Extracto
A pesar de que el cáncer es una enfermedad genética, alteraciones epigenéticas están involucrados en su inicio y la progresión. Estudios anteriores han demostrado que la reprogramación de las células de cáncer de colon utilizando Oct3 /4, Sox2, Klf4, y cMyc reduce malignidad del cáncer. Por lo tanto, la reprogramación cáncer puede ser un tratamiento útil para células de cáncer de quimioterapia o radioterapia resistente. También se informó de que la introducción de pequeño tamaño, no codificante ribonucleótidos endógenos tales como microARN 302s (MIR) y miR-369-3p o -5p dio lugar a la inducción de reprogramación celular. miRs son más pequeños que los genes de factores de transcripción, por lo que posiblemente adecuado para uso en estrategias clínicas. Por lo tanto, hemos reprogramado células de cáncer de colon por medio de miR-302 y miR-369-3p o -5p. Esto dio lugar a la inhibición de la proliferación celular y la invasión y la estimulación del fenotipo de transición-mesenquimal a epitelial en células de cáncer de colon. Es importante destacar que, la introducción de los ribonucleótidos resultó en reprogramación epigenética de eventos de desmetilación del ADN y la modificación de las histonas. Además,
in vivo
administración de los ribonucleótidos en ratones suscitó la inducción de la apoptosis de células de cáncer, que consiste en la familia de proteínas Bcl2 mitocondrial. El presente estudio muestra que la introducción de miR-302 y miR-369s podría inducir la reprogramación celular y modulan fenotipos malignos de cáncer colorrectal humano, lo que sugiere que la entrega adecuada de ribonucleótidos de pequeñas dimensiones funcionales puede abrir una nueva vía para la terapia contra los tumores malignos humanos .
Visto: Ogawa H, Wu X, K Kawamoto, Nishida N, M Konno, Koseki J, et al. (2015) Los microARN Inducen epigenética reprogramación y suprimir los fenotipos maligna de las células del cáncer de colon humanos. PLoS ONE 10 (5): e0127119. doi: 10.1371 /journal.pone.0127119
Editor Académico: María Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
Recibido: 19 Enero, 2015; Aceptado: April 10, 2015; Publicado: 13 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Ogawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. dotaciones institucionales fueron recibidos parcialmente de Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (http://www.taiho.co.jp/english/), basada en la evidencia médico (MBE) Centro de Investigación (http://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd. (http://www.chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (http://www.yakult.co.jp/english/index.html), y Merck Co., Ltd. (http://www.merck.co.jp/en/index .html). Este trabajo fue apoyado también una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (http://www.mext.go.jp/english/;#23390199, 25112708 #,#25134711, 30253420 #,#26670604; MM, KM, Hawai); una subvención-en-Ayudas del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar (http://www.mhlw.go.jp/english/;#H23-003; M. M., H.I.); una subvención del Instituto Nacional de Innovación Biomédica (http://www.nibio.go.jp/english/index.html;#12-4; M. M., H.I.); y una beca de la Universidad de Osaka Drug Discovery Fondos (http://www.osaka-u.ac.jp/en/index.html; M. M., H.I.). apoyos parciales fueron recibidas de Takeda Ciencia y la Fundación de Investigación Médica (http://www.takeda-sci.or.jp/index.html; MM, HI), la princesa Takamatsu Cancer Research Fund (http: //www.ptcrf.or .jp /Inglés; MM, HI), Fundación Memorial Suzuken (http://www.suzukenzaidan.or.jp; MK), Fundación médica Yasuda (http://www.yasuda-mf.or.jp; NN), páncreas Research Foundation (http://www.jprf.or.jp/shoreisho.html; KK), Fundación Nakatani (http://www.nakatani-foundation.jp; HI), y la Fundación de Nakatomi de Japón (https: //www.nakatomi.or.jp/en/index.html; MK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dotaciones institucionales fueron recibidos parcialmente de Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (http: //www.taiho.co.jp/english/), basada en la evidencia médica (Centro MBE) Investigación (http://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd. (http: //www. chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (http://www.yakult.co.jp/english/index.html), y Merck Co., Ltd. ( http://www.merck.co.jp/en/index.html); No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Todas las células del cáncer se deriva en gran medida a partir de células madre o progenitoras de tejido somático normal a través genética y las alteraciones epigenéticas. Estas alteraciones inactivan el crecimiento en restricciones genes supresores de tumores (ETG) y activan oncogenes promotores del crecimiento. células somáticas normales se desarrollan a partir de un ovocito fecundado a través de un programa de epigenética. En particular, la introducción ectópica de genes de codificación definido, OCT3 /4, Sox2, Klf4 y c-MYC (OSKM), o OSK, que se expresan exclusivamente en las células madre embrionarias (CES), induce completo reprogramación de células somáticas diferenciadas de nuevo a células madre pluripotentes. Anteriormente puso de manifiesto que la introducción de OSKM en las células cancerosas epiteliales de órganos gastrointestinales modula el fenotipo maligno. Nuestros hallazgos sugieren que la reprogramación puede suprimir la invasión del cáncer, resistencia a los medicamentos, y la tumorigenicidad a través de la re-activación de la vía p16INK4A supresor de tumor por desmetilación de la secuencia promotora [1]. Por otra parte, un estudio reciente de ratón de factores OSK transgénicos mostró que las modificaciones epigenéticas están implicados en la iniciación del tumor y el desarrollo
in vivo
. Este estudio también demostró que, en combinación con la inactivación de señales TSG como mutante Apc, las modificaciones pueden orquestar alteraciones epigenéticas por el complejo del grupo Polycomb al módulo de núcleo de la histona H3 en la lisina-27 [2]. Tomados en conjunto con los resultados anteriores [1-6], alteraciones epigenéticas, independientemente de las causas o los resultados de los cambios genéticos, contribuir a la aparición y el desarrollo de tumores malignos y pueden ser atractivos para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas contra el cáncer humano.
Las aplicaciones terapéuticas que aumenten las vías de señalización endógenos deben tener un mínimo de toxicidad
in vivo
. En este sentido, el descubrimiento de fármacos a partir de microARN endógenos (miRNAs, MIR), ribonucleótidos no codificantes de pequeño tamaño (22 pb en promedio), son fuentes potenciales para estrategias terapéuticas innovadoras [7,8]. Debido miRs maduros sintetizados no se integran en el genoma, deben ejercer sus funciones sin eventos de integración genómica no deseados y, si se combina con un sistema de administración de fármacos, miRs podrían ejercer estos efectos específicos sobre dianas terapéuticas [7,8].
recientes estudios de descubrimiento de miR han identificado grupos críticos, como miR-302, que mejoran el efecto reprogramación en colaboración con la transferencia de factor de transcripción mediada por virus [9-12]. Se ha demostrado que un conjunto de tres MIR (miR-302, miR-369s y miR-200c) seleccionado de numerosos miRs expresa exclusivamente en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) /CES, provocada reprogramación [13]; un papel significativo para miR-367 también se muestra [12]. Según se informa, la introducción de miR-302 induce tanto la detención del ciclo celular al interferir con las quinasas dependientes de ciclina (CDK) y desmetilación global del ADN en el cáncer de hígado y melanoma
in vitro
[4,5,14]. A continuación, se estudió el efecto de miR-302 y miR-369s
in vitro
y
in vivo
. Estos resultados sugieren que la reprogramación del cáncer utilizando miR-302 y miR-369s puede ser una opción de tratamiento eficaz para el tratamiento del cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
colorrectal célula de cáncer líneas HT29, DLD-1, células SW480, HCT116, Caco2, COLO201, RKO, y Lovo y línea celular de teratocarcinoma NTERA (NTera 2 /cl.D1 [NT2 /D1]) se obtuvieron de RIKEN (Tsukuba, Japón). Estas células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Nakalai Tesque, Kyoto, Japón) con 10% de FBS (Gibco Life Technologies, Tokio, Japón) y 500 g /ml de penicilina-estreptomicina.
Transfección
MIR específicos y el control negativo (CN) MIR utilizan en
in vitro
y
in vivo
análisis se compraron (Gen Design Inc., Osaka, Japón; S1 Tabla). Las células fueron transfectadas con miRs específicos y NC MIR utilizando lipofección (LP) o carbonato de apatita (CA). En LP, las células fueron transfectadas con miRs utilizando Lipofectamine iMax (Invitrogen, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Cell reprogramación
células HT29 y células DLD-1 se transfectaron con 10 nM de cada una mediante el miR CA. Las células se incubaron en medio RPMI-1640 con 10% de FBS durante 24 h y transfección se repitió cada dos días para un total de tres veces. Después de la tercera transfección, las células se sembraron en Matrigel recubierto y mitomicina C fibroblastos embrionarios de ratón tratados con (MEF). Las células se cultivaron en medio de cultivo de células madre embrionarias que contiene DMEM /F12 (Gibco Life Technologies, Tokio, Japón), suplementado con GlutaMAX 2 mM, 20% de sustitución de suero knockout (Gibco Life Technologies), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA, Gibco Life Technologies), factor de 10 ng /ml de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, Wako, Tokio, Japón), 55 mM 2-mercaptoetanol (Gibco Life Technologies), 1% de penicilina-estreptomicina, e inhibidores químicos, incluyendo 0,5 M A83-01 (Stemgent , Cambridge, MA), 3 M CHIR99021 (Stemgent), y 0,5 M PD0325901 (Stemgent), a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora. El medio se cambió cada dos días y las células se mantuvieron a 37 ° C en un 21% de CO
2 incubadora durante un período adicional de 21 días. Durante este período, se controlaron estas células de cáncer para la formación de colonias de ES-similares. Estos fueron recogidos para su posterior análisis con fosfatasa alcalina (AP) Manchas en vivo (500 ×) (Invitrogen) utilizando un microscopio de fluorescencia todo-en-uno (BZ-9000, Keyence, Osaka, Japón), con capacidad fotográfica digital de la selección de acuerdo con el Instrucciones del fabricante. Para estudiar la eficacia de transfección MIR, LDN-1 células fueron transfectadas con BLOCK-iT Alexa control fluorescente (Invitrogen) con CA o LP. En resumen, las células sembradas DLD-1 en una placa de 6 pocillos se transfectaron con BLOCK-iT Alexa control fluorescente y se fotografiaron después de la transfección usando un microscopio Keyence BZ-8000. La intensidad de fluorescencia de las células transfectadas como se observa utilizando un clasificador de células FACS BD FACSAria III.
Luciferase ensayo
La región no traducida 3 '(3'-UTR) de CDK2 se amplificó por RT-PCR usando los cebadores 5'-CTAGCTAGCTAGCCTTCTTGAAGCCCCCA-3 'y 5'-CTAGCTAGCGAGCTACAAACTAAATTACA-3'. Los cebadores se subclonaron, se ligó en la expresión pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector (Promega) utilizando NheI, y se confirmaron por secuenciación directa. Los ensayos de luciferasa se llevaron a cabo utilizando 5 × 10
3 DLD-1 células sembradas en una placa de 96 pocillos. Las células se transfectaron usando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) en OptiMEM redujo medios de suero (Gibco) con 200 ng de vector vacío o vector de luciferasa-CDK2 3'UTR y, o bien NC MIR o miR-302 (concentración final, 25 nmol /L). La actividad de luciferasa se midió 24 h después de la transfección usando el Sistema Dual-Glo Luciferase Assay (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. nivel de luciferasa relativa se calculó como (Muestra Luc /Renilla muestra) /(Control Luc /Control de Renilla), donde Luc es la actividad luciferasa de luciérnaga y de Renilla prima es la actividad luciferasa de control interno de transfección.
Ensayo de proliferación celular
para evaluar la proliferación y la sensibilidad de las células cancerosas formadoras de colonias ES-como AP-positiva a 5-fluorouracilo (5-FU, Kyowa Hakko Kirin Co, Tokio, Japón), 1 × 10
3 células eran se expone a varias concentraciones de 5-FU durante 72 h en una placa de 96 pocillos. Se evaluaron las células viables utilizando los Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Tokio, Japón). Para evaluar la influencia de estos miRs indicados en la proliferación celular, las células HT29 y células DLD-1 (5 × 10
4 células /pocillo en una placa de 12 pocillos) fueron transfectadas con cualquiera de miR-302, miR-302, además de miR -369s, o NC MIR, como se ha descrito anteriormente. Las células se contaron todos los días durante tres días, a partir de las 24 h post-transfección.
análisis del ciclo celular
Para el análisis del ciclo celular por citometría de flujo, 5 × 10
4 células DLD-1 fueron transfectadas con cada uno de miR en una placa de 24 pocillos, se trataron con tripsina después de 72 h, se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se fijaron en 70% de etanol en hielo. Después de la centrifugación, las células se tiñeron con 50 mg /ml solución de yoduro de propidio (PI) (Dojindo Molecular Technologies) y 0,1 mg /ml de RNasa A (Invitrogen) y se analizaron por citometría de flujo utilizando un clasificador de células FACS BD FACSAria III. Cada histograma se construyó con los datos de al menos 10.000 eventos y se utilizó para calcular el porcentaje de la población de células en cada fase.
invasión de la célula de ensayo
ensayos de invasión Transwell se llevaron a cabo en 24 cámaras así modificados pre-recubiertas con Matrigel (BD BioCoat, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). DLD-1 células SW480 y las células fueron transfectadas con 10 nM de miR-302, miR-369s, 302s, además de miR-miR-369s y NC MIR usando CA. Después de 48 h, se tripsinizaron las células y se resuspendieron a una concentración de 10 × 10
se añadió 4 células /ml en medio libre de suero, y 0,5 ml de suspensión celular a la parte superior de cada pocillo. Después de 48 h de incubación, las células migran a la cámara inferior, que contiene 10% de SFB como quimio-atrayente, fueron fijadas y teñidas con tinción de Wright-Giemsa (Diff-Quick; Sysmex, Kobe, Japón). Cuatro campos al azar fueron contados por triplicado. Los datos se expresan como el valor medio con el error estándar de la media (SEM) de células invadidas en una proporción relativa en comparación con las células cancerosas tratadas con MIR NC.
La diferenciación celular estudio
Para determinar la capacidad de diferenciación de las células cancerosas formadoras de colonias ES-como generados
in vitro
, las células se cultivaron en cultivo flotante para formar cuerpos embrioides (EBS). Después de 4-5 días, EBS se transfirieron a placas recubiertas con gelatina al 0,1% y se cultivaron en medio RPMI-1640 con FBS al 10% durante 14 días.
ARN análisis
El ARN total se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen, Tokio, Japón). la calidad del ARN se evaluó con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) a 260 y 280 nm (A260 /280). Se llevó a cabo la transcripción inversa (RT) para MIR
in vitro Vaya con el kit de micro ARN de transcripción inversa Taqman (Applied Biosystems, Tokio, Japón). qPCR se realizó con lo universal Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems).
RT-PCR
expresión RNU48 in vitro y la expresión RNU6B in vivo se utilizaron como un control interno para determinar la expresión relativa del MIR. RT para MIR se realizó
in vitro
con miScript II RT Kit (Qiagen, Tokio, Japón). qPCR se realizó utilizando el Kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen). expresión RNU6B se utilizó como control interno. Los factores de cambio se calcularon y se normalizó utilizando el método de CT. los niveles de ARNm se analizaron utilizando el sistema de transcripción inversa (Promega, Tokio, Japón) y LightCycler FastStart Reaction Mix SYBR Green I en un LightCycler (Roche, Tokio, Japón). Todos los resultados se normalizaron a un control de GAPDH. estudios de expresión de ARN se repitieron de forma independiente al menos tres veces para confirmar la reproducibilidad.
El análisis de proteínas
Los niveles de proteína se determinaron por inmunotransferencia. Los anticuerpos contra Bak (1: 200, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), Oferta (1: 200, Santa Cruz), Bcl-2 (1: 1000, CST, Tokio, Japón), Bcl-XL (1: 1000, CST), MCL-1 (1: 1000, CST), Caspase8 (1: 1000, CST), Caspase3 (1: 1000, CST), CyclinD1 (1: 200, Santa Cruz), CDK2 (1: 200, Santa Cruz ), CDK4 (1: 200, Santa Cruz), E-cadherina (1: 1000, CST), vimentina (1: 1000, CST), ZEB1 (1: 1000, CST), fosfo-Rb (Ser807 /811) ( 1: 1000, CST), y el ACTB control interno (1:. 2000, Sigma Aldrich, Tokio, Japón) se utilizaron
inmunotransferencia
los sedimentos celulares se lisaron en hielo frío tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación con inhibidor de la proteasa. Las concentraciones de proteína se determinaron usando el ensayo de Bradford. Las proteínas se separaron en 4-10% Mini-PROTEAN prefabricados de geles (BioRad, Tokio, Japón). Después de la transferencia electroforética a una membrana de PVDF durante la noche, las membranas se bloquearon con bloqueo de una solución (Nacalai Tesque, Tokio, Japón) durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario indicado. Por último, las membranas se incubaron con secundario anti-ratón o-conejo IgG conjunto acoplado a peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare Life Sciences, Tokio, Japón) durante 1 h a temperatura ambiente. unión a proteínas diana de anticuerpo se visualizó mediante quimioluminiscencia utilizando ECL de Amersham Prime Western Blot detección reactivos (GE Healthcare Life Sciences).
inmunocitoquímica
Las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas dos veces con PBS y se impregnaron con 0,1% Triton X-100 durante 15 minutos a temperatura ambiente. La unión no específica fue bloqueada por incubación en cabra o de suero de caballo (Vectastain, Funakoshi, Tokio, Japón) durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron policlonal de conejo anti-humano Oct3 /4 (1: 400, MBL, Nagoya, Japón), policlonal de conejo Sox2 anti-humana (1: 400, MBL), monoclonal Nanog ratón anti-humana (1: 2000, CST ), monoclonal de ratón anti-humano Ki-67 antígeno (1: 400, DAKO), y el conejo monoclonal anti-humano de e-cadherina (1: 200, CST). El día siguiente, las células se lavaron dos veces con PBS y se trató con anticuerpo secundario durante 30 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anti-conejo IgG (H + L), F (ab ') 2 fragmento (Alexa Fluorr 488 Conjugado, 1: 1000, CST) o anti-IgG de ratón (H + L), F (ab') 2 fragmento (Alexa 555 Fluorr Conjugado) (1: 1000, CST). Los núcleos se tiñeron con el reactivo a prolongar Oro Antifade con DAPI (Invitrogen). Las imágenes fueron capturadas con un microscopio Keyence BZ-8000.
Se analizaron
análisis de la metilación del ADN
transfectadas-miR302 células de cáncer colorrectal DLD-1 para la metilación del ADN. Brevemente, las células fueron transfectadas con miR-302 o el control simulado. proteínas metilados se inmunoprecipitaron a partir del lisado celular usando proteína de unión a la metilación. Las muestras fueron secuenciados (Takara, Kioto, Japón) para obtener datos de metilación del ADN en todo el genoma en su conjunto. Se compararon los datos entre las dos muestras para determinar la respuesta de la metilación del ADN de miR-302 de la transfección.
Análisis de metilación de histonas
extracción de histonas y la medición de los niveles de metilación de las histonas globales 3 lisina-4 (H3K4 ) se realizaron utilizando el kit Mundial de la histona H3-K4 metilación de acuerdo con los protocolos del fabricante (Abnova, Taipei, Taiwán).
ratón estudio
los estudios en animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con los principios y procedimientos aprobados por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Osaka (número de autorización, 24-122-011). El ensayo de tumorigenicidad se realizó utilizando un
in vivo
modelo de xenoinjerto. En primer lugar, 5 × 10
6 células suspendidas en un volumen total de 200 l DMEM /Matrigel: se inyectaron (1 1 (v /v) de suspensión) en los flancos de ratones hembra de 7-8 semanas de edad (BALB /cAJcl-nu /nu). Cuando los volúmenes de tumor alcanzó 100 mm
3, tal como se mide con calibradores y calculado mediante la fórmula V = (ab
2) /2, donde a es la longitud y b es la anchura, los tumores se cosecharon y se cortaron en 3 -4 mm
3 secciones para el trasplante en serie. Secciones fueron confirmar vasculaturization por inmunohistoquímica usando CD31, un marcador endotelial vascular. xenoinjertos HT29 en serie trasplantados tenido la vasculatura más abundante, se distribuyó uniformemente por todo el tumor, y tenía la menor cantidad de necrosis central. complejos MIR /CA se administraron usando una aguja 30G a través de la vena de la cola. El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron una vez cada 3 días. Se recogieron los xenoinjertos de tumores y la sangre del ratón durante el sacrificio y conservados en formalina al 10% tamponada neutra para el estudio histológico e inmunohistoquímico estudios o en RNAlater ARN Estabilización de reactivo (Qiagen, Tokio, Japón).
carbonato apatita preparación
Para preparar una mezcla de transfección CA
in vitro en
, 2 g de cada uno de miR-302 (-a, -b, -c, -d), miR-369 (-3P, -5p) o NC MIR se mezcló con 4 l de 1 M CaCl
2 en 1 ml de bicarbonato libre de suero (44 mM) -buffered medio DMEM (pH 7,5) se incubó a 37 ° C durante 30 min, y se utiliza para la transfección [15- 17]. Este método se utiliza principalmente para la
in vitro
experimentos. Para
in vivo
experimentos, una solución inorgánica (0,9 mM NaH
2 PO
4, 1,8 mM CaCl
2, pH 7,5) sustituyó a la solución de DMEM. Por un ratón, se utilizó una mezcla de 15 g de cada uno de miR para inyección única. La solución se centrifugó a 12.000 rpm durante 3 min y el sedimento se disolvió en 200 l de solución salina que contiene 0,5% de albúmina. Los productos de la solución se sometieron a ultrasonidos (38 kHz, 80 W) en un baño de agua durante 10 minutos por debajo de 20 ° C para generar complejos MIR /CA, que fueron inyectados por vía intravenosa dentro de 5 minutos.
Las muestras de pacientes
se recogieron
las muestras clínicas durante la cirugía de nueve pacientes sometidos a resección quirúrgica para el cáncer colorrectal en el hospital de la Universidad de Osaka y sus hospitales relacionadas en 2005. los pacientes se resumen en la Tabla S2. Todos los pacientes estaban de acuerdo con el uso de las piezas resecadas en este estudio de acuerdo con las directrices aprobadas por la Junta de Investigación Institucional (protocolo aprobado#213).
El análisis inmunohistoquímico
El análisis inmunohistoquímico se realizó en 3.5 micras secciones en parafina procedentes de xenoinjertos. secciones incluidas en parafina se des-con parafina en Hemo-De (Farma) y rehidratada en una serie de etanol. Los portaobjetos se calentaron en tampón de recuperación de antígeno durante 40 minutos, se bloquearon con cabra o de suero de caballo para 20 min a temperatura ambiente, y se incubaron con antígeno de ratón monoclonal anti-humano Ki67 (1: 400, DAKO), policlonal de conejo anti-humano Oct3 /4 (1: 100, MBL), policlonal de conejo anti-humano Sox2 (1: 200, MBL), o anticuerpos monoclonales de ratón anti-humanos CK20 (DAKO) durante la noche a 4 ° C. El sistema Vectastain ABC (Vectastain, Funakoshi, Japón) se utiliza para visualizar antígeno. Contra-tinción se realizó con hematoxilina. Se llevó a cabo
inmunofluorescencia análisis
El análisis de inmunofluorescencia de 3,5 micras secciones incluidas en parafina de xenoinjertos de detectar los vasos del tumor. secciones incluidas en parafina se de-con parafina y se trataron como se ha descrito para inmunohistoquímica. Las secciones se bloquearon con suero de cabra durante 20 min a temperatura ambiente y se incubaron con anti-ratón de anticuerpo de rata CD31 (1:20, Dianova, Hamburgo, Alemania) durante la noche a 4 ° C. El día siguiente, el anticuerpo secundario IgG anti-rata (H + L), F (ab ') 2 Fragment (Alexa Fluorr555 Conjugado): se aplicó (1 1000, CST). Las secciones fueron teñidas con contra-Prolong Reactivo Antifade Oro con DAPI. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio Keyence BZ-8000.
azul Alcian tinción
tinción con azul Alcian se realizó en 3,5 micras secciones incluidas en parafina de xenoinjertos de detectar moco. En resumen, los portaobjetos se des-pareffinized en Hemo-De (Farma), rehidratada en una serie de etanol, por inmersión en ácido acético al 3% durante 3 min, y se tiñeron en solución de azul de Alcian (8GX azul 1 g de Alcian, 3 ml de ácido acético ácido, y 97 ml de agua destilada) durante 20 min. a continuación, se lavaron las secciones y los núcleos contrastados con Kernechtrot (TCI, Tokio, Japón) durante 5 min.
Apoptosis ensayo
El kit de Anexina V-FITC Apoptosis Detección (Biovision, Milpitas, CA) se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para
in vitro
detección de fase temprana y tardía de las células apoptóticas. En pocas palabras, para detectar la apoptosis
in vitro
, 20 × 10
4 células DLD-1 se transfectaron con miR-302, miR-369s, 302s MIR-MIR-369s, más o NC MIR mediante CA en una placa de 6 pocillos por triplicado de 60 h antes del ensayo. Las células se trataron con tripsina y se analizaron por citometría de flujo utilizando un clasificador de células FACS BD FACSAria III. Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado.
Para detectar roturas en el ADN en las células apoptóticas
in vitro
, se utilizó el sistema TUNEL fluorométrico DeadEnd (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, las células fueron transfectadas con cada uno usando el miR CA utilizando el Sistema de diapositivas Cámara Nunc Lab-Tek II (Fisher Scientific, Tokio, Japón). Los portaobjetos se lavaron las 48 h post-transfección y se fijaron en formaldehído al 4% en PBS durante 25 min a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron dos veces en PBS y se permeabilizaron en 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 5 min. Diapositivas luego fueron lavados en PBS, equilibrada en tampón de equilibrio durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se marcaron con TdT mezcla de reacción durante 60 minutos a 37 ° C en una cámara húmeda para evitar la exposición a la luz. Los portaobjetos se sumergió en 2X SSC durante 15 min para detener la reacción. Los núcleos se counterstained utilizando el reactivo con prolongar la Antifade Oro con DAPI. Las células apoptóticas se detectaron mediante un microscopio Keyence BZ-8000
.
Para detectar células apoptóticas
in vivo
, un ensayo de TUNEL se realizó según el protocolo del fabricante. En pocas palabras, las diapositivas se des-con parafina en Hemo-De, rehidratada en una serie de etanol, inmerso en NaCl al 0,85%, y se fijaron en formaldehído al 4%. Las células se permeabilizaron con una solución /ml de proteinasa K 20 mg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se equilibró con tampón de equilibración durante 10 min a temperatura ambiente y etiquetados con TdT mezcla de reacción durante 60 minutos a 37 ° C en una cámara humidificada. Los portaobjetos se sumergió en 2X SSC durante 15 min para detener la reacción. Los núcleos se counterstained utilizando el reactivo prolongar la Antifade Oro con DAPI. Las células apoptóticas se detectaron mediante un microscopio Keyence BZ-8000.
Resultados
expresión endógena de miR-302 y miR-369s en tumores primarios y líneas celulares de cáncer de colon de
estudios anteriores indicaron que el miR-302a, -B, -C, y d-(miR-302), miR369-3p, -5p (miR-369s) y miR-200c podría provocar la reprogramación celular en las células somáticas normales [13]. En este sentido, palneed para reprogramar las células de cáncer que utilizan estos MIR. Empezamos mediante la investigación de la expresión endógena de estos miRs en líneas celulares de cáncer de colon y muestras clínicas de cáncer de colon (Fig 1A y 1B). La expresión de miR-302 en el cáncer de colon fue muy baja o indetectable en comparación con la de las células NTERA teratoma humanos, que según los informes expresan genes-ESC específico y se utilizan como células control para evaluar la expresión génica ESC-como en muchos estudios [2, 3, 5, 11]. En cambio, la expresión de miR-200c fue alta en nueve tumores primarios examinados y muchas líneas celulares, tales como HT29. Los niveles de expresión de miR-302 y miR-369s fueron menores en comparación con la de miR-200c, lo que sugiere que la expresión de miR-200c es ya elevado en muchas células de cáncer de colon y puede ser resistente a la sobreexpresión exógeno. A continuación, transfectadas solamente miR-302 o miR-369s en células de cáncer de colon. Para optimizar
in vivo
experimentos, que imitan los tumores primarios, se estudiaron los patrones de tinción de inmunofluorescencia de CD31, un marcador endotelial vascular, usando DAPI para contrateñir los núcleos, en xenoinjertos de HT29, DLD-1 y células SW480 (Fig 1C). xenoinjertos HT29 tenían la vascularización más abundante, fue distribuida uniformemente sobre todo el tumor, y la menor cantidad de necrosis. Un análisis más detallado reprogramación del cáncer de miR-302 y miR-369s se realizó principalmente a las células HT29 y otras líneas celulares complementarias.
A) Expresión relativa de los endógenos de miR-302 (miR-302a, -B, -C, y d), miR-369s (miR-369-3p y -5p), y miR-200C en tumores primarios y líneas celulares de cáncer de colon. La línea celular de teratocarcinoma humano NTERA se utilizó como control. B) Expresión miRs en HT29, DLD-1 y SW480 células (n = 3). C) El análisis de inmunofluorescencia de la expresión de CD31 en xenoinjertos de HT29, DLD-1 y las células SW480. HT29 xenoinjertos mostraron muchas áreas CD31-positivas con poca necrosis. Barras de escala, 200 m. D) Expresión relativa de miR-302 y miR-369s en las células HT29 24 h post-transfección de 30 nm de miR-302, además de miR-369s (n = 3). NC, control negativo. E) Expresión relativa de miR-302 en células HT29 en los días 2 y 6 después de la transfección de miR-302 (n = 3). NC, control negativo. F) Para evaluar la eficacia de transfección, un oligómero de ARN de doble cadena marcado con fluorescencia se transfectadas con carbonato de apatita (CA) o lipofección (LP) en células DLD-1. La eficacia de transfección se evaluó por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo después de una sola transfección, como se indica. G) Expresión relativa de miR-302 en células HT29 48 h después de la transfección de CA o LP (n = 3).
exógena introducción de miR-302 y miR-369s provoca la reprogramación celular
Estamos transfectadas de miR-302, además de miR-369s en líneas celulares de cáncer de colon por medio de CA para alcanzar los niveles de expresión de miR similares a las de las células NTERA, que se utilizaron como control positivo (figura 1D) [13]. Se confirmó que el miR-302 se transfectaron de manera efectiva (Figura 1E). La eficacia de transfección usando CA fue mayor que la de LP en nuestras condiciones (Fig 1F y 1G). Por lo tanto, se utilizó el método de CA en todos los experimentos posteriores.
Para determinar si las células cancerosas pueden ser reprogramadas utilizando MIR, se analizó el efecto de la introducción de exógenas de miR-302 con y sin miR-369s tres veces durante período de la transfección. En el día 6, las células se tripsinizaron suavemente, se transfirieron a células de alimentación MEF, y se cultivaron durante 21 días adicionales en medio ES con tres inhibidores químicos (3i; 0,5 M A83-01, un inhibidor de ALK4 /5/7 receptor; 3 M CHIR99021 , un inhibidor de GSK-3β, y 0,5 M PD0325901, un inhibidor de MEK) (Fig 2A) [5,13,18]. colonias redondas fueron inducidos a la transfección de células HT29 con miR-302. Estas colonias fueron similares a los de los CES /iPSCs y aparentemente diferentes de las de las células parentales (figura 2B). CES /iPSCs son conocidos por ser la fosfatasa alcalina-positivas, así que tiñen las células utilizando el punto de acceso directo mancha (figura 2C) para identificar y seleccionar las colonias que consistían en células reprogramadas verdad [19]. Entre las células formadoras de colonias ES-como, AP
+ pero no AP
- células mostraron un aumento de los niveles de expresión de OCT3 /4, Sox2 y Nanog (Figura 2D) y miR-302 (Figura 2E). Las células transfectadas con miR-302, además de miR-369s o miR-302 solo eran AP
+ en cultivo después de 28 días de reprogramación. Estas células reprogramadas expresan proteínas marcadoras pluripotentes tales como Oct3 /4, Sox2, Nanog, y TRA-1-60 (Figura 2F).
A) Esquema de métodos de reprogramación del cáncer mediante transfección de miR-302 o miR 302s más miR-369s. B) miR-302 inducida por cambios morfológicos en las células HT29 en los días 1, 6 y 28. Reprogramado HT29 tiene una apariencia embrionaria madre-células similares. Las barras de escala, 100 m. C) Las células teñidas utilizando la fosfatasa alcalina (AP) mancha en vivo. Las barras de escala, 100 m. D) Expresión relativa de
OCT3 /4
,
Sox2
y
NANOG
comparación con AP
- células de QRT-PCR (n = 3). E) expresión relativa de miR-302 y miR-369s en AP
+, AP
-, y NTERA células.