Extracto
Aplicaciones
Hemos probado la hipótesis de que la expresión de microARN (miARN) en el tejido de cáncer pueden predecir la eficacia de bevacizumab añadido a la capecitabina y oxaliplatino (CAPEOX) en pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRm).
Diseño Experimental
Los pacientes con cáncer colorrectal metastásico tratados con la primera cohortes de cribado (n = 212) y validación (n = 121), o CAPEOX solo:: línea CAPEOX y bevacizumab (CAPEOXBEV) de control de cohortes (n = 127), se identificaron retrospectivamente y se recogieron muestras de tumores primarios de archivo. Expresión de 754 miRNAs se analizó en la cohorte de detección sistemática mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) matrices y los niveles de expresión estaban relacionados con el tiempo de progresión de la enfermedad (TTP) y la supervivencia global (SG). miRNAs significativas del estudio de cribado fueron analizados en las tres cohortes utilizando matrices personalizados de PCR.
In situ
hibridación (ISH) se hizo para miRNAs seleccionados.
Resultados
En el estudio de cribado, 26 miRNAs se correlacionaron significativamente con los resultados de los análisis multivariado. Se seleccionaron veintidós miRNAs en estudio. De la expresión de miR-664-3p y una menor expresión de miR-455-5p fueron predictivos de la mejora de los resultados en las cohortes CAPEOXBEV y mostraron una interacción significativa con la eficacia de bevacizumab. Los efectos fueron más fuertes para el sistema operativo. Ambos miRNAs mostraron alta expresión en las células del estroma. De la expresión de miR-196b-5p y miR-592 predijo una mejor resultado independientemente del tratamiento con bevacizumab, con estimaciones de los efectos similares en las tres cohortes.
Conclusiones
Hemos identificado miRNAs potencialmente predictivos de bevacizumab efectividad y miRNAs adicionales que podrían estar relacionados con la eficacia de la quimioterapia o el pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Nuestros hallazgos necesitan validación adicional en grandes cohortes, preferentemente a partir de ensayos aleatorios completados
Visto:. Boisen MK, Dehlendorff C, D Linnemann, Nielsen BS, Larsen JS, Österlind K, et al. Los microARN (2014) de tejido como predictores de resultados en pacientes con cáncer colorrectal metastásico tratados con capecitabina Primera Línea y oxaliplatino con o sin bevacizumab. PLoS ONE 9 (10): e109430. doi: 10.1371 /journal.pone.0109430
Editor: Ratna Ray B., Universidad de Saint Louis, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Julio, 2014; Aceptado: August 22, 2014; Publicado: 15 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Boisen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que, por razones aprobadas, algunas restricciones de acceso se aplican a los datos subyacentes a los hallazgos. Los datos están disponibles en el Comité Institucional de acceso a datos /Ética en el Departamento de Oncología del Hospital Universitario de Herlev para los investigadores que cumplan con los criterios de acceso a los datos confidenciales. solicitudes de datos deben ser enviados a la profesora Julia S. Johansen en
[email protected] Financiación:. con el apoyo Este estudio realizado por una subvención sin restricciones de Roche Dinamarca (www.roche.dk), la Herlev Fundación de Investigación del hospital (www.herlevhospital.dk), y una donación de prueba de concepto de la Universidad técnica de Dinamarca (www.dtu.dk). Todas las subvenciones fueron dadas a MKB solo, o bien a ambos MKB y JSJ. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y los autores de este manuscrito han de competir el siguiente intereses: BVJ: Roche, consultor /función de asesoramiento; SEN: Roche, consultor /función de asesoramiento; PP: Roche, consultor /función de asesoramiento; JSJ: Roche, honorarios y financiación de la investigación; MKB: Roche, financiación de la investigación. JSJ y MKB son co-inventores de una patente de la aplicación relacionada con los miRNAs mencionados. Datos de la solicitud de patente: Nombre "microRNAs para la predicción de la eficacia del tratamiento y el pronóstico de los pacientes con cáncer"; número de solicitud "PCT /DK2013 /050015". BSN es empleado de una empresa comercial (Bioneer). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La mayoría de las muertes se producen como resultado del desarrollo de CRC metastásico (CCRm). Estándar de tratamiento para los pacientes con cáncer colorrectal metastásico que no pueden someterse resección radical de metástasis es la quimioterapia sistema con o sin un agente dirigido [2]. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal que se une el ligando de "factor de crecimiento endotelial vascular" (VEGF-A) y por lo tanto inhibe la capacidad de los cánceres de producir nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes, un proceso llamado angiogénesis. Bevacizumab ha demostrado eficacia en pacientes con cáncer colorrectal metastásico cuando se utiliza en combinación con la quimioterapia estándar, pero el beneficio es modesto cuando se utiliza de forma no selectiva y bevacizumab añade toxicidad y costo significativo para el tratamiento [3] - [7]. Por lo tanto, la identificación de biomarcadores predictivos de bevacizumab se ha convertido en un objetivo importante de la investigación de biomarcadores en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Debido a su adopción generalizada como tratamiento de primera o segunda línea estándar [8], la capacidad de individualizar el tratamiento con bevacizumab tendría un gran impacto en la práctica clínica. Numerosos estudios han investigado los biomarcadores potenciales en forma de ARN, ADN, o proteína [9], [10]. Ninguno lo ha hecho en la clínica. En la actualidad, la prueba no está disponible comercialmente puede identificar a los pacientes que se beneficiarán de bevacizumab.
Los microARN (miRNA) son pequeñas, $ ~ $ 22 nucleótidos de longitud, no codificante ARN implicados en la regulación post-transcripcional de la expresión génica. Han sido investigados intensamente como biomarcadores en pacientes con cáncer debido a que sus niveles de expresión se dysregulated en las células cancerosas, que pueden influir en el comportamiento del cáncer, y son relativamente resistentes a la degradación en medios de muestreo utilizado comúnmente [11] - [16]. Varios estudios han identificado desregulación de miRNAs en el tejido tumoral CRC y en muestras de sangre de pacientes con CRC; y algunos de los miRNAs identificados también se asociaron con factores pronósticos como la profundidad de la invasión, el escenario, y metástasis de ganglios linfáticos [17]. Además, las características moleculares importantes en CRC tales como la inestabilidad microsatélite (MSI) y
BRAF
estado mutacional se han demostrado estar asociados con distintos patrones de expresión de los genes miARN [18]. Por lo tanto, existe una fuerte razón fundamental para la investigación de la utilidad potencial de los genes miARN expresión como un biomarcador predictivo o pronóstico en pacientes con CRC. Hasta la fecha, ningún estudio publicado ha explorado el valor predictivo de la expresión de los genes miARN para la eficacia de bevacizumab de manera integral.
El objetivo fue identificar miRNAs que son predictivos de la evolución de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico tratados con capecitabina primera línea y oxaliplatino con y sin bevacizumab (CAPEOXBEV /CAPEOX) y para identificar cuál de estos miRNAs podría ser predictivo para el efecto de bevacizumab además de la quimioterapia.
Métodos
diseño del estudio
estudio de cribado utilizando un enfoque array se realizó en muestras primarias de tejido de CRC de los pacientes tratados con CAPEOXBEV (cohorte de cribado) para identificar miRNAs candidatos con los niveles de expresión relacionados con el resultado. A partir de entonces, los niveles de expresión de los miRNAs candidatos identificados se midieron usando un método más preciso con determinaciones por duplicado en tres cohortes: un subgrupo de la cohorte de cribado; una cohorte de validación, que era un grupo independiente de pacientes tratados con CAPEOXBEV; y una cohorte de control, que consiste en los pacientes tratados con CAPEOX solo.
Los pacientes, extracción de datos, y los criterios de valoración
Los (micro ARN de tejidos bevacizumab en cáncer colorrectal) BETmiRC estudio retrospectivamente todos los pacientes con cáncer colorrectal metastásico tratados con la primera línea de CAPEOXBEV en 10 hospitales daneses 2006-2011, y los pacientes tratados con la primera línea CAPEOX en el hospital Herlev o en un estudio aleatorio 2003-2006 [19], antes de que se aprobara el bevacizumab, como se describe anteriormente [20] .El final puntos de tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y la supervivencia global (SG) se mide desde el inicio del tratamiento hasta la progresión de la enfermedad o muerte por cualquier causa, respectivamente (definición detallada en S1 archivo). El estado vital se actualiza 5 de julio de 2013.
Las muestras de tejido
bloques (FFPE) los tejidos incluidos en parafina fijadas con formalina que contienen muestras de tumores primarios fueron recuperados utilizando el Registro Nacional de Patología. También se incluyeron muestras de control de los pacientes resecados para la enfermedad inflamatoria del intestino. Un patólogo experimentado gastrointestinal (DL) seleccionado bloques que tisulares para recuperar y anotó los bloques para el porcentaje de células tumorales. Tres secciones 10-micras fueron cortadas de cada bloque sin micro o macro-disección y las secciones se colocaron en tubos Eppendorf estériles. Todas las muestras de tejidos se recogieron antes de cualquier tratamiento sistémico o la radioterapia.
Mirna análisis de la expresión
ARN se purificó usando el Kit de miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Alemania) usando las instrucciones del fabricante. El orden de purificación fue al azar para las muestras de la cohorte de validación y control. El miARN no humana ath-miR-159a se añadió a cada muestra antes de la síntesis de ADNc como
Se utilizó espiga-en el control. La matriz TaqMan microARN humano A y B Conjunto de tarjetas v3.0 (Applied Biosystems) para cuantificar la expresión de 754 miRNAs humanos con determinaciones individuales en el estudio de detección. En el estudio posterior de la screening- reducida, validation-, y las cohortes de control, la expresión de los genes miARN se midió usando TaqMan Custom LDA tarjetas (Applied Biosystems) de perfiles de 22 miRNAs seleccionados por duplicado con 8 muestras en cada tarjeta. Las 22 miRNAs fueron seleccionados a partir del estudio de cribado y las tarjetas de microfluidos se pre-configurados por el fabricante de acuerdo con nuestras especificaciones. Las muestras se analizaron en un orden aleatorio en las tarjetas de LDA personalizado.
Las instrucciones y los reactivos de los fabricantes fueron utilizados en todos los pasos (https://www.products.appliedbiosystems.com). Todos los estudios de ARN purification- y de expresión de los genes miARN se realizaron por AROS Biotecnología Aplicada (Aarhus, Dinamarca). La compañía fue cegado a toda la información clínica.
Mirna
hibridación in situ
La hibridación in situ gratis (ISH) se realizó a través de dos FAM ( carboxifluoresceína) marcado de ácido nucleico cerrado (LNA [21]) sondas (Exiqon, Vedbæk, Dinamarca) para MIR-185-5p, miR-455-5p, miR-592, miR-664-3p, miR-21-5p, y miR-126-3p, tal como se describe anteriormente [22]. Todos los estudios fueron realizados por ISH Bioneer (Hørsholm, Dinamarca).
El análisis estadístico
Sin cálculo de la muestra se llevó a cabo antes de iniciar el estudio. El objetivo para el tamaño de la muestra más grande posible y la igualdad de tamaños de las tres cohortes
análisis de los genes miARN expresión -.. Cribado estudio
ciclo umbral Raw (C
t) para cada miARN se comprobó los valores atípicos y los datos fueron corregidos utilizando los valores de pico-a. En un método de selección univariado, la expresión de cada miARN se relaciona con TTP y OS utilizando un modelo de riesgo proporcional de Cox (CPH) [23], [24]. candidato miRNAs se incluyeron en un modelo multivariado ajustado CPH para la edad, el sexo, la histología, el número de sitios metastásicos, la localización del tumor primario, y el tratamiento adyuvante previa, que se simplifica el uso de un procedimiento de eliminación hacia atrás sobre la base del criterio de información de Akaike [25]. A continuación se repitió el análisis de conjuntos de datos normalizados utilizando quantile- y la media de la normalización. Finalmente, se seleccionaron 22 miRNAs para estudio adicional basado principalmente en su rendimiento en los análisis multivariados. Se eligió el número de miRNAs para incluir en el segundo estudio pragmáticamente ya que permitía duplicar las mediciones sobre la plataforma personalizada
análisis de los genes miARN expresión -.. screening-, validation-, y las cohortes de control
la media de C
t de las mediciones por duplicado se calculó y se transforma en 40-C
t. Si una de las dos mediciones fue indeterminado, se utilizó el C
t de la otra medición. En cada una de las tres cohortes, la expresión de los 22 miRNAs se relacionó con TTP y OS utilizando modelos de CPH con ajuste por edad, sexo, localización del tumor primario, el tratamiento adyuvante antes, y el número de sitios metastásicos. Los resultados se informaron como cocientes de riesgo (CR) por aumento del rango intercuartil en el nivel de expresión con intervalos de confianza del 95% (IC) .La posible interacción entre el nivel de expresión de miRNA y el efecto del tratamiento con bevacizumab se puso a prueba en las tres cohortes combinadas utilizando una prueba de razón de verosimilitud .
Desde resultado para los pacientes tratados con bevacizumab difería mucho en función de la localización del tumor primario [20], también se realizaron los análisis de la interacción para proximal y distal cánceres primarios por separado.
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativo y no se hicieron correcciones formales para comparaciones múltiples. Los paquetes de software estadístico R [26] (www.r-project.org) y GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) se utilizaron para todos los análisis.
Objetivo predicción
en silico
objetivos predijo genes de miRNAs seleccionados se identificaron utilizando la herramienta de libre acceso Diana-microT-CDS (http://www.microrna.gr/microT-CDS) [27].
Ética
el estudio fue aprobado por el Comité Científico regional de Ética de la región de la capital de Dinamarca (http://www.regionh.dk/vek, número de homologación: H-1-2010-081). Dado que este estudio retrospectivo no tendría ninguna influencia sobre el tratamiento y ya que la mayoría de los participantes habían fallecido, no se obtuvo el consentimiento por escrito, y esto fue aprobado por el comité de ética.
Informes de los resultados se preparó de acuerdo con el OBSERVACIÓN directrices [28], [29].
Más detalles se describen en S1 archivo.
resultados
miARN expresión se midió en 460 muestras FFPE. El número de muestras en cada cohorte fue:. Cribado cohorte = 212, la reducción de cohorte de detección = 155, la validación cohorte = 121, y la cohorte de control = 127 (Figura S1 S1 en File)
Los pacientes incluidos en el reducido screening- y las cohortes de validación miARN diferían de los pacientes no incluidos. Ellos tenían más probabilidades de tener: resección del tumor primario, un solo sitio metastásico, el estado funcional 0, y la terapia adyuvante previa. También experimentaron un TTP más tiempo y OS (Tabla 1). Los pacientes en el grupo de control fueron similares a los pacientes no incluidos, excepto para ellos son más propensos a haber tenido el tumor primario resecado.
Proyección estudio
Nueve muestras fueron identificadas como valores atípicos basado en un bajo número de miRNAs detectan y estos fueron excluidos, dejando 203 muestras para los cálculos de resultado. Veintiséis miRNAs se asociaron con PTT o el sistema operativo en el análisis multivariado utilizando los datos de expresión RAW-, cuantil normalizado, o media normalizada (Tabla S1 S1 en el archivo). Veintidós de ellos fueron seleccionados para el estudio adicional: MIR-1, miR-15a-5p, miR-17-3p, miR-22-3p, miR-29b-3p, miR-145-3p, miR-155-5p , miR-185-5p, miR-193b-5p, miR-196b-5p, miR-204-5p, miR-214-5p, miR-338-3p, miR-382-5p, miR-449a, miR-455 . -5p, miR-497-5p, miR-501-5p, miR-545-3p, miR-552-3p, miR-592 y miR-664-3p
Centrado panel de miARN - miRNAs asociados con TTP
Once miRNAs se asociaron significativamente con TTP, ya sea en el screening- o la cohorte de validación, pero no en ambas cohortes y no se encontraron interacciones significativas entre la expresión de los genes miARN y el efecto de bevacizumab (Tabla 2).
Las curvas de Kaplan-Meier para la TTP acuerdo con los cuartiles de miR-664-3p- y la expresión de miR-455-5p se muestran en la Figura S2 y S3 en S1 archivo
Panel de miARN Centrado -. miRNAs asociado con OS de prueba
Doce miRNAs se asociaron significativamente con el sistema operativo en una o más de la screening-, validation- y controlar las cohortes (tabla 3). la expresión de miR-664-3p alta se asoció con el sistema operativo más largo en la selección y validación de cohortes utilizando la expresión cruda: HR 0,64 (IC 0,48 a 0,86) y 0,60 (IC 0,44 a 0,82); y la expresión normalizada: HR 0,66 (CI 0,49-0,91) y 0,55 (CI 0,39-0,79). No se encontró asociación entre la expresión de miR-664-3p y OS fue encontrado en la cohorte de control. Se observó una interacción significativa entre la expresión y bevacizumab efecto miR-664-3p usando la expresión tanto RAW- y normalizado (
P = 0,02
y
P
= 0,02). gráficos de Kaplan-Meier para OS de acuerdo con los cuartiles de la expresión de miR-664-3p se muestran en la Figura 1.
parcelas de Kaplan-Meier se muestran para los pacientes tratados con CAPEOXBEV utilizando cruda (A) o media normalizada-(B ) expresión y pacientes tratadas solo con CAPEOX utilizando crudo (C) y) de expresión medio-normalizado (D. Las razones de riesgo (HR) son ajustados y los intervalos de confianza (IC) se calcularon usando bootstrapping. Los intervalos de expresión que se muestran en la esquina superior derecha son 40-C
t, por lo que los valores más altos corresponden a una expresión más alta. línea de negro = cuartil más bajo; línea roja = segundo cuartil; línea verde = tercer cuartil; línea azul = cuartil más alto
Superior miR-455-5p expresión se asocia con el sistema operativo más corto en la cohorte tratada con bevacizumab combinado cuando se utiliza la expresión normalizada:. HR 1,24 (IC 1,06-1,45) , pero no en la cohorte de control. Hubo una interacción significativa con efectos bevacizumab (
P
= 0,02). gráficos de Kaplan-Meier para OS de acuerdo con los cuartiles de la expresión de miR-455-5p se muestran en la Figura 2.
parcelas de Kaplan-Meier se muestran para los pacientes tratados con CAPEOXBEV utilizando cruda (A) o media normalizada-(B ) expresión y pacientes tratadas solo con CAPEOX utilizando crudo (C) y) de expresión medio-normalizado (D. Las razones de riesgo (HR) son ajustados y los intervalos de confianza (IC) se calcularon usando bootstrapping. Los intervalos de expresión que se muestran en la esquina superior derecha son 40-C
t, por lo que los valores más altos corresponden a una expresión más alta. línea de negro = cuartil más bajo; línea roja = segundo cuartil; línea verde = tercer cuartil; línea azul = cuartil más alto
Superior de miR-592 expresión se asocia con el sistema operativo más largo en los screening- y validación cohortes utilizando la expresión cruda:. HR 0,69 (IC 0,69-0,92) y 0,76 (IC 0.60- 0,95); y en la cohorte de validación utilizando la expresión normalizada: HR 0,76 (IC desde 0,63 hasta 0,93), con una tendencia similar en la cohorte de detección sistemática mediante la expresión normalizada: HR 0,77 (IC 0,59-1,00). Más alta expresión de miR-592 también se asoció con el sistema operativo más largo en el grupo de control cuando se utiliza la expresión normalizada:. HR 0,71 (IC 0,53-0,96)
De la expresión de miR-196b-5p se asoció con el sistema operativo más largo usando RAW- y la expresión normalizada tanto en la cohorte tratada con bevacizumab combinado: HR 0,77 (IC 0,66-0,90) y 0,79 (IC 0,64 hasta 0,97); y en el grupo de control:. HR 0,78 (IC 0,62 a 0,98) y 0,73 (IC 0,58-0,93)
Centrado panel de miARN - la localización del tumor primario y la segunda línea de resultados
En los análisis se estratificó según el la localización del tumor primario, una interacción significativa con efectos bevacizumab se observó para la expresión de miR-664-3p en el grupo de colon sigmoide y el recto para ambos TTP utilizando la expresión cruda y para el sistema operativo utilizando la expresión RAW- y normalizado. Los niveles de expresión de todos los miRNAs de acuerdo con la localización del tumor primario se muestran en la Figura S1 S4 en Archivo.
En los pacientes bevacizumab en segunda línea continua, la expresión de miR-664-3p alta se asoció con TTP más largo (HR 0,30,
P
= 0,04) y la expresión de miR-455-5p alta se asoció con una tendencia hacia TTP más corto (HR 2,72,
P
= 0,09), mientras que no hay tales asociaciones se observaron en pacientes que hicieron no continúe bevacizumab (Figura S5 en S1 archivo).
Mirna
hibridación in situ
una señal ISH miR-664-3p intensa, sobre todo con una localización citoplasmática, se visto en subpoblaciones de linfocitos infiltrantes de tumor, los fibroblastos y las células endoteliales situadas en la frontera invasiva (Figura 3). Una señal ISH miR-664-3p débil se observó en las células epiteliales tumorales, pero se observó una tinción similar con la sonda scramble, lo que sugiere una unión no específica de la sonda a estas células. señal ISH miR-455-5p se encontró en algunas células del estroma de linfocitos-como en medio de las muestras, mientras que las células epiteliales tumorales fueron negativos (Figura S6 en S1 File). No hay señal ISH se obtuvo con las sondas contra el miR-185, miR-449a o miR-592. sondas de control positivo para el miR-21-5p y miR-126-3p mostraron moderada a intensa tinción de los fibroblastos y las células endoteliales, respectivamente, en todos los casos.
ejemplos
Los paneles A y B muestran de miR-664-3p ISH en la infiltración de linfocitos (a) y los fibroblastos (B). secciones consecutivas se tiñeron con sondas LNA contra el miR-664-3p, miR-126-3p y una secuencia de lucha. ISH señal de miR-664-3p se ve en la infiltración de linfocitos (A, flechas; B, flecha roja) y en los fibroblastos (B, flechas negras), mientras que no se obtiene una señal de ISH con una sonda scramble. Una señal ISH fuerte se observó en las células endoteliales con la sonda de control positivo miR-126-3p. La "A" en el panel B indica una arteria.
predicción de destino
Tabla S2 S1 en el archivo muestra los 20 más altos objetivos de genes predichos clasificados para miR-196b-5p, miR 455-5p artículos, miR-592 y miR-664-3p y referencias publicados en relación con el nivel de función y expresión de estos miRNAs en el cáncer.
Discusión
Este es el primer estudio exhaustivo de miRNAs como biomarcadores predictivos de la eficacia de bevacizumab en el CCR. De los 22 miRNAs seleccionados a partir del estudio de cribado, miR-664-3p y miR-455-5p mostraron el mayor potencial como biomarcadores predictivos de la eficacia de bevacizumab.
La asociación entre el miR-664-3p y OS diferían significativamente entre los pacientes tratados con bevacizumab y los pacientes tratados con quimioterapia sola: el aumento de la expresión de miR-664-3p en el tejido CRC primaria se asoció con el sistema operativo más largo en ambas cohortes de pacientes tratados con bevacizumab en combinación con CAPEOX pero no en la cohorte tratada con quimioterapia sola. El aumento de la expresión de miR-664-3p también se asoció con TTP mayor en los pacientes tratados con bevacizumab, pero la prueba de interacción fue significativa sólo en el subgrupo de pacientes con Colon- sigmoide y los tumores primarios del recto. previamente la hipótesis de que este subgrupo de pacientes podría ser más propensos a beneficiarse del tratamiento con bevacizumab que los pacientes con tumores primarios más proximales [20]. la expresión de miR-664-3p también fue mayor en estos pacientes que en los pacientes con tumores primarios más proximales (Figura S4 en Archivo S1). En la pequeña cohorte de pacientes con datos disponibles segunda línea de resultado, la expresión de miR-664-3p alta también se asoció con un TTP ya sólo en los pacientes continuar con bevacizumab, apoyando una conexión entre la expresión de miR-664-3p y la eficacia de bevacizumab.
Se observó una alta expresión de miR-664-3p en las células del estroma, incluyendo células endoteliales, que está de acuerdo con el papel de miR-664-3p en la angiogénesis. Muy pocos datos se han publicado acerca de este miARN (Tabla S2 en Archivo S1). Curiosamente, entre los objetivos previsto superiores de miR-664-3p se neuroligin 1 (NLGN1), MDGA2, y gephyrin, que son todos los que participen en el mismo proceso sinaptogénica en el sistema nervioso [30], [31]. Recientemente, neuroligina y su unión neurexin pareja han demostrado ser ampliamente expresado en el sistema vascular y que participan en la angiogénesis [30]. La sobreexpresión de neuroligin 1 en las células endoteliales cultivadas en un entorno tumorigénico aumento de la angiogénesis, y desmontables de neurexin redujo la angiogénesis el factor de crecimiento de fibroblastos 2 inducida por [32]. En un modelo de embrión de pez cebra de la angiogénesis, la inhibición de VEGF-A o neuroligin causada magnitudes similares de defectos vasculares, pero la inhibición de ambos resultó en un efecto más que aditivo anti-angiogénico [33]. Hipotéticamente, el impacto de la expresión de miR-664-3p sobre el resultado de este modo se puede explicar por su regulación a la baja del sistema neuroligina y la sinergia resultante con VEGF-A inhibición por bevacizumab.
El aumento de la expresión de miR-455-5p era asociado con el sistema operativo más corto en el grupo tratado con bevacizumab cohorte combinada, mientras que no se observó dicha asociación en la cohorte tratada con quimioterapia sola. Se identificaron alta expresión de este miARN en las células de linfocitos como situadas en el estroma alrededor de las células cancerosas. MIR-455-5p ha informado que están alteradas en el cáncer; sin embargo, no hay objetivos validados se han identificado (Tabla S2 en S1 File).
El aumento de la expresión de ambos miR-196b-5P y miR-592 se asoció con OS más tiempo en las tres cohortes, con estimaciones de los efectos similares. Tanto estos miRNAs han demostrado ser regulado por disminución en los CRC con reparación deficiente desajuste (dMMR) [34]. De la expresión de miR-592 se ha demostrado que se asocia con la mejora de OS en pacientes que reciben tratamiento de rescate anti-EGFR y más alto de expresión de miR-196b-5P se ha relacionado con la respuesta al neo-adyuvante 5-FU y la radioterapia en pacientes con de recto localmente avanzado cáncer [35], [36]. la expresión de miR-592 se ha notificado a ser mayor en el lado izquierdo en comparación con los CRC del lado derecho [37], que también hemos encontrado en nuestro estudio. No hemos podido manchar nuestras secciones de tejido de miR-592, pero la expresión de miR-592 tanto y miR-196b-5p ha sido previamente demostrado ser 2,5-3,7 veces mayor en el CCR epitelio que en CRC estroma [38]. La función de miR-592 no se ha descrito. MiR-196b-5p se desregula en muchos tumores malignos, se ha relacionado con el pronóstico del cáncer, y se dirige a c-myc, ERG, MEIS1, FAS, ABL1, BCL-2 y varios genes HOX (Tabla S2 S1 en el archivo).
Hay limitaciones importantes a tener en cuenta con respecto a nuestros resultados. Estudio retrospectivo de cohortes identificaron a partir de diferentes períodos de tiempo, lo que aumenta el riesgo de sesgo, ya que las diferencias no sean los tratamientos utilizados podrían existir entre las cohortes. Se utilizó la expresión media de la normalización, pero dado que los miRNAs utilizados para el cálculo de la media se relacionaron con el resultado, esto es sub-óptima. A pesar de que la asociación con el resultado de algunos de los miRNAs fue identificado en dos o tres cohortes independientes, el efecto de predicción relacionados con bevacizumab sigue siendo-un validado. Nosotros no corregir las múltiples pruebas, pero el miR-664-3p todavía estaría asociado significativamente con el sistema operativo en la cohorte de validación, incluso después de la corrección de los 22 miRNAs ensayadas. Además, las estimaciones del efecto fueron similares en las cohortes, lo que indica una asociación no aleatoria. Entre los puntos fuertes de nuestro estudio son el gran tamaño de la muestra, el estudio integral de selección inicial, el uso de tres cohortes independientes, y la aleatorización de purification- y el orden análisis de la expresión de los genes miARN.
En conclusión, este es el primer estudio para examinar el potencial de los genes miARN expresión en tumores primarios de predecir beneficio de bevacizumab en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Hemos identificado miR-664-3p y miR-455-5p como posibles biomarcadores predictivos de bevacizumab. MiR-592 y miR-196b-5p fueron predictivo de los resultados con y sin bevacizumab y estos podrían ser biomarcadores de pronóstico o marcadores asociados a la eficacia de la quimioterapia. Estos hallazgos necesitan validación en cohortes independientes - de preferencia de los ensayos aleatorios y utilizando normalizadores miARN estables -antes de que se pueden implementar en la toma de decisiones clínicas. se justifica la elucidación de los orígenes celulares y funciones biológicas de estos miRNAs.
Apoyo a la Información
Archivo S1.
Este archivo contiene métodos complementarios, Tabla S1 y S2, y complementario Figura S1-S6
doi:. 10.1371 /journal.pone.0109430.s001 gratis (PDF)
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a: Jørgen Hansen, MD, del Departamento de Oncología del hospital de Aalborg, Dinamarca para la ayuda en relación con la adquisición de los datos del paciente; Mel Heeran, PhD por su excelente asistencia técnica con el seccionamiento de las muestras de tejido FFPE; Jakob Z. Johansen, MD para introducir datos clínicos en la base de datos BETmiRC; Mogens Kruhøffer, PhD, de AROS Biotecnología Aplicada A /S, Dinamarca para obtener ayuda con el miARN análisis, y la danesa CancerBiobank (DCB) de material biológico y de los datos relativos a la manipulación y el almacenamiento.