Extracto
Aplicaciones
El propósito de este estudio fue determinar si microARN perfil de orina y plasma en la prostatectomía radical puede distinguir potencialmente letal de cáncer de próstata indolente.
materiales y Métodos
Un grupo de microARN se perfila en el plasma de 70 pacientes y la orina de 33 pacientes recogidos antes de la prostatectomía radical. La expresión de microRNAs se correlacionó con los criterios de valoración clínicos en un período de seguimiento de 3,9 años para identificar microRNAs que pueden predecir la respuesta clínica después de la prostatectomía radical. Se aplicó un enfoque de aprendizaje de máquina para poner a prueba la capacidad predictiva de todos los microRNAs perfiladas en la orina, plasma, y una combinación de ambos, y el rendimiento global de evaluó mediante el área bajo la curva característica operador receptor (AUC). Validación de la expresión de miRNAs urinaria se realizó en una cohorte independiente adicional de 36 pacientes.
Resultados
El mejor predictor en el plasma utilizando ocho miRs produjo sólo el rendimiento predictivo moderada (AUC = 0,62). El mejor predictor de la enfermedad de alto riesgo se logró utilizando el miR-16, miR-21 y miR-222 se mide en la orina (AUC = 0,75). Esta combinación de tres microRNAs en la orina fue un mejor predictor de la enfermedad de alto riesgo que cualquier persona microARN. Utilizando una metodología diferente, se encontró que este conjunto de miRNAs no fue capaz de predecir de alto volumen, enfermedad de alto grado.
Conclusiones
Nuestros hallazgos iniciales sugieren que el plasma y la orina de perfiles de microRNAs en el radical La prostatectomía puede permitir que el pronóstico del comportamiento del cáncer de próstata. Sin embargo, se encontró que el patrón de expresión de microARN no pudo validar en una cohorte independiente de pacientes que utilizan una plataforma diferente para PCR. Esto pone de relieve la necesidad de cohortes independientes de pacientes validación y sugiere que las firmas de microARN urinarios en la prostatectomía radical puede no ser una manera robusta para predecir el curso clínico de la enfermedad después del tratamiento definitivo para el cáncer de próstata
Visto:. Sapre N, Hong MKH, Macintyre G, H Lewis, Kowalczyk A, Costello AJ, et al. (2014) Los microARN Curada en la orina y la sangre no consigan validarse como predictivo Biomarcadores de alto riesgo de cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (4): e91729. doi: 10.1371 /journal.pone.0091729
Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Puerto Oncología, Portugal
Recibido: 24 Septiembre, 2013; Aceptado: 14 Febrero 2014; Publicado: 4 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Sapre et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. NS es apoyado por becas de postgrado de la Cancer Council Victoria, Fundación Cybec y el Real Colegio de Cirujanos de Australasia. Este estudio fue apoyado por fondos del Gobierno de Australia para el australiano cáncer de próstata Investigación Epworth. AK y GM son compatibles con NICTA. NICTA es financiado por el Gobierno de Australia como el representado por el Departamento de Banda Ancha, Comunicaciones y Economía Digital y el Consejo de Investigación Australiano a través del Centro TIC del programa de excelencia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de próstata se caracteriza por sus resultados claramente variables e impredecibles. La introducción de la prueba del antígeno prostático específico (PSA) se ha traducido en un aumento dramático en la detección precoz del cáncer de próstata (CaP) y una migración del estadio de tal manera que más hombres con CaP etapa temprana ahora están siendo diagnosticados con la enfermedad [1], [2 ]. Sin embargo, la prueba no es ni específico de la costra [3] ni permite para una adecuada estratificación del riesgo y selección de aquellos pacientes susceptibles de sucumbir a su enfermedad después de un tratamiento radical temprana [4], [5]. La morbilidad asociada a los tratamientos típicos ha dado lugar a una gran cantidad de estudios sobre el desarrollo de biomarcadores en un intento de identificar a los pacientes con más probabilidades de beneficiarse de la intervención oportuna para reducir su riesgo de recurrencia y metástasis [6].
A pesar de que mucha investigación está dirigido a la búsqueda de biomarcadores que pueden mejorar las tasas de detección del cáncer de próstata más de PSA, la cuestión clave clínicamente, es la detección de CaP de alto riesgo en una etapa temprana y curable. Mientras que la mayoría de los casos sigue un curso indolente y no requieren tratamiento curativo, algunos tipos de cáncer tienen el potencial de hacer metástasis y requieren intervención temprana y agresiva, clínica. Sin embargo los modelos clínico-patológicos actuales no permiten a los médicos a discernir con precisión en una fase temprana entre el alto riesgo e indolente tapa [7]. Hay una necesidad clínica urgente de nuevos marcadores que discriminen indolente de los cánceres de próstata agresivos en una etapa temprana.
Los microARN (miRNA) son aproximadamente 22 nucleótidos de longitud, ARN de cadena simple, no codificantes que se unen a complementarios regiones "semilla" que se encuentran en la región no traducida 3 '(UTR) de especial de ARN mensajero (ARNm) especies. MiRNAs modular la expresión de sus objetivos de mRNA, o bien se les marcado para la destrucción o inhibición de su unión a maquinaria de traducción [8]. MiRNAs han demostrado estar involucrados en una amplia gama de importantes procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo los procesos del ciclo celular, el desarrollo, supervivencia, diferenciación, el crecimiento, la apoptosis y la respuesta inmune [8].
Varios estudios han demostrado la desregulación de los genes miARN es un mecanismo importante en la carcinogénesis de próstata [9], y que tales cambios pueden ser detectados en el suero de pacientes tapa [10], [11], [12], [13]. Hay varias ventajas de miRNAs como biomarcadores en fluidos biológicos. Biofluids tales como plasma y orina son menos invasivos para obtener comparación con el tejido y miRNAs están desreguladas frecuencia en el cáncer y el tejido exhiben expresión específica. Además, su expresión en la sangre y la orina es estable y puede ser cuantificada con sensibilidad por reacción cuantitativa en tiempo real en cadena de polimerasa (RT-PCR) [14]. Ha habido por lo tanto mucho entusiasmo sobre el potencial de miRNAs como biomarcadores de la tapa. Sin embargo algunos de estos estudios se han realizado validación sistemática de estos biomarcadores, lo que ha impedido su traducción clínica en el manejo de la NAC. muestras Además, la mayoría de estos estudios que han comparado la primera PAC al CP avanzado /metastásico han usadas recolectadas una vez que los pacientes han desarrollado la enfermedad metastásica. El objetivo de este estudio fue investigar si el perfilado de un panel de miRNAs en el plasma y en la orina de pacientes con cáncer de próstata primarios antes de la prostatectomía radical puede distinguir CaP indolente del fenotipo de alto riesgo y para validar los hallazgos en una cohorte independiente de pacientes.
Materiales y Métodos
ética Declaración
Este proyecto tuvo la aprobación ética completos de juntas de revisión institucional. Las aprobaciones de ética relacionados con este manuscrito son Royal Melbourne Comité de Ética del Hospital de Investigación Humana (HREC) n 2.006,073 y Epworth Salud HREC Nº 34506. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito completo por sus muestras a ser almacenados y utilizados para la investigación con la información del paciente y los formularios de consentimiento que fueron aprobados por los comités de ética.
Panel de microARN selección
Una revisión sistemática de la literatura se llevó a cabo en PubMed para encontrar microRNAs implicados en la iniciación de próstata y cáncer epitelial, la progresión y la metástasis de próstata utilizando los términos ' cáncer "y" microARN "en julio de 2011. El citan referencias de los estudios fueron revisados por otros artículos de interés. Se consideraron todos los artículos, incluyendo artículos originales, revisiones y resúmenes. Sobre la base de nuestra revisión se optó por un panel de 12 MIR para el perfil en plasma y 13 MIR para perfiles en la orina, todos los cuales tenían al menos 2 estudios independientes publicados que muestra la participación en la carcinogénesis del cáncer de próstata, dando preferencia a los que tienen concomitante de datos mecanicista de apoyo . Además incluimos RNU48 en nuestro panel como control endógeno putativo [15].
Selección de pacientes
A todos los pacientes con diagnóstico de CaP que fueron sometidos a prostatectomía radical en el Hospital Epworth 2003-2010 con PSA seguimiento detallado y los datos clínicos y patológicos completos fueron identificados a partir de una base de datos dedicada cáncer de próstata de forma prospectiva mantiene récord. La primera cohorte consistió en pacientes con alto riesgo de cáncer de próstata fenotipo (n = 33 muestras de plasma, 16 muestras de orina) y los pacientes con bajo riesgo o cáncer indolente fenotipo (n = 37 muestras de plasma, 17 muestras de orina). El segundo (validación) cohorte consistió en pacientes con alto riesgo de cáncer de próstata fenotipo (n = 22 muestras de orina) y los pacientes con cáncer de próstata fenotipo indolente (n = 14 muestras de orina). cáncer de alto riesgo se definió como grado de Gleason mayor que o igual a 7 y el volumen del tumor & gt; 1 cc o el desarrollo de la enfermedad metastásica o principios de la recurrencia bioquímica sugestiva de metástasis micro sistémicos (tiempo de duplicación corto PSA, no radioterapia de rescate, la persistencia PSA). cáncer indolente se definió como Gleason 6, T2a, PSA & lt; 10 y la supervivencia libre de PSA durante al menos 3 años (criterios de Epstein) [16]. Plasma y orina se recogieron de pacientes antes de la prostatectomía inmediatamente después de un examen rectal digital, snap-congelado y almacenado en nitrógeno líquido.
recopilación de datos clínicos
Los datos clínicos y patológicos relevantes se registraron de forma prospectiva y analizaron retrospectivamente. Los detalles de PSA de seguimiento se registraron de forma prospectiva y se actualizan anualmente. volúmenes de los tumores se midieron con precisión por planimetría computarizada en el momento de la evaluación histológica como se describe anteriormente [17]. El sistema (2002) clasificación TNM se usa para clasificar las muestras. La suma de la puntuación de Gleason y el estadio tumoral patológico fueron evaluados por separado. Para los pacientes que no experimentaron una recurrencia bioquímica durante el período de estudio, el seguimiento fue censurado en el momento de su última prueba de PSA grabado. Para los pacientes con más de un PSA postoperatorio registrado, el tiempo de duplicación del PSA (PSADT) se calculó utilizando el método de la pendiente de registro [18]. Para este estudio, la recurrencia bioquímica se define como un valor de PSA postoperatorio mayor que o igual a 0,2 ng /ml y en aumento, o un aumento del nivel de PSA por debajo de este umbral que se sentía por el médico tratante para representar una recurrencia y dio lugar a la institución de la terapia de rescate. recurrencia bioquímica significativa se define como la recurrencia de PSA con un tiempo de duplicación & lt; 6 meses, ya que se ha demostrado que es un predictor más precisa del desarrollo de metástasis y mortalidad específica por cáncer de recurrencia de PSA solo [19], [20]. Para los pacientes con persistencia de PSA primaria que fueron tratados inmediatamente con la terapia de rescate PSADT se asumió arbitrariamente como & lt; 6 meses. Obtención y utilización de esta información tenían la aprobación del Comité de Ética de la Salud Melbourne.
extracción de RNA
500 l de plasma u orina se descongelaron en hielo para la extracción de ARN total usando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion, TX, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones /condiciones: se utilizó 1,5 volúmenes de lisis /tampón de unión para la lisis celular, antes de la adición de homogeneizado, y el ARN se eluyó en 40 l de agua. eluciones de ARN se congelaron en hielo seco y se almacenan en -80 ° C.
RT-PCR
ARN se concentró a partir de 40 l a 15 l usando un Savant SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Carolina del Norte, EE.UU.) a 45 ° C /alta presión. La transcripción inversa se realizó en un termociclador (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) utilizando el Taqman microARN transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, CA, EE.UU.), según el protocolo de ensayo de ARN pequeño del fabricante con las siguientes modificaciones: se utilizó 7 ARN l como molde y los cebadores agrupados se utilizan para las 14 especies preseleccionadas miARN.
cohorte original.
cuantitativa en tiempo real PCR se realizó con el ADNc resultante sobre Taqman personalizados Tarjetas de baja densidad array (Applied Biosystems , CA, EE.UU.) con iniciadores de nuestro panel de miARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y la mediana incluidos en el análisis final. TLDA tarjetas se ejecutan en un sistema de PCR 7900HT Fast Real-Time.
Validación de cohortes.
preamplificación del cDNA sintetizado se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 2,5 l de cDNA a 12,5 l preamplificación Mastermix, 3,75 ul grupo de cebadores y 6,25 l de agua libre de nucleasa. Esta reacción se calentó a 95 ° C durante 10 min, 55 ° C durante 2 min, 72 ° C durante 2 min seguido de 12 ciclos de amplificación antes de calentar a 99 ° C durante 10 min. Los productos de reacción amplificados se diluyeron a 200 l utilizando 0,1 x tampón de Tris-EDTA (pH = 8). RT-PCR se desempeñasen en la ViiA 7 (Applied Biosystems, CA, EE.UU.), utilizando 0,5 ul ensayo de 20 × miARN, 0,1 l producto preamplificador, 5,0 l TaqMan PCR Universal Rápido Master Mix (2⊥), 4,4 l de agua libre de nucleasa eran combinado para una reacción de PCR 10 ul. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y la mediana incluidos en el análisis final.
Análisis
Datos
Pre-procesamiento.
Los umbrales para las carreras de PCR se crearon utilizando RQ Manager ( Applied Biosystems) y se comprueba manualmente para asegurar la cT correspondió al punto medio de la amplificación logarítmica. Todo observada Ct valores superiores a 34 se consideraron no expresaron y se puso a 34. Cualquier Ct valores indeterminados también se establecieron a 34. A medida que cada MIR fue perfilada por triplicado, cualquier valor réplica más del 20% con respecto a los otros dos valores se considera una atípico y retirado de análisis. A continuación se determinó el valor medio Ct para cada muestra y MIR a través de repeticiones.
Normalización.
RNU48 se perfila en cada muestra como control endógeno pero se consideró inapropiado para el plasma como en la mayoría de las muestras no se detectó (Figura 1a), considerados inapropiados para la orina, ya que era el MIR con la tercera más alta desviación estándar (Figura 1b), y mostró una expresión variable entre los grupos de alto riesgo y de bajo riesgo. Por lo tanto, se utilizó la normalización media geométrica, una normalización demostrado ser eficaz en el miR PCR de perfiles [21]
a) los valores de Ct para el control endógeno en todas las muestras en la cohorte de plasma. Una tomografía computarizada de 34 se considera sin ser detectados. b) la desviación estándar de los valores de Ct a través de muestras para cada uno de miR en la cohorte original de la orina.
análisis de la expresión diferencial.
La media Ct de las muestras pertenecientes a alto riesgo y baja grupos de Alto Riesgo se utilizó para calcular ΔΔCt. Pliegue de cambio se calculó como 2
-ΔΔCt. Se utilizó una prueba t de Student para calcular la significación de la diferencia entre los grupos de alto y bajo riesgo y el valor de p fue ajustada para la corrección de múltiples ensayos utilizando el método de Benjamini-Hochberg [22]
La selección de características y classifiaction .
se supone que los datos se da como una matriz, N características (MIR) para
M
muestras iE y con el vector de etiquetas dispuestas de tal manera que por y para las muestras restantes. Hemos utilizado dos métodos diferentes para la selección /ordenación de las características /MIR de más a menos "exigentes". El primer método utilizado fue la prueba t de Student clásica, que asigna al
i-ésimo de la función
scorewheredenote los medios anddenote las varianzas de la
i-ésima variable de
para las muestras de los dos grupos de interés, respectivamente. A continuación, las características se clasifican en orden descendente de los valores absolutos de la estadística, para. La segunda técnica, llamada
el baricentro de selección de características
, ocupa la función en el orden descendente de la magnitud de la diferencia entre las medias de los
i-ésima variable de
para las muestras de los dos grupos de interés.
Para varios subconjuntos de
t
principales características, generamos lineal classifiersfor una muestra, utilizando un algoritmo de máquinas de vectores soporte, que seleccionan los pesos
w
k
y el intercepto
b
minimizando la siguiente función: Aquí
C
es constante regularización ajustable, con un impacto relativamente débil en el resultado final en nuestro caso. Los resultados reportados han utilizado
C = 1.
Resultados
Los datos demográficos y las características clínico-patológicas de los pacientes de bajo riesgo y de alto riesgo en la cohorte 1 (cohorte de descubrimiento) en el plasma y la orina de perfiles brazos se resumen en la Tabla 1.
perfiles de microARN de plasma
la mayoría de los miRNAs se encontraban en concentraciones detectables en el plasma de pacientes con cáncer de próstata de alto riesgo el cáncer y el cáncer de próstata de bajo riesgo (Figura 2). Tres muestras mostraron tasas globales bajos de detección y se eliminaron de posterior análisis. sin agrupación se aplicó a las muestras a través de los 12 miRs perfiladas en el plasma para determinar si había separación entre los grupos de alto riesgo y de bajo riesgo. No parece haber ninguna separación aparente entre los grupos de alto y bajo riesgo. Se aplicó un procedimiento de selección de características y prueba el rendimiento de los 12 MIR por su capacidad para delinear el cáncer de próstata de alto riesgo de cáncer de próstata de bajo riesgo. La Tabla 2 muestra los resultados de nuestro procedimiento de selección de características. Utilizando tanto el t-test y procedimiento de selección de elemento de centroide, miR16 fue seleccionada como la característica más predictiva, sin embargo, la clasificación mostró resultados inestables a través de todos los MIR. La figura 3, muestra una curva ROC para miR16, lo que demuestra que el MIR en general tiene bastante pobre rendimiento con un área bajo la curva de 0,62. Mientras predictivo, decidimos que el rendimiento no era suficiente para justificar una mayor validación.
Las muestras han sido sometidas a la agrupación jerárquica sin supervisión, y los resultados se representan por el dendrograma en la parte superior de la imagen.
miR-16 no predice con precisión la probabilidad de enfermedad de alto riesgo en el desarrollo de la prostatectomía radical (AUC = 0,62).
microARN perfil de orina
Descubrimiento cohorte.
En el cribado de orina, todas las muestras mostraron un nivel detectable de expresión para los MIR seleccionados (Figura 4). agrupamiento no supervisado de las muestras en todos los MIR mostró una separación moderada de bajo riesgo y de alto riesgo muestras (Figura 4). MIR 16, 20a, 21, 34a, 145, 106b, 182, 205, 221, 222, 331 y 375 se detectaron a niveles más altos en el grupo de alto riesgo, mientras que el miR 218 se detectó a niveles más bajos en la orina de alto riesgo pacientes con cáncer de próstata. De estos miRs todos menos el miR 218 fueron significativamente diferentes entre los grupos de riesgo alto y bajo (valor Q & lt; 0,1) como se muestra en la Tabla 3. El factor de cambio para los miRNAs, que fueron significativamente upregulated osciló entre 2,17 (MIR 145) a 8.09 (MIR 222) como se muestra en la Tabla 3. Para determinar el conjunto mínimo de MIR que mostró la mejor separación de los grupos de alto y bajo riesgo, que utiliza un procedimiento de selección de características de los cuales los resultados se pueden ver en la Tabla 4. Tanto el t- característica de la prueba procedimiento de selección y el procedimiento centroide seleccionado miR16 y Mir222 como las características más predictivos. Más allá de esto, el ranking de rendimiento MIR era inestable. Por lo tanto, elegimos Mir222 y miR16 para su validación. Además, también elegimos miR21. A pesar de que no los primeros puestos en el procedimiento de selección de características, que lo seleccionamos como una característica que era probable que sea independiente de Mir222 y miR16, como el menos correlacionada MIR dentro del cluster que contiene Mir222 y miR16 (Figura 4). Hemos probado el rendimiento de todas las combinaciones de los MIR 3 y los tres combinados mostraron el mejor desempeño de las AUC = 0,75 (Figura 5). Nosotros consideramos esto un rendimiento suficiente para su posterior seguimiento y buscó una cohorte de validación.
Las muestras han sido sometidas a la agrupación jerárquica sin supervisión, y los resultados se representan por el dendrograma en la parte superior de la imagen.
16 MIR, MIR 222 y miR 21 a predecir el cáncer de próstata de alto riesgo con una AUC de 0,75.
cohorte de validación.
Los datos demográficos y características clínico-patológicas de los pacientes de bajo riesgo y de alto riesgo en la cohorte 2 (cohorte de validación) se resumen en la Tabla 5. la validación se realizó solamente para la expresión urinaria como el clasificador para la expresión de plasma de miARN produjo un rendimiento moderado.
Elegimos MIR 16, 21 y 222 para la validación en una cohorte independiente de los cánceres de bajo riesgo y de próstata de alto riesgo. Elegimos un método diferente de los perfiles de miRNAs en la cohorte de validación para probar la robustez, como se describe en los métodos. Para la prueba de uniformidad de la detección a través de las dos plataformas, que perfiló las muestras de la cohorte original en la nueva plataforma y observamos la correlación de los valores de Ct entre las plataformas para los tres miRs. Los tres miRs mostraron una alta correlación entre las plataformas (Figura 6) lo que sugiere que la detección de estas MIR era robusto. Su desempeño como predictores de enfermedad de alto riesgo también fue comparable en todas las plataformas (Figura 7, AUC = 0,72). Sin embargo, como se muestra en la Tabla 6, en la cohorte de validación, se encontró que los tres miRNAs se detectaron sorprendentemente en los niveles más bajos en el grupo de alto riesgo, en comparación con el grupo de bajo riesgo: MIR 16 (FC = 0,07, q = 0,08 ), MIR 21 (FC = 0,14, q = 0,10) y MIR 222 (FC = 0,14, p = 0,10). Cuando se utilizó el clasificador construido en la cohorte original usando los tres MIR en la cohorte de validación, se logró un rendimiento del AUC = 0,35 (Figura 7).
R
2 representan los valores de correlación de Pearson.
pacientes con cáncer de próstata a partir de la cohorte original (azul). pacientes con cáncer de próstata a partir de la cohorte de validación (rojo).
Evaluación de la metodología de los genes miARN perfiles.
Para evaluar si este cambio en el patrón de expresión de los miRNAs se debió a diferencia metodológica, perfilamos para los tres miRNAs utilizando metodologías tanto en la cohorte de descubrimiento original. Hemos encontrado que el uso de ambas metodologías, se detectaron los tres miRNAs en los niveles más altos en el grupo de alto riesgo en la cohorte de descubrimiento original. Comparación de la expresión de estos tres miRNAs utilizando metodologías tanto en la cohorte original mostró una buena correlación (Coeficiente de correlación R
2 = 0,96 (MIR 16), R
2 = 0,91 (MIR 222) y R
2 = 0,86 (MIR 21)), confirmando que la diferencia observada se debió a la variación biológica en lugar de la variación metodológica.
Discusión
la predicción de CaP de alto riesgo sigue siendo un reto y esto se basa nuestra actual de sobretratamiento cánceres biológicamente insignificantes. Para cualquier biomarcador para ser traducido con éxito al ámbito clínico, debe soportar una validación suficiente en cohortes independientes de pacientes y demostrar la robustez metodológica. En este estudio hemos puesto de relieve la importancia de la validación de los resultados en una cohorte independiente utilizando plataformas metodológicas alternativas. En la cohorte original, encontramos que el miR 16, 222 y 21 fueron regulados por incremento en el cáncer de próstata de alto riesgo en comparación con el cáncer de bajo riesgo y perfiles urinaria de MIR 16, MIR 222 y miR 21 años, fue capaz de distinguir entre los tipos de cáncer que pueden tener un curso indolente de los cánceres biológicamente significativas después de la prostatectomía radical. Sin embargo se encontró que estos mismos miRNAs para ser detectado a niveles más bajos en una cohorte independiente de los cánceres de próstata de alto riesgo en comparación con los cánceres de bajo riesgo. Esto está en contraste con los resultados de la cohorte original. Por lo tanto perfilado para estos miRNAs en el plasma o en la orina, en nuestro estudio, no distinguían entre robusta de bajo riesgo y de alto riesgo de CaP.
Teniendo en cuenta que el uso de estos miARN perfiles de ambas metodologías distintas de la cohorte original descubrimiento produjo similares resultados, esto es más probable que represente una verdadera variación biológica en lugar de una diferencia debido a la variación metodológica. Las tarjetas TLDA son relativamente una nueva plataforma para la realización de PCR que no se han sometido a un intenso validación, pero han sido utilizados por muchos grupos anteriormente para la cuantificación de la expresión de genes [23], [24], [25]. Perfilado de MIR 16, 21 y 222 en las muestras de la cohorte original mediante las dos metodologías diferentes mostró que los resultados se correlacionaron bien. Esto confirma que la metodología experimental fue robusta y los resultados son indicativos de una verdadera variación biológica en la expresión de estos miRNAs en los dos grupos independientes.
El análisis de orina como una herramienta de diagnóstico o pronóstico no tiene precedentes. Los niveles de proteína, ARNm, miARN e incluso la metilación del gen en la orina se han correlacionado con la presencia del cáncer y la agresión en los estudios anteriores [26], [27], [28], [29], [30]. Además, otros han encontrado orina para ser una mejor fuente de material de próstata que el plasma [28]. El método de estas sustancias celulares que llegan a la orina es probable que a través de transporte de las células cancerosas a través del sistema de conductos de próstata [30] o la vía exosomal [27].
Muchos estudios anteriores han estudiado la regulación de las especies miARN en la próstata cáncer de los tejidos en relación con benigna de la próstata, de alto grado primaria en relación con bajo grado, o metastásico en relación con cáncer primario [31], [32], [33]. Además, muchos de los miRNAs implicados en la iniciación del cáncer de próstata, la progresión y la metástasis se han caracterizado funcionalmente [34], [35]. Un trabajo reciente especies miARN también perfilados descubrió están regulados por incremento o regulados por disminución en el plasma o suero de pacientes con cáncer de próstata [10], [11], [12], [13], [36], [37]. Estos estudios han revelado que miRNAs específicos pueden ser útiles para una prueba de pronóstico no invasiva, pero sólo utilizando plasma o suero. Pocos estudios han perfilado para miRNAs en la orina de los pacientes con cáncer de próstata. Ellos han encontrado que varios miRNAs circulantes se expresan diferencialmente en el cáncer de próstata [10], [11], [12], [13], [36], [37], [38]. Algunos han encontrado que el miR 26a, 30c y dejar que 7 son expresados diferencialmente en el plasma o suero de pacientes con cáncer de próstata en comparación con aquellos con hiperplasia benigna de próstata (HBP) [12], [36]. Otros han comparado pacientes con bajo riesgo de cáncer de próstata de alto riesgo ya través de diversos estudios de miR-141, miR-375, miR-221, miR-21 y miR-145 han demostrado ser elevados en pacientes con alto riesgo o metastásico cáncer de próstata [10], [11], [37], [38]. Mientras que el miR 222 no ha demostrado ser significativamente predictivo de enfermedad de alto riesgo en los estudios anteriores [39], MIR 21 se ha demostrado ser elevados en el cáncer de próstata más agresivo en algunos estudios [11], [37]. Shen et al encontró que el miR 21 niveles correlacionados con el cáncer de la próstata Evaluación de Riesgos (CAPRA) las puntuaciones [11] y Agaoglu y sus colegas encontraron que el miR 21 niveles eran elevados en pacientes con tumores metastásicos en comparación con aquellos con enfermedad localizada [37]. Del mismo modo MIR 221 ha demostrado ser elevados en ambos estudios pero MIR 221 no fue consistentemente elevados en los tumores de alto riesgo en nuestra cohorte.
Sin embargo, estos estudios han producido en varias ocasiones diferentes firmas de miARN correr el riesgo de cáncer de próstata debido estratificar en mayor o menor metodología experimental, la falta de solidez de análisis estadístico y las definiciones no normalizadas de alto riesgo o cáncer de próstata de bajo riesgo. Hemos tratado de abordar algunos de estos problemas mediante el uso de métodos estadísticos robustos para el análisis de los resultados, así como el uso de definiciones estandarizadas de indolente (criterios de Epstein) y enfermedad de alto riesgo. La mayoría de los estudios anteriores no han incluido la validación de miRNAs significativos y por lo tanto carecen de la capacidad para demostrar la reproducibilidad de los datos [11], [12], [13], [36], [37].
otro punto a destacar es que las muestras en otros estudios realizados hasta ahora fueron tomadas de pacientes cuando se habían desarrollado la enfermedad metastásica. Si bien esto da una idea de la biología de la progresión del tumor, que no permite la estratificación del riesgo de los pacientes cuando todavía tienen enfermedad localizada y como tal no tiene una implicación clínica inmediata. Nuestro estudio es novedoso en que todas las muestras de plasma y orina se recogieron antes de la prostatectomía radical y por lo tanto en el momento de la estratificación del riesgo, la selección para el tratamiento y el pronóstico de los pacientes es de suma importancia.
Otras pruebas comercialmente disponibles para la estratificación del riesgo de cáncer de próstata son el PCA3 y la prueba de la PHI. La prueba de PCA3, que es una prueba de mRNA basado en orina, es más específico para el cáncer de próstata que la prueba de PSA [30], [40]. Se ha demostrado ser útil en las decisiones de la biopsia de próstata sobre la base de una puntuación acumulativa calculada mediante la medición de la expresión de ARNm del gen de cáncer de próstata de guía. Más recientemente, se ha demostrado ser predictivo de cáncer de próstata "significativo" ya que no había una diferencia significativa en las puntuaciones de PCA3 de pacientes que cumplían los criterios de Epstein para los cánceres indolentes [41] y el cáncer "significativos" que se han considerado adecuadas para la prostatectomía radical. La prueba PHI que mide una isoforma diferente de PSA, el [-2] pro-PSA, se ha encontrado que es útil en la predicción de cáncer de próstata con Gleason score≥7 en pacientes con PSA de 2-10 ng /ml sin embargo no está asociado con el volumen de la próstata [42]. Sin embargo, ninguna de estas pruebas ayudan a determinar aquellas personas propensas a desarrollar la enfermedad metastásica después de la prostatectomía radical.
Existen algunas limitaciones de este estudio que necesitan ser enumerados. Sin control biológico aceptado para miRNAs en fluidos biológicos, no hemos normalizado los resultados de un gen 'casa de mantenimiento'. Varios controles endógenos se utilizan en los estudios de perfilado de tejidos. Sin embargo, cuando se utilizó RNU48 como control endógeno, se encontró que su expresión no fue consistente en los grupos de bajo riesgo y de alto riesgo. Con una perturbación tan sistemática en su expresión, era inadecuada como control endógeno. Con el tiempo, como miRNAs se estudian más en fluidos biológicos, ciertos controles biológicos podrían surgir. En segundo lugar la orina es un fluido corporal dinámica y concentraciones puede cambiar con el estado de hidratación y la patología renal. En nuestro estudio se recogieron inmediatamente antes de la prostatectomía radical todas las muestras de orina por lo tanto no es probable que sea un alto grado de uniformidad dentro de las composiciones de orina. La medición de los volúmenes de orina de 24 horas sería el estándar de oro para evaluar el estado de hidratación, pero esto es laborioso, costoso y plagado de bajas tasas de cumplimiento en el ámbito clínico. Medición de creatinina o la gravedad específica se mantienen otras posibilidades y alternativas potencialmente más factibles. Finalmente, nuestro tamaño de la muestra es pequeño.
Para concluir, el plasma aquí hemos mostrado y perfiles urinaria de miRNAs pueden no ser un marcador robusto para el pronóstico de la agresividad del cáncer de próstata y la enfermedad de alto riesgo. Este estudio pone de relieve la importancia de la incorporación de las cohortes de validación y robustez metodológica para asegurar la reproducibilidad de los datos en todos los estudios de biomarcadores futuras.