anticuerpo monoclonal del receptor del factor de crecimiento epidérmico Resumen
fue aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastásico que llevan KRAS de tipo salvaje de ADN. Sin embargo, estudios recientes demostraron que los pacientes con KRAS mutación G13D pueden beneficiarse de la terapia con anticuerpos EGFR. En este estudio hemos tratado de explorar si la abundancia de la mutación KRAS podría afectar a la eficacia de la terapia con anticuerpos EGFR. En primer lugar nos establecimos un método PNA-PCR, que podría calcular el porcentaje de mutación KRAS en el ADN total y demostró su capacidad en 47 muestras de cáncer colorrectal que llevan mutaciones de KRAS. A continuación, se analizó la correlación entre la abundancia de mutaciones de KRAS y la eficacia de la terapia con anticuerpos EGFR en otros 35 pacientes de cáncer colorrectal metastásico. Hemos demostrado que el ensayo PNA-PCR podría calcular la abundancia de mutación KRAS y el porcentaje de ADN mutante en células tumorales varían mucho (10,8% ~98.3%) en los 47 pacientes con cáncer colorrectal. La eficacia de los anticuerpos EGFR correlacionado con la abundancia de mutaciones de KRAS: en la mutación KRAS grupo de menos de 30%, la tasa de control de la enfermedad fue de 44,4% (4/9); la tasa de control de la enfermedad de grupo 30~80% era 5,6% (1/18) y el & gt; 80% grupo fue 12,5% (1/8) (P = 0,038). En resumen, nuestro estudio mostró que el método de PNA-PCR podría fácilmente detectar el porcentaje de mutación KRAS en las células tumorales y pacientes con cáncer colorrectal con baja abundancia de mutación KRAS podrían beneficiarse de la terapia con anticuerpos EGFR
Visto:. Yu S, Xiao X, J Lu, Qian X, Liu B, Feng J (2013) Los pacientes con cáncer colorrectal con baja abundancia de KRAS mutación puede beneficiarse de la terapia de anticuerpos EGFR. PLoS ONE 8 (7): e68022. doi: 10.1371 /journal.pone.0068022
Editor: Ramón Andrade de Mello, Facultad de Medicina de la Universidad de Oporto, Portugal
Recibido: 1 de Febrero, 2013; Aceptado: 24 de mayo de 2013; Publicado: 9 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por la Fundación médica Jieping Wu (320.6700.09050), http://www.wjpmf.org/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) anticuerpo monoclonal fue aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastásico sin mutaciones de KRAS. mutaciones de KRAS se describen a producirse en aproximadamente el 40% de cáncer colorrectal y la mayoría de ellos (90%) se producen en el codón 12 y 13 [1], [2]. III de ensayos clínicos de fase II Varios y han demostrado ser una falta de respuesta a la terapia anti-EGFR en presencia de mutaciones de KRAS [3], [4], [5]. Estos resultados llevaron a la Agencia Europea de Medicamentos y la Administración de Drogas y Alimentos para limitar el tratamiento anti-EGFR sólo para los pacientes portadores de tumores con KRAS no mutado en 2009 [6].
Sin embargo, estudios recientes demostraron que KRAS mutación y G13D codón 12 mutaciones en realidad no son iguales en la predicción de los resultados clínicos de la terapia anti-EGFR en pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRm) [7], [8]. Los pacientes portadores de la mutación KRAS G13D aún podrían beneficiarse del tratamiento con cetuximab [9]. En un análisis multivariado, los pacientes con tumores de mutación G13D tratados con cetuximab tenían una supervivencia global más larga (mediana, 7,6 meses frente a 5,7 meses) y la supervivencia libre de progresión (mediana, 4,0 meses frente a 1,9 meses) que otros tumores KRAS mutado [10]. Varios meta-análisis también obtuvieron resultados similares [7], [11]. Aparte de eso, un análisis conjunto de tres ensayos mostraron que la mutación específica en el gen KRAS codón 12 también tuvo un impacto diferente sobre la eficacia del tratamiento en pacientes con cáncer colorrectal y tumores que llevan una mutación KRAS G12D mostró una fuerte tendencia a un resultado más favorable comparado con otro codón 12 mutaciones [12]. Todos estos estudios nos mostró que no todos los tumores KRAS mutantes eran resistentes a la terapia anti-EGFR. A medida que las investigaciones continúan, no fue suficiente para diferenciar pacientes con más o menos el estado de la mutación KRAS.
Dado que el tumor tenía una gran heterogeneidad, diferentes tejidos tumorales también pueden tener abundancia variable de células tumorales mutante KRAS. Debido a que cada método de detección tuvo su sensibilidad de detección, cuando la proporción tumor KRAS de mutación reduce a un cierto punto, esta muestra de tumor podría ser reconocida como de tipo salvaje KRAS. A medida que se establecen cada vez más altamente sensibles métodos de detección, más muestras de tumores se clasifican como KRAS los mutantes [13], [14]. Todavía no se sabe si estas muestras serán resistentes a la terapia EGFR-anticuerpo. En este estudio, la hipótesis de la abundancia de KRAS mutación también podría afectar a la eficacia del tratamiento anti-EGFR. En realidad, similar con nuestra hipótesis, en 2011, Zhou et al descubierto que gran abundancia de mutaciones de EGFR tuvo mayor respuesta objetiva que la baja abundancia en el cáncer de pulmón no microcítico tratados con gefitinib [15].
En nuestro estudio anterior, hemos establecido un método de PCR-PNA (ácidos nucleicos peptídicos-PCR), que podría suprimir la amplificación de ADN de tipo salvaje KRAS. En este estudio, primero modificamos este método PNA-PCR para asegurarse de que se podría suprimir totalmente la amplificación de ADN de tipo salvaje KRAS y confirmó su capacidad de supresión en 47 muestras de tumores que llevan mutaciones de KRAS. A continuación, se cuantificó y se calculó la proporción de ADN mutante del gen KRAS en los tejidos tumorales y se encontró que la proporción varió mucho. Finalmente, se comparó la relación entre la abundancia de KRAS mutación y la eficacia de cetuximab en otros 35 pacientes con cáncer colorrectal metastásico.
método de PNA-PCR se estableció antes en nuestro laboratorio [16], y en este estudio se hizo menor ajustes con el fin de asegurarse de que se podría cuantificar y calcular la proporción de ADN mutante KRAS. Este método podría amplificar el ADN mutante KRAS exclusiva y podía cuantificar ADN mutante KRAS simultáneamente. En el mismo tiempo, también podríamos cuantificar la cantidad de ADN total (tanto KRAS mutante y de tipo salvaje de ADN KRAS) por PCR cuantitativa regular (PCR sin PNA). Entonces podríamos fácilmente calcular el porcentaje de ADN mutante del gen KRAS en el ADN total.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y pacientes
líneas celulares de carcinoma de colon SW480 y SW116 (adquiridos de BIOK & amp; KM, china) se utilizaron en este estudio. línea celular SW480 contiene un gen KRAS homocigotos mutación del codón 12 (GGT → GTT) y SW116 alberga gen KRAS de tipo salvaje. Un total de muestras FFPE 47 pacientes con cáncer colorrectal cuyo estado de KRAS resultó ser mutante en cualquiera de KRAS 13 se obtuvieron del Hospital de la Torre del Tambor a partir de noviembre de 2008 a diciembre de 2010. Se recogieron codón 12 o codón Otros 35 pacientes con cáncer colorrectal con la mutación KRAS del hospital del cáncer de Jiangsu, de 2006 a 2010. a diferencia de los pacientes anteriores, todos estos 35 pacientes recibieron tratamiento con cetuximab. Consentimiento informado, se obtuvo de todos los pacientes antes de iniciar el tratamiento. Todas las decisiones de tratamiento fueron hechas por los médicos que tratan antes de diseño del estudio. El estudio fue aprobado por el comité de ética de los hospitales institucionales (Comité de Ética del Hospital de Torre del Tambor y el Comité de Ética del Hospital del Cáncer de Jiangsu) antes de que se llevó a cabo este estudio.
Extracción de ADN SW480, SW116 y tejidos FFPE
Después de macrodissection manual de los tejidos FFPE, la hematoxilina y eosina secciones manchadas de tejido FFPE fueron revisados por tres patólogos con experiencia para evaluar la abundancia de células tumorales. El método de evaluación detallada se ha descrito antes [17]. porcentaje de células tumorales de la muestra es la media de los valores obtenidos por los tres patólogos. El ADN genómico se aisló de muestras FFPE, SW116 y SW480 con recuperar todos kit total de aislamiento de ácidos nucleicos (catálogo no. AM1975, Ambion) según las instrucciones del fabricante. Un control negativo se realizó para examinar la posibilidad de contaminación. las concentraciones de ADN se determinaron por UV (260 nm) espectrofotómetro.
PNA-PCR Plus pirosecuenciación
PNA-PCR y las condiciones de pirosecuenciación se han descrito anteriormente a excepción de PCR master mix [16]. Brevemente, la mezcla maestra de PCR contenía concentraciones finales de los reactivos de la siguiente manera: 1 × SYBR Premezcla Ex Taq Mix (Takara, código DRR041A), 0,15 umol /L cebadores directo e inverso, 0,5 umol /L PNA y cierta cantidad de ADN. La secuencia de PNA era 5'-CCTACGCCACCAGCTCC-3 '. La secuencia del cebador hacia adelante fue 5 'GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA-3' y el cebador inverso era 5'-biotina-CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC-3 '. Termociclado se realizó en un tiempo real de instrucciones Mx3000P (Stratagene) PCR y las condiciones de los ciclos eran las siguientes: 98 ° C durante 30 s y luego 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 72 ° C durante 10 s, 62 ° C durante 20 s y 72ºC durante 20 s. Pirosecuenciación se llevó a cabo en el HS System PSQ96 pirosecuenciación (Biotage AB). La secuencia de cebador de pirosecuenciación era 5'-TGTGGTAGTTGGAGCT-3 '. Para nucleótido dispensación era TACG cíclico de 5 'a 3'.
Población de pacientes y los regímenes de tratamiento
Se analizaron retrospectivamente 35 pacientes con diagnóstico histológico de cáncer colorrectal metastásico con mutación KRAS de 2006 a 2010. Todos los tumores fueron adenocarcinomas colorrectales. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito y fueron tratados con cetuximab o regímenes basados en ceruximab. El cetuximab se administró como agente único o en combinación con regímenes a base de quimioterapia con la misma dosis hasta la progresión de la enfermedad. Cetuximab se administró a una dosis de 250 mg /m
2 (dosis inicial fue de 400 mg /m
2). Hubo 28 pacientes que recibieron cetuximab solo. Hubo 4 pacientes que recibieron tratamiento con 5-FU más el tratamiento con cetuximab después del fracaso de la terapia con 5-FU. Otros 3 pacientes recibieron tratamiento con irinotecán, 5-Fu y cetuximab después de progreso de la enfermedad de la terapia de irinotecan y 5-FU.
evaluación clínica y la respuesta del tumor Criterios
La respuesta clínica se evaluó cada 2 meses por la tomografía computarizada (TC) del tórax y del abdomen y /o tomografía respuesta magnética (RM). Los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) versión 1.0 se adoptaron para la evaluación clínica. De acuerdo con los criterios RECIST versión 1.0, la respuesta completa (CR) se definió como la desaparición de todas las lesiones objeto de estudio; respuesta parcial (RP) fue al menos una disminución del 30% en la suma de los diámetros más largo (SLD) de lesiones diana tomando como referencia el SLD línea de base; enfermedad progresiva (PD) era al menos un 20% de aumento en el SLD de lesiones diana, tomando como referencia el SLD más pequeña registrada desde que se inició el tratamiento; enfermedad estable (SD) no era ni suficiente disminución de SLD para calificar para PR ni aumento suficiente de SLD para calificar para la EP. Dos oncólogos y radiólogos verificaron la respuesta clínica de todos los pacientes de una forma ciega.
Análisis estadístico
Los pacientes con CR, PR y SD se definieron como pacientes con control de la enfermedad y la tasa de control con la enfermedad se calculado como el número de paciente de control de la enfermedad /el número de todos los pacientes. Chi-cuadrado se llevó a cabo para comparar la tasa de control de la enfermedad de los diferentes grupos en los 35 pacientes con cáncer colorrectal. El Chi-cuadrado se llevó a cabo mediante el programa SPSS 16.0. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Validación de PNA-PCR Método de Líneas Celulares
Hemos encontrado que cuando añadimos 100 ng KRAS nativo. DNA de tipo en el ensayo de PNA-PCR, el PNA podría suprimir la amplificación de ADN de tipo salvaje. Sin embargo, esta supresión no era completa y estable después de las pruebas repetidas (Fig. 1A). Sin embargo, cuando añadieron 100 ng de KRAS ADN de tipo salvaje y 0,01 ng KRAS ADN mutante en el ensayo de PNA-PCR, el DNA de tipo salvaje KRAS podría ser completamente y de forma estable suprime y se amplificó sólo el ADN KRAS mutante después de la confirmación de pirosecuenciación (Fig. 1B), lo que indica que incluso el ADN mutante era rara la comparación con el de tipo salvaje, ensayo de PNA todavía amplificar el ADN mutante exclusiva y esta amplificación podría ayudar a suprimir la amplificación de ADN de tipo salvaje completamente
.
(a) Hay son de tipo salvaje productos de PCR cuando se añaden 100 ng KRAS de tipo salvaje de ADN en el ensayo de PNA-PCR. (B) No sólo son productos de PCR del gen KRAS mutantes cuando se añaden 100 ng de ADN de tipo salvaje y 0,01 ng de ADN mutante KRAS.
Con el fin de asegurarse de la estabilidad del ensayo, se disminuyó la cantidad de DNA de tipo salvaje a 10 ng añadió en el ensayo y se encontró que PNA podría suprimir por completo y de manera estable la amplificación de ADN de tipo salvaje, incluso en ausencia de ADN mutante KRAS (no hay productos de la PCR, la confirmación por electroforesis en gel y pirosecuenciación, datos no mostrados ). Por lo tanto, en el siguiente experimento, se controló el ADN añadido en el ensayo de no más de 10 ng.
Validación de PNA-PCR Método en tejidos tumorales de cáncer de los pacientes
Un total de 47 colorrectal pacientes con cáncer fueron confirmados para llevar la mutación KRAS por COLD-PCR /secuenciación Sanger [17]. En total, hubo 15 G12D, 13 G12V, 13 G13D, 2 G12S, 2G12A, 2G13R y 1G12C KRAS mutaciones (un paciente que lleva dos tipos de mutaciones de KRAS). El porcentaje de células tumorales en muestras de FFPE fue incluido en la tabla 1. No más de 10 ng se añadió DNA de la muestra FFPE a ensayo de PNA-PCR y los productos de PCR se secuenciaron mediante pirosecuenciación. Tal y como esperábamos, el ensayo de PNA-ADN amplificado por PCR del gen KRAS mutante exclusivamente. Figura 2 muestra que no de tipo salvaje de ADN se amplificó en el ensayo de PNA-PCR.
un tejido tumoral contiene una GGT → mutación GCT. tejido tumoral B contiene una mutación GGT → GAT. C tejido tumoral contiene una mutación GGC → GAC.
Detectar y calcular el porcentaje de ADN mutante KRAS
Antes de detectar el porcentaje de ADN mutante del tejido tumoral, se analizaron la curva estándar del ensayo de PNA-PCR y se encontró la línea de regresión fue lineal (pendiente = -3,25; r = 0,977) en el intervalo de 0,02 a 10 ng de ADN mutante KRAS (Fig. 3), lo que significa este ensayo podría cuantificar KRAS ADN mutante.
cantidades variables de ADN mutante KRAS se representaron frente a los valores de Ct (ciclo umbral). se muestran pendiente, el valor de r y de la línea de regresión.
No más de 10 ng de ADN de ensayo se añadió a PNA-PCR y PCR normal (sin ANP) de tejido FFPE (2 l), respectivamente (todo las reacciones se realizaron por triplicado). Un total de ADN de la muestra y el ADN mutante KRAS podrían ser leídos por curva estándar. La cantidad de ADN en el ensayo de PCR fue regular de ADN total como todo tipo de ADN pueden ser amplificadas por igual y la cantidad de ADN en el ensayo de PNA-PCR fue de ADN mutante KRAS como la de tipo salvaje uno no amplificó en este ensayo. El porcentaje de ADN mutante del gen KRAS se calcula de la cantidad de ADN mutante KRAS /cantidad de ADN total. El porcentaje de ADN mutante KRAS en las células tumorales se calculó como porcentaje de ADN mutante KRAS en ADN total /porcentaje de células tumorales en el tejido tumoral. El porcentaje de ADN mutante en células tumorales varió de 10,8% a 98,3% (Tabla 1). En total, hubo 10 muestras que contienen ADN mutante menos de 30%, 27 muestras de 30% a 80% y 10 muestras de más del 80%.
Porcentaje de mutación KRAS en células tumorales y de correlación de respuesta
características y porcentaje del paciente de la mutación KRAS en las células tumorales se han enumerado en la tabla 2. La tasa de respuesta parcial fue del 2,9% (1/35), enfermedad estable 14,3% (5/35) y la enfermedad progresiva 82,9% ( 29/35). La correlación entre el porcentaje de mutación KRAS en las células tumorales y control de la enfermedad se enumeran en la tabla 3. En total, en la mutación KRAS menos del 30% del grupo de control de la tasa de la enfermedad fue de 44,4%; la tasa de control de la enfermedad de grupo 30~80% era 5,6% y el & gt; 80% grupo fue 12,5% (P = 0,038). Era digno de notar que en el & gt; 80% grupo el paciente que tenía la enfermedad estable contiene una mutación G13D. En este estudio, la tasa de respuesta fue del 18,5% (5/27) de KRAS codón 12 mutaciones y el 12,5% (1/8) de KRAS mutación G13D (Tabla 4). No se observó que los pacientes con KRAS mutación G13D tuvieron una mejor tasa de respuesta (Tabla 4).
Discusión
El presente estudio demostró que la PNA-PCR método podría cuantificar y calcular la abundancia de la mutación KRAS de las células tumorales. Por lo que sabemos, en primer lugar, demostramos que la baja abundancia de mutación KRAS (& lt; 30%) también podría beneficiarse de un tratamiento anti-EGFR en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Dado que los estudios anteriores sólo se centra en si la mutación fue positiva, nuestro estudio reveló un nuevo concepto de la investigación de la terapia con anticuerpos EGFR.
En este estudio, hubo 7 pacientes tratados por tanto cetuximab y quimioterapia. Sin embargo, todos estos 7 pacientes recibieron cetuximab después del fracaso de la quimioterapia inicial. Por lo tanto, nos tendía a creer que la respuesta de los pacientes a la terapia contribuyó principalmente a cetuximab. Aunque hubo estudios demostraron que los pacientes con KRAS mutación G13D mostraron una fuerte tendencia a un resultado más favorable en comparación con el codón 12 mutaciones, no observamos esto en nuestro estudio potencialmente debido a los pacientes número limitado de este estudio.
Nuestros resultados indican que el porcentaje de ADN mutante del gen KRAS en las células tumorales varió de 10,8% a 98,3% y esta distribución era continuo. Como era de esperar, los pacientes portadores de baja abundancia (& lt; 30%) de la mutación KRAS tuvieron un mayor índice de control de la enfermedad a cetuximab que otros grupos (44,4% de & lt; 30% del grupo frente a 5,6% para el grupo 30~80% y 12,5% para & gt ; 80% del grupo, P = 0,038). Si excluimos a un paciente control de la enfermedad que lleva a una mutación G13D en & gt;. 80% del grupo, la tendencia que tenía poca abundancia más alta tasa de control de la enfermedad fue más evidente
A pesar de que la secuenciación directa Sanger fue considerado como un método clásico para detección de mutaciones KRAS, más y más altos métodos de sensibilidad como el frío-PCR, BRAZOS, PCR-mutante enriquecido, amplificación competitiva de los amplificados de fusión diferencialmente (CADMA) [18], [19], [20], [21] se aplicaron a mutaciones de KRAS pantalla. Estos métodos nos ayudaron a encontrar más muestras KRAS mutantes. Sin embargo, si estas muestras podrían beneficiarse de la terapia anti-EGFR sigue siendo desconocido. Nuestro estudio demostró que estas muestras con baja abundancia de mutaciones de KRAS podrían beneficiarse de la terapia con anticuerpos EGFR.
¿Por qué tumor con baja abundancia de mutación KRAS tienden a la respuesta a la terapia con anticuerpos EGFR? Una posible explicación era que las células tumorales tenían una gran heterogeneidad. Cuando las células del tumor KRAS mutantes eran minoría, la mayoría de las células tumorales de tipo salvaje KRAS también podría ser matados por el tratamiento con anticuerpos EGFR y en este proceso de los pacientes con cáncer podría mostrar un tiempo relativamente largo de estabilización de la enfermedad o la respuesta incluso parcial. Sin embargo, como la terapia continúa, más y más KRAS de tipo salvaje tumores son eliminados, la abundancia de la mutación KRAS se hace mayor y los pacientes tienden a tener una progresión de la enfermedad y se vuelven resistentes a la terapia con anticuerpos EGFR.
Estos podrían también explicar por qué el tratamiento con anticuerpos EGFR es inicialmente eficaz para la mayoría de los pacientes con cáncer de KRAS no mutado y luego losts su eficacia como terapia continúa. Un artículo reciente publicado en
Naturaleza Hola, ha encontrado que el 60% de los pacientes que desarrollaron resistencia al tratamiento con anticuerpos EGFR mostró adquisición de mutaciones KRAS secundarios [22]. Tenemos la tendencia a creer que este "secundario" mutación KRAS realmente existe en los tejidos tumorales primarios. Dado que las células tumorales que contienen esta mutación eran pocos, y no hemos podido detectar antes de la terapia. Sin embargo, como continuación de la terapia, la proporción de células tumorales ajusta bajo la presión de terapia. En esta situación, la terapia anti-EGFR pierde su eficacia y las mutaciones de KRAS "secundarios" también podría ser detectada fácilmente.
Más importante aún, Misale et al también encontró que KRAS alelos mutantes podrían ser detectadas en la sangre de anti tratamiento los pacientes EGFR a los 10 meses antes de la documentación radiográfica de progresión de la enfermedad [22]. En otras palabras, incluso la KRAS existen alelos mutantes, los pacientes podrían todavía tener un tiempo relativamente largo (10 meses) de la enfermedad estable. El resultado de este artículo coincide con nuestros resultados y demuestra que la existencia de mutaciones de KRAS no significa una resistencia completa.
A pesar de que algunos investigadores habían pagado atenciones para distinguir baja y alta abundancia de mutación de EGFR recientemente [15], nuestra ventaja era más evidente que nuestro método fácil y precisa podría calcular el porcentaje exacto de alelos mutantes del gen KRAS. Este cálculo preciso podría reflejar el porcentaje de mutación KRAS de manera más objetiva y ayudar a otra laboratorio verifique nuestra conclusión más fácilmente
En resumen., Nuestro estudio demostró que el método de PNA-PCR podría fácilmente detectar el porcentaje de mutación KRAS en las células tumorales . los pacientes con cáncer colorrectal con baja abundancia de mutación KRAS podrían beneficiarse de la terapia con anticuerpos que se necesita más investigación EGFR y pacientes en un número mayor.