Extracto
Antecedentes
microRNAs (miRNAs) han sido implicados en el control de muchos procesos biológicos y su desregulación se ha asociado con muchos tipos de cáncer. En los últimos años, la (CSC) concepto cáncer de células madre se ha aplicado a muchos tipos de cáncer, incluyendo pediátrica. La hipótesis de que una firma común de miRNAs desregulados en la fracción de células madre cancerosas puede explicar las vías de señalización alteradas en células madre cancerosas.
Metodología Resultados
El uso de un enfoque de alto rendimiento qPCR se identificaron 26 CSC asociada expresada diferencialmente miRNAs (Demirs). Utilizando el algoritmo BCmicrO se obtuvieron 865 objetivos potenciales asociados Demir CSC. Estos objetivos potenciales fueron sometidos a procesos biológicos y la vía KEGG análisis, Biocarta y Gene Ontología. Cuatro vías anotados fueron enriquecidos: ciclo celular, la proliferación celular, p53 y TGF-beta /BMP. El derribo de
hsa-miR-21-5p
,
hsa-miR-181c-5p
y
hsa-miR-135b-5p
utilizando oligonucleótidos antisentido y ARN interferente pequeño en líneas celulares llevado a la disminución de la fracción de CSC y el deterioro de la formación de esfera (ensayos sustitutos CSC).
Conclusión
Nuestros resultados indicaron que CSC asociada Demirs y las vías que regulan putativo puede tener potenciales aplicaciones terapéuticas en cáncer pediátrico
Visto:. Sánchez-Díaz PC, Hsiao TH, Chang JC, Yue D, Tan MC, Chen H-IH, et al. (2013) Los microARN-regulados en cáncer pediátrico De Células Madre Rutas diana implicada en la proliferación celular, ciclo celular y Desarrollo. PLoS ONE 8 (4): e61622. doi: 10.1371 /journal.pone.0061622
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 19 de septiembre de 2012; Aceptado: 11 de marzo de 2013; Publicado: 17 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Sánchez Díaz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. SEMP Russ Fundación de la Fundación de San Antonio (adjudicado a JYH), Prevención e Investigación del cáncer del Instituto de Texas (CPRIT, RP101195; adjudicado a GET y YC), Institutos nacionales de Salud (NIH-NCI P30CA54174; adjudicados a CITCh UTHSCSA, YC y NIH-NCATS UL1TR000149; adjudicado a CTSA UTHSCSA, YC), el Greehey de Becas de Postgrado en Salud Infantil (adjudicado a CCM) y el Fondo Círculo de Embajadores del Instituto de Investigación del cáncer de la Infancia Greehey financian parte de este trabajo. FACS se realizó en el Centro de Citometría de Flujo de recursos compartidos, que es apoyado por el NIH-NCI P30CA54174 (CITC UTHSCSA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miARN) son una clase abundante de pequeños ($ ~ $ 22 nucleótidos) no codificante del ARN de una sola hebra (ncRNA) que regulan la expresión génica a nivel post-transcripcional. Estos ncRNAs reguladores juegan un papel importante en el control de muchos procesos biológicos y su desregulación ha sido implicado en una variedad de condiciones patológicas, incluyendo muchos tipos de cáncer.
Nuevas pruebas apoya la noción de que la mayoría de los cánceres tienen su propia "células madre ", que se refiere como" células madre del cáncer "(CSC). Este reservorio de células madre similares dentro de la masa tumoral tiene la capacidad de auto-renovación y para sostener el crecimiento incesante de la masa. Varios estudios han demostrado que los miRNAs están involucrados en las decisiones de auto-renovación y destino celular de las células madre, el control del ciclo celular y el mantenimiento del equilibrio de la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [1], [2], [3], [ ,,,0],4]. Recientemente, los estudios han demostrado que los mecanismos que regulan la naturaleza auto-renovación de estas células son disfuncionales en las células madre de cáncer [5]. Proponemos que las características definitorias de células madre cancerosas pueden describirse en términos de un patrón coherente de la expresión del gen que está regulado por miRNAs específicos, expresados de manera aberrante coordinadas para el mantenimiento y la auto-renovación de las células madre del cáncer. La regulación de la autorrenovación y la capacidad de generar progenie se basa en los genes y mecanismos comunes. Este subconjunto de genes cuya expresión está desregulada por los miRNAs puede explicar las vías de señalización alteradas de la células madre cancerosas.
En el análisis de datos de expresión génica convencional, se ha utilizado con éxito enriquecimiento de análisis diferencial de genes expresados para explorar las vías de señalización que subyace y las funciones de ontología de genes [6], [7], [8]. La estrategia proporciona un proceso de interpretación del diferencial de los genes expresados en las vías o funciones a través de un conjunto de genes de enriquecimiento algoritmos [9]. Recientemente, varios se han desarrollado algoritmos para predecir miARN genes diana a través de homología de secuencia entre el 3 'UTR y la región de semillas miARN [10], [11], [12]. A través de los genes objetivo previsto de miRNAs [11], varios estudios exploraron los métodos para anotar las funciones de miRNAs, como el método de los objetivos de la vía en el enriquecimiento de la conservación o de pares co-dirigido de tal manera que las funciones dominantes podrían emerger a través de miRNAs "hub" [13 ], un método estadístico basado en la permutación de que las pruebas de sobre o sub-representación de los genes miARN objetivos en un conjunto designado de genes diana [14], [15], [16], [17] y recientemente publicado mirDIP que combina objetivo 12 algoritmos de predicción para formar redes de interacción de genes miARN [18]. Sin embargo, todos estos algoritmos utilizan solamente la información de predicción de destino, independientemente de los niveles de expresión de miRNAs, combinado con el hecho de que los objetivos de una miARN más de 100 genes [19], por lo que la inferencia a las funciones o vías de un conjunto de miRNAs no específicos a una objetivo biológico excesivamente complicado.
a diferencia de los algoritmos antes mencionados, hemos propuesto un nuevo algoritmo que combina un conjunto de algoritmos de predicción de genes miARN objetivo con un esquema bayesiano para integrar la fuerza de predicción, y luego construir el par miARN-vía por la mayor integrando el concepto de enriquecimiento conjunto de genes con un miRNAs expresados diferencialmente (Demirs). La etapa de enriquecimiento se logra mediante la expresión primeros mapeo miRNAs 'en sus genes diana factorizada por su fuerza predicción, entonces ambos enriquecimiento Resultado (ES) y la prueba exacta de Fisher se realizaron sobre un conjunto de genes o una vía para explorar la regulación putativo ejercida desde Demirs .
células madre cancerosas se han descrito en muchos tumores sólidos infantiles. Estos tumores son considerados como un grupo de tumores heterogéneos, pero con características genéticas similares y únicos. La evidencia reciente sugiere que la perturbación de los procesos normales de desarrollo es un factor importante en la patogénesis de tumores sólidos de la infancia. La biología de la mayoría de los cánceres niños difiere de cánceres en adultos, en su mayor parte, debido a su origen blastoma. Los niños con trastornos genéticos congénitos frecuentemente desarrollan varios tipos de tumores sólidos infantiles. Estas observaciones sugieren que puede haber ciertas vías que son compartidos en una variedad de diferentes tumores sólidos infantiles [20].
En este estudio, hemos identificado células madre cancerosas comunes asociados Demirs en 6 líneas celulares de tumores sólidos pediátricos. Se utilizó un enfoque de alto rendimiento QRT-PCR para estudiar la expresión de los genes miARN mundial en su fracción CSC. a continuación, hemos aplicado nuestro nuevo algoritmo de asociación de los genes miARN-vía para dilucidar las características de la CSC. Además, se estudiaron los efectos potenciales de algunas de las células madre cancerosas en Demirs por silenciamiento génico.
Resultados
La agrupación jerárquica de la madre del cáncer Células miRNAs
Uso de la neurosphere y ALDEFLUOR® ensayos delegadas como estrategias de lectura de datos destinados a enriquecer una población de células de cáncer de tallo como (CSC), que habían descubierto Demirs específicos que se dysregulated en esta población. Estamos perfiladas seis líneas celulares pediátricos, Hep293TT, HepG2, MG-63, Daoy, SH-SY5Y, y RD-ES utilizando TaqMan MicroARN Micro Fluid Los ensayos de la tarjeta y el análisis de PCR en tiempo real (Applied Biosystems). Realizamos controles de calidad que examinan los gráficos de dispersión de todos los niveles de expresión de los genes miARN (Ct) en las 6 líneas celulares ensayadas (Figura S1 en el archivo S1). Los gráficos de dispersión de la Ct comparan la fracción enriquecida tallo-como frente a sus contrapartes no-madre como muestran concordancia (coeficiente de correlación & gt; 0,75). Como se describe en la sección de materiales y métodos, se obtuvieron 380 Demirs con los niveles de expresión 2,2 veces arriba o hacia abajo regulada en las fracciones de CSC en comparación con su fracción de referencia de células madre no cancerosas. Con estos 380 Demirs, se seleccionaron los miRNAs que son expresados diferencialmente en al menos 4 de las 6 líneas celulares para permitir un cierto nivel de tolerancia a fallos. La posibilidad de seleccionar un Demir por azar fue 0,017 (distribución binomial). La agrupación jerárquica se realizó en estos 380 Demirs, como se muestra en la Figura 1A. El miRNAs de HepG2 y Hep293TT (hepatoblastoma) y Daoy (meduloblastoma) se agruparon juntos, mientras que el RD-ES (sarcoma de Ewing) y MG-63 (osteosarcoma) y SH-SY5Y (neuroblastoma) fueron agrupados juntos. Un grupo de 26 Demirs (23 hasta reguladas y 3 el regulado) se encontraron (Figura 1B), incluyendo
hsa-miR-21-5p
,
hsa-miR-148a-5p
,
hsa-miR-181-5p
,
hsa-miR-323-3p
, y
hsa-miR-487B-3p
, como altamente expresado, y
hsa-miR-19a-5p
y
hsa-miR-25-5p
, como Demirs-regulado.
(A). Los valores de expresión de 380 Demirs se midieron y se realizó la agrupación jerárquica. El perfil de expresión de HepG2 y Hep293TT, eran ocupadas por Daoy. RD-ES y MG-63 se agrupan junto con SH-SY5Y. miRNAs expresados diferencialmente (B). Se seleccionaron veinte y seis miRNAs con cambio de al menos 2 veces en 4 o más líneas celulares. Veintitrés miRNAs fueron hasta reguladas y 3 fueron regulados hacia abajo.
miRNA Target Predicción
Para identificar los genes diana putativos de los Demirs, el algoritmo de predicción de genes diana, BCmicrO [21 ] que se describe en la sección Materiales y Métodos, se aplicó a la Demirs. En total, se identificaron 865 genes diana putativos microARN (630 y 235 hasta regulada hacia abajo regulado) (Figura S1 S2 en archivos). En nuestro análisis de cada Demir, en promedio, 38 predichos genes diana, con la excepción de
hsa-miR-138-2-3p
,
hsa-miR-655
, y
HSA -miR-101-3p
, cada uno con más de 100 predijo genes diana. Además, también se encontró que dos Demirs,
hsa-miR-487B-3p
y
hsa-miR-517C-3p
, habían 7 y 25 genes diana, respectivamente, predicha por TargetScan algoritmo. Sin embargo, estos Demirs no pasaron el criterio de selección de BCmicrO (véase la sección de Materiales y Métodos).
Los análisis de enriquecimiento de miARN regulados Rutas
Para predecir qué vías de nuestras 26 CSC Demirs que podrían regular utilizado los pares de los genes miARN-mRNA obtenido como se describe anteriormente para la vía y análisis de función de enriquecimiento. Se utilizaron los conjuntos de genes de KEGG, vías BioCarta y la ontología de genes (GO) términos de procesos biológicos. Hemos encontrado 8, 12, y 34 elementos con significación estadística en KEGG vía, vía Biocarta y ontología de genes, respectivamente (Tablas 1, 2, 3). Seis de los 8 artículos enriquecidos en la vía KEGG pertenecían a diferentes tipos de cáncer: cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica, el glioma, el melanoma y el cáncer de páncreas. Entre los conjuntos de genes, muchos de ciclo celular y la proliferación de células relacionadas con los genes, como
CDKN1A
,
CDKN1B
,
E2F1
,
PTEN
y
RB1
se regula por los miRNAs expresados diferencialmente (Tabla S1 en el archivo S1), lo que indica la proliferación celular sea una función importante regulado por el CSC asociada Demirs. La ruta de p53 también se ha enriquecido desde el 15% de los genes en esta vía (
P Hotel & lt; 0,001,
ES
= 2,18) fueron objeto de nuestras Demirs (Tabla 1). Nuestro método predijo un conjunto de 10 genes implicados en la ruta de p53 como posibles objetivos para
hsa-miR-21-5p
,
hsa-miR-29b
,
hsa-miR 135b-5p
,
hsa-miR-494
, y
hsa-miR-655 gratis (Figura 2A). Las funciones específicas de la vía de p53 que podrían verse afectados por estas Demirs eran arresto del ciclo celular, la apoptosis, la inhibición de la angiogénesis y la metástasis, la reparación del ADN y la prevención de daños, la inhibición de la vía de TGF-1 /mTOR y la retroalimentación negativa de p53 (Figura 2A, se muestra en caja en rojo).
(a). La ruta de p53 que incluye 8 componentes de señalización según la definición de KEGG estaba altamente regulado por las Demirs CSC asociados. Cinco de los 26 Demirs estaban implicados en esta vía,
hsa-miR-21-5p, hsa-miR-135b, hsa-miR-29, hsa-miR-655, miR-HSA-494
. vía de TGF-beta de KEGG (B). El TGF-beta también estaba regulado por las Demirs CSC asociados. Receptor de
TGFBR1
estaba regulado por
hsa-miR-101-3p
,
y
receptor de
TGFBR2
estaba regulado por
hsa-miR 21-5p
, y
hsa-miR-519a-3p
. El receptor de
BMPR2
estaba regulado por
hsa-miR-101-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-181c-5p, y hsa-miR-494
. Nodal tipo II quinasa del receptor y el receptor de
ACVR2B
también fueron reguladas por
hsa-miR-101-3p
.
otra vía importante en la regulación del ciclo celular, el TGF-beta /BMP vía, también fue enriquecido (
P = 0,001
,
ES
= 2,28; Tabla 1). Nueve genes incluidos 4 receptores,
TGFBR1
,
TGFBR2
,
ACVR2B
y
BMPR2 Opiniones y un ligando, el TGF-beta, estaban regulados por 8 (
hsa-miR-181c-5p
,
hsa-miR-21-5p, hsa-miR-101-3p
,
hsa-miR-494, miR-HSA-655 , HSA-mi-519a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-132-3p)
del 26 CSC asociada Demirs, como se muestra en la Figura 2B. Como se sugiere en la figura 2B, alteración en el TGF-beta y receptores de BMP podría interferir con la señalización Smad-dependiente en células madre cancerosas, tal vez lo que resulta en programas perturbado crecimiento arresto, la apoptosis y la diferenciación. Por lo tanto, la pérdida de sensibilidad TGF-beta que causa la desregulación de las ciclinas, CDK y los inhibidores de CDK, compuesto con la desregulación en las vías p53 apoyado nuestra predicción de que estas Demirs asociados CSC podrían tener un papel en la regulación del ciclo celular y la proliferación celular. El análisis de enriquecimiento de las vías BioCarta, apoyado además los resultados obtenidos de las vías KEGG (Tabla 1). Cuatro vías BioCarta anotados, ciclo celular, G1, p53, y RACCYCD, también se asociaron con el ciclo celular (Tabla 2,
P
& lt; 0,001 para todas las 4 vías). Pathways ilustraciones junto con CSC asociada Demirs genes diana se proporcionan en la Figura S3 A-D en S1 Archivo. La vía de TGF-beta /BMP también mostró enriquecimiento en el análisis de Biocarta (Tabla 2,
P
= 0,001), por lo que confirma nuestra predicción KEGG vía. vías adicionales obtenidos en el análisis de enriquecimiento Biocarta eran CTCF, TOB1, ALK y las vías de PTEN (Tabla 2,
P
valor menor o igual a 0,001). Algunos genes conocidos en estas vías son
TGFBR1
,
TGFBR2
, y
TGFB
,
SMAD
familia y
PTEN
, adicionalmente apoyo a la participación de nuestros asociados Demirs CSC en la proliferación celular y el ciclo celular. Los procesos biológicos en ontología de genes también se aplicaron en nuestro análisis de enriquecimiento. Treinta y cuatro GO términos fueron enriquecidos (
P Hotel & lt; 0,01, Tabla 3). Los procesos biológicos relacionados con la proliferación celular, tales como regulación positiva de la proliferación de células mesenquimales (
P Hotel & lt; 0,007,
ES
= 2,66), la regulación negativa de la proliferación de células epiteliales (
P
& lt; 0,001,
ES
= 2,44), la fase G1 del ciclo celular mitótico (
P Hotel & lt; 0,001,
ES
= 2,29), regulación positiva de la proliferación de fibroblastos (
P Hotel & lt; 0,001,
ES
= 2,04), regulación positiva de la proliferación de células B (
P = 0,001
,
ES
= 1,70) , regulación positiva de la proliferación de células de músculo liso (
P Hotel & lt; 0,001,
ES
= 1,61) y el crecimiento celular (
P = 0,004
,
ES
= 1,53) fueron enriquecidos en nuestro CSC asociada Demirs. Algunos procesos biológicos correlacionados con la biología del cáncer, la vasculogénesis, la respuesta celular a la hipoxia, la cicatrización de heridas, y la respuesta a la radiación, se enriquecieron también (Tabla 3). Señalización de BMP y TGF-beta también se presentaron como vías enriquecidas en el análisis de GO, similar a KEGG y análisis vía Biocarta. vías de señalización tales como, la regulación positiva de la proteína quinasa B cascada de señalización, activación de la actividad de la proteína quinasa C por la proteína G acoplada proteína del receptor de la vía de señalización, también mostraron enriquecimiento significativo en el análisis GO (Tabla 3).
Funcional evaluación de hsa-miR-21-5p, hsa-miR-181c-5p y hsa-miR-135b-5p in vitro
Para verificación de la posible relevancia funcional en "troncalidad" de
HSA-mir -21-5p
,
hsa-miR-181c-5p
y
hsa-miR-135b-5p
, hemos realizado experimentos desmontables en Daoy y SK-N-BE (2 ) Células. Ácido nucleico cerrado (LNA ™) desmontables anti-sentido de
hsa-miR-21-5p
reduce la fracción de ALDH
BR (células madre sustituta marcadores CSC) en un 50% en Daoy (Figura 3A). Hemos probado los efectos de
hsa-miR-181c-5p
y
hsa-miR-135b-5p
la inhibición de la capacidad de crecer como neuroesferas en Daoy y SK-N-BE (2 ) respectivamente. En ambos casos, la capacidad para formar esferas (de lectura para la auto renovación) se deterioran. Los resultados de
hsa-miR-135b
caída en SK-N-BE (2) se muestran en la Figura 3B. En conjunto, estas observaciones sugieren un posible papel de
hsa-miR-21-5p
,
hsa-miR-181c-5p
y
hsa-miR-135b-5p
en la regulación de la auto-renovación en Daoy y SK-N-BE (2) células madre cancerosas
.
(a). Aproximadamente se observó una reducción de dos veces en la fracción enriquecida en células madre como en el
hsa-miR-21-5p
caída. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
hsa-miR-135b-5p
la inhibición de la capacidad de formar neuroesferas en SK-N-NE (2) (B). Un deterioro de la formación de esferas se observó en las células SK-N-BE (2)
hsa-miR-135b-5p
caída estable.
hsa-miR-135b-5p
KD1, KD2 y KD3 eran del mismo clon. Los datos representan tres experimentos independientes, se presenta como la media ± SEM.
Discusión
En este estudio hemos identificado una firma común de miRNAs desregulados asociados con células madre cancerosas y predijo algunas vías de candidatos afectada en células madre cancerosas de los tumores pediátricos. La fracción CSC dentro de los seis líneas celulares se recogió mediante diferentes ensayos sustitutas. Veintiséis miRNAs expresados diferencialmente (Demirs) se identificaron en la fracción CSC de 4 sobre 6 líneas celulares. Esto incluyó miRNAs con función conocida en función de los CAC (como
HSA-miR21-5p
), sino también nuevos miRNAs (como
hsa-miR-487B
y
hsa-miR 323-3p
). Fue sorprendente ver que 6 de los Demirs CSC asociados han sido reportados por otros grupos como miRNAs implicados en la función (s) CSC mediante la regulación de las vías de desarrollo del núcleo [22] - [28]. Para comprender mejor el papel plausible del 26 CSC asociada Demirs, derribaron 3 de la CSC asociada Demirs con funciones conocidas en células madre cancerosas. Hemos demostrado que
HSA CD -
miR-21-5p, hsa-miR-181c-5p
y
hsa-miR-135b-5p
tuvieron un efecto en el CSC fracción medido usando ALDH
BR y la formación de neuroesferas como marcadores indirectos. Nuestros datos fueron similares a los estudios realizados por otros grupos que demostraron una implicación de estos Demirs en las vías de CSC [22] - [28]. Estas observaciones sugieren que se necesitan más estudios para caracterizar estos CSC asociada Demirs en los cánceres pediátricos.
También presentamos un método de biología de sistemas para predecir las vías y las funciones de estos CSC asociada Demirs. Un enfoque bayesiano BCmicrO [21], [29] fue empleado como un integrador de múltiples algoritmos de predicción de destino. Un modelo matemático concisa (Ec. 2) se presentó al mapa de miRNAs vía de reglamentación o de otros grupos funcionales. análisis de enriquecimiento para los genes expresados diferencialmente se aplicó con éxito, junto con la prueba exacta de Fisher para determinar las vías de activos importantes en nuestro estudio. Nuestro método proporciona un análisis de enriquecimiento único que combina las expresiones diferenciales de Demirs y la fuerza de predicción de destino para comprender la regulación a una vía o nivel funcional, centrándose en los genes Demirs objetivo previsto. Al utilizar el nivel de la expresión diferencial de Demirs, esperábamos una mayor comprensión de la regulación Demirs 'y sus funciones a través de nuestro método.
A pesar de que el efecto funcional de la mayoría de miRNAs es aún desconocido, que utilizó los genes miARN orientada predijeron
in silico
para descubrir las funciones de regulación del Demir y posible intervención. Así, nuestro método proporciona un puente de Demirs de vía y la regulación de la función. El análisis computacional de estos 26 CSC asociada Demirs reveló que estos Demirs solamente podrían regular cuatro vías anotados: proliferación celular, el ciclo celular, p53 y TGF-beta /BMP (Tablas 1 y 2). Es bien sabido que Notch, Wnt, Erizo y PTEN /Akt son fundamentales en el desarrollo de vías de señalización que orquestan la proliferación celular, ciclo celular y el destino celular
in vivo
. Desregulación en estas cuatro vías principales de señalización ha sido ampliamente demostrada en células madre cancerosas. Nuestros Demirs CSC asociados están implicados en esas vías de señalización básicos de desarrollo, como se indicó anteriormente. Seis de los 26 Demirs CSC asociados:
HSA CD -
miR-19a-5p
[22],
HSA CD -
miR-25-5p
[23], [24],
hsa-miR-181c-5p
[25],
hsa-miR-21-5p
revisado en [26],
HSA
-
miR-135b-5p
[27] y
hsa-miR-148a-5p
función (s) [28] han conocido en los CAC. En este sentido, biológicamente validado objetivos de
hsa-miR-21-5p y
hsa-miR-135b-5p
, como se indica en la Tabla 4, se han asignado a PTEN /Akt, Notch y /o vías de Wnt y son esenciales para CSC auto-renovación en diferentes contextos celulares [26], [27]. Nuestro análisis computacional asigna la expresados diferencialmente
miR-181c-5p
a Notch vía de señalización (Tabla 4) y de la proteína morfogenética ósea (BMP) vía (Figura 2B) otra vía de auto-renovación CSC, ambos conocidos a la diafonía con Wnt (revisado en [30]). Por lo tanto, podemos suponer que en nuestros sistemas modelo,
hsa-miR-21-5p
,
hsa-miR-135b-5p
y
hsa-miR-181c-5p
podrían regular la proliferación celular y el ciclo celular probablemente al afectar PTEN /Akt, Notch y /o señalización Wnt vías.
En resumen, encuestamos a 6 líneas celulares de cáncer pediátricos para Demirs CSC asociados que podrían regular las funciones del CSC. El uso de ambas puntuaciones objetivo de predicción y la expresión diferencial de miRNAs ', y un nuevo algoritmo diseñado específicamente para el enriquecimiento de los perfiles de expresión de miRNAs predijimos vías que fueron blanco de estos Demirs en CSC. Dada la importancia de las vías de desarrollo, tales como Notch y Wnt, nuestros resultados presentados en este estudio sugieren objetivos para la intervención terapéutica y pronóstica en los cánceres pediátricos.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
líneas celulares de cáncer pediátrico Humanos Daoy (meduloblastoma); SK-N-BE (2) y SH-SY5Y (neuroblastoma), HepG2 (hepatoblastoma), RD-ES (sarcoma de Ewing), y MG-63 (osteosarcoma) se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC) y se mantiene en el ATCC recomienda medio de cultivo. Todos los medios de cultivo se complementaron con 10% de suero fetal bovino (FBS; Atlanta® Biologicals) y 1% de antibiótico-antimicótico, la amfotericina B, la penicilina y la estreptomicina (Gibco®, Life Technologies ™). Hep 293TT (hepatoblastoma) es una nueva línea de células tumorales de hígado humano establecido en nuestro laboratorio deducirá a partir de tejidos tumorales primarias de un 5 años de edad, niña de raza caucásica [31]. células Hep293TT se cultivaron en RPMI 1640 que contenía L-glutamina y 25 mM HEPES (Mediatech) y suplementado con 10% de FBS (Atlanta® Biologicals) y 1% de antibiótico-antimicótico, la amfotericina B, la penicilina y la estreptomicina (Gibco®, Life Technologies ™ ). Las líneas celulares se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C con dióxido de carbono al 5%.
Neurosphere Formación Ensayo
Un
in vitro
sistema de cultivo selectivo en la conoce como la neurosphere ensayo se utilizó para enriquecer Daoy, SK-N-BE (2), SH-SY5Y, RD-ES y MG-63 células madre cancerosas. El uso de un protocolo bien definido, y en presencia de factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF), es posible producir una fuente de renovación de las células de cáncer de vástago-como, que se puede ampliar como neuroesferas . Las células se trataron con tripsina y se resuspendieron a 2 x 10
4 células /ml a continuación en placas de sujeción ultra bajas (Corning) en un medio de mantenimiento sin suero para células madre embrionarias humanas (mTeSR ™ 1, Stem Cell Technologies). Después de aproximadamente 2 días, esferas primarias se formaron con aproximadamente 100 células por esfera. Para evaluar la auto-renovación, esferas individuales se cosecharon y desglosados en una sola célula suspensiones y pases seriados durante dos generaciones.
células activadas por fluorescencia (FACS) y ALDEFLUOR® Ensayo
Hep293TT y HepG2 fracciones madre-como se enriquecieron usando FACS para identificar las células con alta actividad enzimática de la aldehído deshidrogenasa (ALDH), utilizando el Ensayo de ALDEFLUOR® (Stem Cell Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo enriqueció la fracción de células con alta actividad de la ALDH como de lectura para la población de tallos similares. Brevemente, se añadió BODIPY ™ aminoacetaldehıdo (BAAA), un sustrato para ALDH, y cuando se excita a 488 nm, se detectaron y cerrada por su fluorescencia verde en 515-545 nm de las células madre-como con una alta actividad de ALDH. Esta purificación de células madre como se confirmó usando diethylaminobenzaldehyde (DEAB), un inhibidor específico de ALDH, como un control negativo. clasificación de células se realizó con un FACS Aria (software FACS Diva v 6.1.2; Becton Dickinson). Las células viables fueron cerrada utilizando yoduro de propidio (PI).
La extracción de RNA y de alto rendimiento miRNAs Cuantificación
Las células se recogieron y el ARN total fue aislada utilizando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion) de acuerdo con instrucciones del fabricante. Las comprobaciones de integridad (medidos como ARN Número Integridad; RIN) y la cuantificación de la muestra se realizó mediante el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). miARN perfiles se realizó utilizando una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa rápida tallo-bucle de alto rendimiento (QRT-PCR) en un formato de alto rendimiento 384 pocillos (química MicroARN tarjeta micro Fluid Ensayos '; Applied Biosystems) de acuerdo con el protocolo del fabricante Un total de 768 miRNAs y controles que se encuentran en el genoma humano madurado, anotados en el Registro miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk) fueron perfilados. En el primer paso, el ADNc se transcribe de forma inversa a partir de muestras de ARN total (dilución 2 ng /ml) usando dos grupos de cebadores específicos de tallo-bucle RT. Los ADNc transcritas se cargaron en dos juegos de tarjetas de microfluidos (piscina A y B), cada grupo contiene los secaron cebadores y sondas Taqman únicos (375 miRNAs y 9 normalización de control). QRT-PCR se utilizó para amplificar cDNA utilizando cebadores específicos preamplificador y se realizó en un sistema de PCR en tiempo real ABI Prism 7900HT en un formato de 384 pocillos; con piscina A y B se ejecuta por separado. Aquí, los ensayos se realizaron por triplicado en dos experimentos independientes. QRT-PCR condiciones de ciclación térmica incluyen 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 5 min, luego 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 58 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos. Los datos de las fracciones enriquecidas madre similar y sus contrapartes no-madre, como se analizó mediante el método comparativo C
método de ciclo umbral T (2
-ΔΔCT) de cuantificación relativa (ΔΔCt = Ct Ct-calibrador de muestra; donde la muestra? Ct = Ct Ct células-madre-como la normalización de control de células madre similares, y calibrador? Ct = madre similares a las células no Ct-Ct de control sin la normalización de células madre similares).
Desmontables de HSA-mir -135b-5p
miRZip-135b construcción anti-miR-135b miARN se adquirió de Sistema Biosciences (SBI). Las construcciones que llegó como rayas bacteriana. Una sola colonia se seleccionaron y se desarrollaron en caldo LB (Fisher Scientific) con 50 g /ml de ampicilina (Gibco®, Life Technologies ™). Los plásmidos se incubaron durante la noche a 37 ° C y se recogieron al día siguiente. Los plásmidos se purificaron de acuerdo con el Kit Quick PureLink® plásmido Miniprep (Life Technologies ™) protocolo del fabricante. ADN plásmido purificado se transfectó en células SK-N-BE (2) células. En pocas palabras, SK-N-BE (2) Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a 8 × 10
5 células /pocillo. Las células fueron cultivadas en crecimiento libre de antibióticos durante la noche medio. Las células fueron transfectadas con 4 g de ADN usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies ™) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, el ADN y Lipofectamine se incubaron en tubos separados que contienen 250 l de OptiMEM (Gibco®, Life Technologies ™). El ADN del plásmido y Lipofectamine se combinaron y se incubaron durante 20 min. Las células se lavaron con OptiMEM y se añadió OptiMEM fresco a cada pocillo. Se añadió entonces la mezcla de ADN plásmido y Lipofectamine a cada designado pocillo y se incubaron durante 24 horas. Después de 24 horas, se midió la expresión de GFP para determinar la eficiencia de transfección. Para generar una línea celular estable, se pasaron las células y se cultivaron en medio de cultivo que contiene 1 mg /ml de puromicina (Gibco®, Life Technologies ™).
Desmontables de
hsa-miR-21-5p
y
hsa-miR-181c-5p
con antisentido LNA oligonucleótidos ™
Daoy células en fase exponencial de crecimiento se sembraron en placas de 6 pocillos (TPP, Techno Plastic Products) a las 8 × 10
4 células /pocillo y se cultivaron en un medio libre de antibióticos para ~24hours, seguido de la transfección de miRCURY LNA ™ sondas desmontables para
HSA-miR21-5p
y
HSA-miR181- 5pc
(Exiqon Inc.), utilizando oligofectamine y medio libre de suero OPTIMEM® (Life Technologies ™), de acuerdo con el protocolo del fabricante. , Se añadieron aproximadamente 6 horas después de la transfección medios con suero, a continuación, 24 horas después de la transfección, se cambió el medio a su medio de crecimiento normal (medio esencial mínimo de Eagles (Mediatech), 10% de FBS (Atlanta® Productos Biológicos) y 1% de antibiótico-antimicótico; anfotericina B, penicilina y estreptomicina (Gibco®, Life Technologies ™). Sin sonda (simulacro) se utilizó como control negativo.
Análisis de datos estadísticos para miARN perfiles
control de calidad de la expresión de microARN.
Micro RNA expresión de datos generados con los ensayos de tarjetas de microfluidos se examinaron por primera vez por los gráficos de dispersión que comparan todas las muestras (Figura S1 en el archivo S1) donde estaban miARN niveles de expresión (Ct) de fracciones enriquecidas madre similar y sus contrapartes no tallo-como trazada. los resultados deben exhibir un cierto nivel de concordancia (coeficiente de correlación elegimos sea mayor que 0.75), de lo contrario, una réplica será llamado para confirmar el resultado o reemplazar el ensayo fracasado.
diferencialmente expresado miRNAs (Demirs