisis estadístico
Se realizaron análisis estadísticos utilizando el paquete de software estadístico SPSS 17.0. Los experimentos se repitieron de forma independiente al menos tres veces, y los datos presentados como medias ± SD. La asociación entre el miR-217 y GPC5 se analizó mediante la prueba de correlación de Spearman. Se realizaron comparaciones entre los grupos para la significación estadística de Student apareado con dos colas t-test o ANOVA de una vía. P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultado
La expresión de miR-217 es downregulated en líneas celulares de GC
En primer lugar nos cuantificado el nivel de expresión de miR-217 en cuatro líneas celulares humanas GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) y GES-1 utilizando el norte de mancha (figura 1A). El nivel de expresión de miR-217 wasdecreased en líneas celulares de GC en comparación con GES-1. QuantitativeRT-PCR también mostró que la expresión de miR-217 se redujo en líneas celulares de GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) en comparación con GES-1, una línea celular epitelial gástrica normal (figura 1B ).
(a) El nivel de expresión de miR-217 en cuatro líneas celulares humanas (GC SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) y GES-1 se cuantificó mediante transferencia de Northern . (B) La expresión de miR-217 estaba evaluando en líneas celulares de GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) andGES-1Usando RT-PCR cuantitativa.
miR-217 está regulado por disminución en los tejidos GC
RT-PCR cuantitativa se utilizó para examinar el miR-217 expresión en 50 tejidos GC y sus tejidos adyacentes no cancerosos pareadas. Las características histológicas representativas de GC y los tejidos no cancerosos adyacentes emparejados se muestran en la figura 2A. Entre 50 tejidos tumorales, 44 casos mostraron una disminución de la expresión de miR-217 en comparación con los tejidos adyacentes normales (88%, 44 de 50, la figura 2B). La expresión de miR-217 fue menor en los tejidos de GC que en los tejidos cancerosos adyacentes (Figura 2C). . Por otra parte, los niveles más bajos de expresión de miR-217 asociados con la etapa pTNM de los pacientes GC (figura 2D)
(A) Los tejidos fueron histológico confirmó mediante H & amp; E tinción. (Aumento original, × 100). (B) de miR-217 se detectó en 50 pacientes con cáncer gástrico mediante PCR en tiempo real. Los datos se presentan como log 2 T /N de veces el cambio de los tejidos de GC con relación a los tejidos adyacentes no tumorales. (C) La expresión de miR-217 en los tejidos de GC en comparación con los tejidos normales. La expresión de miR-217 se normalizó a U6 snRNA. (D) El análisis estadístico de la asociación entre el nivel de miARN y la etapa pTNM (I, II, III y IV). * P & lt; 0,05, y ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001. Utilizó un modelo lineal se realizó para su análisis.
miR-217 inhibe la proliferación celular y la invasión GC
La expresión de miR-217was aumenta en las células HGC-27 transfectadas utilizando el miR-217 (imita la figura 3A) y disminuyó el uso de miR-217 inhibidor (figura 3B). La proliferación se redujo en las células HGC-27 transfectadas withmiR-217 imita comparación con las células transfectadas con scramble o sin tratar (Fig 3C). Mientras tanto, la proliferación se incrementó en HGC-27 células transfectadas withmiR-217inhibitor comparación con las células transfectadas con el control o sin tratar (Fig 3D). La invasividad de las células transfectadas con el miR-217 se imita disminuyó en comparación con el grupo de lucha o las células del grupo de control y miR-217 inhibidor de aumento de la invasión de células en comparación con las células de grupo en grupo scramble o de control (Figura 3E)
.
( a) en tiempo real RT-PCR análisis de miR-217 en HGC-27 después de la transfección las células ofmiR-217 imitan. La expresión de miR-217 en células HGC-27 transfectadas con el miR-217 imita fue hasta regulated.U6 snRNA se utilizó como control interno. (B) La expresión de miR-217 en células HGC-27 transfectadas con el miR-217inhibitor estaba abajo-regulated.U6 snRNA se utilizó como control interno. la expresión (C) ectópico miR-217 inhibe la proliferación celular significativamente, como se demuestra por el ensayo de CCK8. (D) Inhibición de la expresión de miR-217 promovió significativamente la proliferación celular, como se demuestra por el ensayo de CCK8. (E) Análisis de la invasión del HGC-27cells después del tratamiento withmiR-217 imita, inhibidores o lucha o control; la proporción relativa de células invasivas por campo se muestra a continuación, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
miR-217 reduce la expresión postranscripcional GPC5 apuntando directamente sus 3'UTR
Análisis utilizando algoritmos disponibles indicaban que era un gen GPC5 objetivo teórico de miR-217 (figura 4A) [24]. Para demostrar que el miR-217 dirija directamente a GPC53'UTR, hemos realizado ensayos de gen reportero de luciferasa. Ectópica de miR-217 en la actividad luciferasa reducida del gen indicador de tipo salvaje GPC5 pero no el mutante GPC5 3'UTR, lo que indica que el miR-217 dirija directamente a GPC5 3'UTR (Figura 4B). El nivel de ARNm de GPC5 se redujo después de la transfección con el miR-217 imita y se incrementó después de la transfección con el inhibidor de miR-217 usando QRT-PCR (Figura 4C). En concordancia con este resultado, la capacidad de miR-217 para regular la expresión de la proteína GPC5 fue verificado por el Western Blot (Figura 4D).
(A) El 3'-UTR del ARNm GPC5 contiene las secuencias de unión de miR-217. (B) se muestra la actividad de luciferasa relativa de la GPC5reporter indicado construir en HGC-27cells. Los valores de luciferasa de luciérnaga se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla y se representan en la actividad luciferasa relativa. (C) miR-217 sobreexpresión redujo significativamente los niveles de ARNm de GPC5 en las células HGC-27 y el inhibidor de miR-217 mejora de forma significativa los niveles de mRNA en GPC5 las células HGC-27. (D) La transferencia Western se realizó para examinar los efectos de miR-217 en la expresión de GPC5. También se detectó GAPDH como control de carga.
Restauración de miR-217 inhibe la proliferación celular mediada por GC GPC5 y la invasión
La sobreexpresión de GPC5 promovió la proliferación celular y la invasión GC. Cuando el miR-217 mímica y Pez-GPC5 se cotransfectaron en células HGC-27, miR-217 redujo la expresión de la proliferación celular inducida por GC GPC5-e invasión (Figura 5A y 5C). La inhibición de la GPC5 redujo la proliferación celular y la invasión GC. Cuando el miR-217 inhibidor y shGPC5 se cotransfectaron en células HGC-27, miR-217 inhibidor promovió la proliferación de las células shGPC5 inhibida y la invasión (Figura 5B y 5D).
El crecimiento de las células (A) en HGC- 27co-transfectadas con cualquiera de miR-217 imitan o 2,0 g pez-GPC5 o pCDNA vector vacío usando el ensayo de CCK-8 proliferación. (B) El crecimiento de las células en HGC-27co-transfectadas con cualquiera de miR-217 inhibidor o 2.0 g shGPC5 (golpes abajo GPC5) o pCDNA vector vacío usando un ensayo de proliferación de CCK-8. (C) La célula invasora en HGC-27co-transfectadas con cualquiera de miR-217 imitan o 2,0 mg Pez-GPC5 o pCDNA vector vacío usando un ensayo de invasión. (D) La células invasoras en HGC-27co-transfectadas con cualquiera de miR-217inhibitor o 2.0 mg shGPC5 o pCDNA vector vacío usando un ensayo de invasión. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
GPC5 es upregulated en líneas celulares y muestras de GC
La expresión de GPC5 siendo superior en el líneas de células GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) en comparación con GES-1, una línea normal gástrico de células epiteliales (figura 6A). Los niveles de proteína de GPC5 también fueron más altos en los tejidos de GC que en los tejidos cancerosos adyacentes mediante Western blot (Figura 6B).
(A) La expresión de mRNA CPG5 estaba evaluando en líneas celulares de GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) y GES-1 mediante RT-PCR cuantitativa. (B) El nivel de proteína CPG5 en ocho tejidos humanos GC y sus controles normales adyacentes se cuantificó mediante western blot.
Discusión
GC hace casi un millón de muertes en todo el mundo por año [ ,,,0],25]. Recientemente, la acumulación de evidencia ha sugerido que los miRNAs juegan un papel crucial en la patogénesis de la GC a través de la regulación de la proliferación celular, apoptosis, migración, invasión anuncios [26-28]. En este estudio, el miR-217 se downregulated con frecuencia en líneas de células y tejidos humanos GC y el nivel inferior de miR-217 se asoció con la etapa pTNM de GC. Otros experimentos indican que la sobreexpresión de miR-217 puede suprimir la migración celular y la invasión GC. GPC5 fue identificado como un objetivo directo y funcional de miR-217. Concluimos que miR-217 parece ser un nuevo supresor tumoral en GC y que downregulated miR-217 puede contribuir al desarrollo y progresión del tumor en pacientes GC. Regulación a la baja de miR-217 es un evento frecuente en varios tipos de cáncer, lo que sugiere su importante papel en la tumorigénesis [17-19]. Li y sus colegas mostraron que el miR-217 se había reducido regulado en células claras carcinoma de células renales (ccRCC) en comparación con el tejido normal emparejado [29]. Bajo nivel de expresión de miR-217 se asoció con un mayor grado y estadio tumoral. En este estudio, el miR-217 fue con frecuencia downregulated en GC. Curiosamente, los pacientes con una menor expresión de miR-217 tendían a tener el estadio TNM más avanzada, lo que sugiere que la baja expresión ofmiR-217was asociados con la progresión de la GC. Otros estudios demostraron que la sobreexpresión de miR-217 invasión celular y la proliferación de GC suprimida. Junto con los resultados anteriores, estos datos sugieren que el miR-217might juegan un papel crucial en la homeostasis del tejido y la GC-217 deregulatedmiR podría contribuir al desarrollo de una neoplasia del estómago.
Para investigar el mecanismo molecular de la función supresora de tumores de miR-217 en GC, se utilizó el ensayo indicador de luciferasa y Western blot para confirmar que GPC5 era un objetivo de miR-217 en células GC. Para confirmar la regulación directa de GPC5 por el miR-217, se utilizó GPC 3 'UTR vector indicador que lleva el sitio de unión de miR-217 potencial en el indicador fluorescente. Por otra parte, QRT-PCR y Western blot mostraron que la sobreexpresión de miR-217 inhibe la expresión de GPC. Glypicans son una familia de proteoglicanos que están unidos a la superficie exocytoplasmic de la membrana plasmática a través de un anclaje de glicosil fosfatidilinositol [30, 31]. Seis glypicans se han identificado en los mamíferos (GPC1 a GPC6) [32, 33]. GPC5 se expresa principalmente en el desarrollo del sistema nervioso central, extremidades, riñón, pulmón e hígado [34, 35]. Estudios recientes han indicado que algunos centros mundiales de producción, especialmente GPC3 andGPC5, podría desempeñar un papel importante en la regulación de la progresión del cáncer [35, 36]. Por ejemplo,
Zhang
et al. mostró que GPC5 fue altamente expresado en SACC-M (alta línea de células de pulmón metastásico) y en muestras clínicas de carcinoma adenoide quístico salival (SACC) de los casos con metástasis de pulmón [36]. El nivel de expresión general de GPC5 en casos clínicos de SACC con metástasis pulmonar fue mayor. Williamson et al. mostraron que los GPC5was gen que codifica amplificados en 20% de los pacientes con rabdomiosarcoma alveolar (RMS) y que esta glipicano se sobreexpresa en pacientes RMS. Por otra parte, la baja regulación de la expresión GPC5 de siRNA inhibe la tasa de proliferación de las células de RMS. Otro estudio encontró que los altos niveles de expresión GPC5 predijeron tiempos de supervivencia posquirúrgicas pobres para los pacientes con CPNM respetados de forma curativa, lo que sugiere el valor de GPC5 como indicador de pronóstico molecular [35, 37]. En nuestro estudio, la expresión de GPC5 fue mayor en las líneas celulares de cáncer gástrico y la niveles de proteína de GPC5 también fueron más altos en los tejidos de GC que en los tejidos cancerosos adyacentes. La inhibición de la GPC5 redujo la proliferación celular y la invasión GC. Restauración de miR-217 inhibe la proliferación celular mediada por GC GPC5 y la invasión. Estos resultados demostraron que actúan miR-217might como un supresor tumoral en el cáncer gástrico por la orientación GPC5.
En conclusión, el presente estudio demostró que el miR-217was regulados a la baja en los tejidos y líneas celulares de GC. Los bajos niveles de expresión de miR-217 se asociaron con pTNM etapa de los pacientes. La expresión ectópica miR-217 dio como resultado la inhibición de la proliferación celular y la invasión GC. Investigaciones posteriores revelaron que GPC5 era un objetivo potencial de miR-217. miR-217 puede servir como un predictor de pronóstico y una diana terapéutica para pacientes con cáncer gástrico.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Resumen de los parámetros clínico de los pacientes con cáncer gástrico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s001 gratis (DOCX)
S2 tabla. secuencia del cebador
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s002 gratis (DOCX)