Extracto
diphosphoglucuronosyltransferases uridina (UGT) 1A6 es la única isoforma UGT1A expresado en el tejido pulmonar. Es responsable de la detoxificación de carcinógenos como benezo [a] pireno del humo del cigarrillo. El propósito de este estudio fue evaluar la asociación de los polimorfismos UGT1A6 y haplotipos con el riesgo de cáncer de pulmón y para evaluar la importancia funcional de los polimorfismos UGT1A6. ADN genómico se aisló a partir de leucocitos. Ocho polimorfismos UGT1A6 fueron secuenciados en un equipo de prueba de 72 pacientes con cáncer de pulmón chinos y 62 controles sanos. alelos de riesgo potencial que modifican fueron validados en un conjunto independiente de 95 pacientes con cáncer de pulmón chinos y 100 controles sanos. UGT1A6 19T & gt; G, 541A & gt; G y 552A & gt; C mostraron asociación significativa con un mayor riesgo de cáncer de pulmón, mientras UGT1A6 105C & gt; T y IVS1 + 130G & gt; T se asociaron significativamente con un riesgo reducido de cáncer de pulmón. El análisis de regresión logística multivariante demostró una asociación significativa de cáncer de pulmón con UGT1A6 541A & gt; G (OR: 3,582; IC del 95%: 1.27 a 10.4, p = 0,015), 552A & gt; C (OR: 5,364; IC 95%: 1,92 a 14,96, p = 0,001) y IVS1 + 130G & gt; T (OR: 0,191; IC del 95%: 0,09 hasta 0,36, p & lt; 0,001). Prueba funcional demostró que UGT1A6 105C & gt; T aumentaron la estabilidad del mRNA, proporcionando una explicación plausible de su asociación con la reducción de riesgo de cáncer de pulmón. Por lo tanto polimorfismos UGT1A6 se pueden utilizar para identificar a las personas con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de pulmón
Visto:. Kua L-F, Ross S, Lee S-C, Mimura K, Kono K, Goh B-C, et al. (2012) Los polimorfismos UGT1A6 Modulada cáncer de pulmón de riesgo en una población china. PLoS ONE 7 (8): e42873. doi: 10.1371 /journal.pone.0042873
Editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Puerto Oncología, Portugal
Recibido: 12 Marzo, 2012; Aceptado: 12 de julio de 2012; Publicado: August 17 de, 2012
Copyright: © Kua et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por el Grupo Nacional de Salud (Singapur) pequeña subvención innovadora [NHG-SIG /06007]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) representa más del 85% de los cánceres primarios de pulmón y aproximadamente dos tercios de los pacientes con CPNM son diagnosticados en una etapa avanzada. El consumo de cigarrillos se ha relacionado con el cáncer de pulmón [1] - [4], y más de 60 carcinógenos habían sido identificados en el humo del cigarrillo [5] - [7]. De éstos, el benzo [a] pireno (BaP) y 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona (NNK) son los más estudiados. Activación metabólica de BaP y NNK por el citocromo P450 da como resultado la formación de metabolitos más reactivos que se puede unir covalentemente al ADN, un paso importante en la inducción de cáncer de pulmón [8] - [10].
Los diphosphoglucuronosyltransferases uridina ( UGT) pertenecen a una superfamilia de enzimas que metabolizan responsable de desintoxicar numerosas endobióticos y xenobióticos [11]. UGT son responsables de la detoxificación de BaP y NNK [12] - [15]. actividad glucuronidación inferior había sido implicado en la susceptibilidad al cáncer de pulmón [16]. Además, los polimorfismos genéticos en UGTs han correlacionado con el riesgo y la incidencia de diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón [12], [17] - [20]. Entre todas las isoformas UGT1A, UGT1A6 había demostrado ser la única isoforma UGT1A expresado en el tejido pulmonar [21].
La hipótesis de que los polimorfismos en la UGT1A6 pueden afectar a la capacidad para desintoxicar carcinógenos cáncer de pulmón y modular el riesgo de cáncer de pulmón . A continuación, presentamos los resultados de un estudio de casos y controles utilizando 2 cohortes diferentes y funcionalmente caracterizada UGT1A6 105C & gt;. T polimorfismo
in vitro
Materiales y Métodos
Estudio de la población en
se analizaron un total de 167 casos de cáncer de pulmón chinos y 162 controles sanos chinos de 2 cohortes independientes. La primera cohorte compuesta por 72 pacientes con cáncer de pulmón y 62 controles sanos desde el Centro de Cáncer y el Centro de Donación de Sangre del Hospital de la Universidad Nacional de Singapur, respectivamente. Una segunda cohorte constaba de 95 pacientes con cáncer de pulmón y 100 controles a partir de 4 estudios clínicos y se utiliza como conjunto de validación. Los sujetos de este grupo eran pacientes con cáncer de pulmón a partir de dos estudios de fase terapéutica II (n = 44 y 14, respectivamente) y un estudio de biomarcadores de la línea germinal (n = 37) y controles elegibles sin cáncer de un estudio de casos y controles de cáncer colorrectal familiar en Singapur. El protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional etnias en el Hospital de la Universidad Nacional de Singapur, y todos los sujetos del estudio proporcionaron consentimiento informado por escrito.
Datos colección
En el primer grupo, los sujetos del estudio fueron entrevistados en persona por los profesionales médicos entrenados que utilizaron un cuestionario estructurado. Se recogió información demográfica, incluyendo edad, sexo, tabaquismo, años del hábito de fumar y el tipo histológico celular para todos los sujetos. Información similar para la segunda cohorte fue recuperado de los registros de casos, y no se obtuvo información sobre el estado de fumar para los controles. El nivel de tabaquismo se clasifican en no-fumador, ex fumador y fumador actual. tipos de células histológicas fueron clasificados en tres grupos, a saber, el adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma pobremente diferenciado.
polimorfismo de nucleótido único (SNP) genotipado
Ocho SNPs que eran relativamente comunes en la población asiática basada sobre el pasado de búsqueda en la literatura, fueron seleccionados para este estudio. De las cuatro variantes en el exón 1, tres fueron de codificación (cSNPs) que resultan en cambios de aminoácidos, UGT1A6 19T & gt; G (S7A), 541A & gt; G (T181A) y 552A & gt; C (R184S), mientras que UGT1A6 105C & gt; T era un sinónimo variante. Los tres restantes variantes de secuencia en la región reguladora 5 'incluía 2 SNPs, UGT1A6 -556C & gt; T y -427G & gt; C, y una mutación por deleción -1.310 a -1.306 eliminar (AGGAG). UGT1A6 variante intrónica IVS1 + 130G & gt;. T también se estudió
Genómica ácido desoxirribonucleico (ADN) fue extraído de la capa leucocitaria fracciones utilizando el kit de purificación de ADN Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.). La calidad y la cantidad de ADN fueron evaluados por NanoDrop (ND-1000 espectrofotómetro). Todos los ADN tiene una relación de A
260 /A
280 de 1/7 a 1/9. La genotipificación se realizó mediante pirosecuenciación. Para los ensayos de pirosecuenciación, uno positivo y un control negativo se incluyeron en cada placa de 96 pocillos. Brevemente, los cebadores se diseñaron basándose en la secuencia de UGT1A6. Los cebadores de PCR y cebadores de secuenciación fueron diseñados utilizando pirosecuenciación Ensayo de Diseño de Software (versión 1.0.6: Biotage AB, Uppsala, Suecia). Se realizó un análisis BLAST para confirmar la especificidad de los cebadores para cada exón. Los detalles de secuencias de cebadores y las condiciones de PCR se listan en la Tabla S1. 250 ng de ADN genómico en 50 ng /l se utilizó para cada reacción de PCR y los productos de PCR se sometieron después a pirosecuenciación con dispositivo ID PyroMark ™ (pirosecuenciación, Uppsala, Suecia). etapas de validación se llevaron a cabo mediante reacciones de secuenciación directa utilizando el terminador v 3.1 química de secuenciación de ciclo ABI PRISM BigDye ™ móvil
Construcciones de plásmidos
Los estudios funcionales de los polimorfismos no sinónimos (UGT1A6 19T & gt;. G, 541A & gt; G y 552A & gt; C) se han hecho, mientras que IVS1 + 130G & gt; T es un SNP intrónica, por lo tanto, se seleccionaron UGT1A6 105C & gt; T, que es un polimorfismo sinónimo de nuestras pruebas funcionales. Para evaluar si UGT1A6 105C & gt; T tiene ningún impacto sobre la actividad UGT1A6, la variante 105TT fue generada. Brevemente, el plásmido vector de codificación UGT1A6 * 1 secuencia de longitud completa fue proporcionado amablemente por el Dr. Michael H. Corte (Escuela de Medicina de la Universidad de Tufts, Boston, Massachusetts). La región de codificación de UGT1A6 se subclonó en pcDNA 3.1 V5 /His expresión Topo plásmido vector (Invitrogen). Se realizó un análisis BLAST para confirmar la secuencia del plásmido UGT1A6. El plásmido se utiliza entonces como plantilla para generar la sustitución en el nucleótido 105 utilizando el GeneEditor
vitro
dirigida al sitio sistema de mutagénesis en (Promega) con el cebador indicado 105CT (5'-5Phos /ccc tca GGA TGG AAG cca c-3 ') y el cebador cadena inferior (siempre). Todas las construcciones de ADN se verificaron por análisis de secuenciación. Brevemente, las células HEK293 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10% y 50 U /ml de penicilina (Gibco) en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37ºC. transfecciones estables de plásmido en las células HEK293 se realizaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en un reactivo con respecto a ADN de 03:01 en Opti-MEM® I medio de suero reducido (Gibco). Todos los experimentos de transfección se llevaron a cabo por triplicado.
estabilidad del ARN de ensayo
A continuación examinó el posible efecto de la variante UGT1A6 105TT en la estabilidad del mRNA. 10 mg /ml de actinomicina D (Sigma) se aplicó a los cultivos de células cultivadas durante la noche y se recogieron las células a intervalos seleccionados de hasta 24 horas. El kit Rneasy Plus Mini (Qiagen) se utilizó para extraer el ARN total a partir de células transfectadas, antes y después de la incubación con actinomicina D.
Cuantificación de transcripciones
RNA fue aislado de 5 × 10
5 células en los momentos indicados (0, 2, 4, 8 y 24 horas) después del tratamiento con ActD y fueron transcritas invertir cDNA utilizando superíndices III (Invitrogen). Después, la reacción PCR se llevó a cabo con los siguientes componentes: 1 cDNA l, 10 mM de cada uno de los cebadores (UGT1A6: 5'-cagctgtcctcaagagagatgtgga-3 'y 5'-ccaatgaagaccatgttgggc-3', GAPDH: 5'-tgaaggtcggagtcaacggatttggt-3 'y 5 '-catgtgggccatgaggtccaccac-3') y 2 de corriente × SYBR Green Master Mix (que incluyen SYBR tinte verde, Taq Polymearse, ROX, y dNTP) en un volumen final de 20 l. Las celdas vacías transfectadas con vector se utilizó como control, con los datos normalizados por la expresión de GAPDH. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo por triplicado.
Western Blot
Además, examinó el efecto de la variante UGT1A6 105TT en la estabilidad de la proteína. Las células tratadas se lisaron y se midieron las concentraciones de proteína. Las proteínas (7,5 g /pocillo) se resolvieron por electroforesis en gel de gradiente de SDS-poliacrilamida 4-15% (Invitrogen), seguido de transfirió a un fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana microporosa (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) bloqueado en PBS con 5% Leche. Después del bloqueo, la membrana se sondeó usando un conejo UGT1A6 anticuerpo primario anti-humano diluido 1:1000 (WB-UGT1A6; BD Gentest, Woburn, MA) y un anti-conejo de rábano anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de cabra (1:10,000 diluida) . Las transferencias fueron imágenes de reactivos ECL (ECL Prime, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) y por el procesador de la película (Konica SRX 101). Los resultados son de dos experimentos independientes.
Enzyme ensayo
La serotonina se utilizó como sustrato como lo demostró la especificidad de sustrato para UGT1A6 [22], [23], sin embargo, una metodología plataforma diferente se utilizó en este estudio. 0,01 mg de proteínas se sometieron a 384 pocillos placa de negro (Corning, NY) con Transcreener ® HTS intensidad de fluorescencia (FI) kit de ensayo (BellBrook Labs, Madison, WI). Cada reacción enzimática se llevó a cabo con los siguientes componentes: 50 mM HEPES (pH 7,5), que contiene NaCl (100 mM), MgCl
2 (4 mM), EGTA (2 mM), 0.01% de Brij-35, ditiotreitol (DTT ; 2 mM), DMSO (1%), UDPGA (5 mM) y con concentraciones variables de serotonina (Sigma) 0,5 a 30 mM en un volumen final de 25 l. La placa se incubó a TA durante 45 min y reacciones se detuvieron por la adición de 25 l de metanol enfriado con hielo. La placa se leyó en un lector de placas Tecan Infinito M200. Todas las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo por triplicado. Las lecturas iniciales se convirtieron a la cantidad de UDP formado usando GraphPad Prism para interpolar los valores de las curvas estándar UDPGA /UDP. curvas de Michaelis-Menten se generaron utilizando GraphPad Prism. Los datos representados son de dos experimentos independientes y los resultados se presentan como la media ± S.D. de triplicados.
Análisis estadísticos
diferencias de casos y controles en las características basales fueron evaluados utilizando pruebas t (para las variables continuas) y las pruebas de Chi-cuadrado (para variables categóricas). La odds ratio (OR) se derivan de la prueba de Chi-cuadrado, y se les dio el 95% intervalos de confianza (IC) del OR. La asociación entre los SNPs con la edad, el sexo, el tabaquismo y estadios TNM se pusieron a prueba en sujetos con cáncer de pulmón utilizando la prueba de chi-cuadrado. Todos los análisis estadísticos incluyendo el análisis de regresión logística univariante y multivariante se realizaron con el programa SPSS versión 11.5 (SPSS Inc., Chicago, Ill., EE.UU.). Hardy-Weineberg test de equilibrio, el análisis de desequilibrio de ligamiento (indicado como D ') y análisis de haplotipos de casos y controles (permutación de prueba) se calcularon utilizando SNPAlyze Ver.7.
Resultados
Características de los pacientes y controles
Las características basales de los pacientes con cáncer de pulmón y controles de ambas cohortes se resumen en la Tabla 1. Hubo una diferencia estadísticamente significativa en la edad, el sexo y el consumo de tabaco entre los pacientes con cáncer de pulmón y controles sanos, con más masculino (p = 0,003) y los fumadores (p & lt; 0,001) en el grupo de cáncer de pulmón. En comparación con los controles sanos, pacientes con cánceres de pulmón, eran generalmente de mayor edad (p = 0,04). El adenocarcinoma es el subtipo histológico más frecuente, representando el 60% en pacientes con cáncer de pulmón. No hubo diferencias significativas en las características basales de los pacientes con cáncer de pulmón y controles sanos entre las cohortes de prueba y validación (datos no mostrados).
Genotipo y frecuencias de los alelos de polimorfismos UGT1A6 (Tabla 2)
de los ocho SNPs genotipo, cinco se asociaron significativamente con el riesgo de cáncer de pulmón, cuando se probó en la primera cohorte consta de 72 pacientes con cáncer de pulmón y 62 controles. UGT1A6 19T & gt; G, 541A & gt; G y 552A & gt; C se asociaron con un mayor riesgo de cáncer de pulmón, mientras que UGT1A6 105C & gt; T y IVS1 + 130G & gt; T se asoció inversamente con el riesgo de cáncer de pulmón. UGT1A6 19T & gt; G, 541A & gt; G y 552A & gt; C eran comunes en pacientes con cáncer de pulmón con frecuencias de alelos menores de 38%, 45% y 48%, respectivamente
Estos 5 SNPs fueron evaluados en la segunda cohorte consta. de 95 pacientes con cáncer de pulmón chinos y 100 controles sin igual chinos. UGT1A6 19T & gt; G, 541A & gt; G y 552A & gt; C se mantuvo asociado con un mayor riesgo de cáncer de pulmón, y UGT1A6 105C & gt; T y IVS1 + 130G & gt; T se mantuvo asociado significativamente con la reducción del riesgo de cáncer de pulmón
Determinación de los factores asociados. de forma independiente con el cáncer de pulmón: análisis univariados y multivariados
Para determinar los factores asociados con el riesgo de cáncer de pulmón, que utilizó por primera análisis univariado y se identificaron los siguientes factores: edad, sexo, tabaquismo, y cinco SNPs (Tabla 3). Después de ajustar por covariables identificados por el análisis univariado utilizando análisis multivariante sólo encontramos el consumo de tabaco (OR: 3,385; IC del 95%: 1,86 a 6,15, p & lt; 0,001), UGT1A6 541A & gt; G (OR: 3,582; IC 95%: 1.27 a 10.4 , p = 0,015), 552A & gt; C (OR: 5,364; IC del 95%: 1,92 a 14,96; p = 0,001) y IVS1 + 130G & gt; T (OR: 0,191; IC del 95%: 0,09 hasta 0,36, p & lt; 0,001) fueron factor predictor independiente de riesgo de cáncer de pulmón.
Hardy-Weinberg, desequilibrio de unión (LD) y análisis de haplotipos
Un análisis más detallado del conjunto de polimorfismos de ADN que se heredan juntos, también conocido como haplotipos se realizó con el siguiente results.UGT1A6 19T & gt; G y IVS1 + 130G & gt; T mostró desviación significativa de Hardy-Weinberg entre los controles. UGT1A6 552A & gt; C fue en estrecha LD con UGT1A6 541A & gt; G (D '= 0,9706, r
2 = 0,7795) en pacientes con cáncer de pulmón. UGT1A6 105C alelo estaba estrechamente relacionada con UGT1A6 y 541G alelo 552A en el control (Tabla 4). La Tabla 5 resume las frecuencias de haplotipos de las comparaciones de casos y controles de pruebas de permutación. UGT1A6 541A & gt; G se excluyeron de este análisis, ya que estaba en estrecho LD con 552A & gt; C. Diez haplotipos únicos pueden ser inferidos mediante la modificación de los alelos de riesgo 4, con datos censurados a la frecuencia de 1%.
Entre estos, cinco haplotipos mostró significativa p-valor en la prueba de permutación, de los cuales , tres fueron asociados con un mayor riesgo de cáncer de pulmón. Haplotipo#2 contiene dos alelos de riesgo de UGT1A6 19G y 552c tenían un mayor OR de 13,57 (IC del 95%: 6,15 a 29,93) en comparación con el haplotipo#4 (OR: 2,65, IC del 95%: 1,26 a 5,59) que contiene un alelo de riesgo UGT1A6 552A y el haplotipo#6 (OR: 2,35; IC del 95%: 1,23 a 4,48) que contiene dos alelos de riesgo de UGT1A6 19G y 552c, y un alelo 'protector' de UGT1A6 intrón 1 + 130T. Dos haplotipos se asociaron con un menor riesgo de cáncer de pulmón, incluyendo haplotipo#3 (OR: 0,23; IC del 95%: 0,12 a 0,43) y el haplotipo#7 (OR: 0,13; IC del 95%: 0,04-0,44).
caracterización funcional in vitro de la variante UGT1A6 105TT
in vitro
, la estabilidad del mRNA se ensayó después de bloquear la transcripción mediante el tratamiento de las células con actinomicina D (ActD). Variante UGT1A6 105TT ARNm era más estable que la de tipo salvaje con niveles significativamente más altos de ARNm observado a las 4 horas (p = 0,039), y 8 horas (p = 0,004) después del tratamiento con ActD (Figura 1A). Aumento de la estabilidad de la variante UGT1A6 105TT mRNA resultó en mayor expresión de la proteína y la actividad enzimática en comparación con el de tipo salvaje a las 48 horas después del tratamiento con ActD (Figura 1B, C y D).
UGT1A6 * 1 y UGT1A6 105TT construcciones eran transfectadas de forma estable en células HEK293. Las células (A) se cosecharon por tratamiento con ActD en un momento diferente punto hasta 24 horas. Los datos representados son los cambios de curso temporal de la cantidad restante de UGT1A6 ARNm después del tratamiento ActD. Hubo significativamente más alto nivel de ARNm en UGT1A6 105TT de UGT1A6 * 1 células transfectadas a las 4 horas (p = 0,039) y 8 horas (p = 0,004) después del tratamiento con ActD. (B) Análisis de transferencia Western. lisado celular utilizada fue de 5 × 10
5 células en los momentos indicados (0, 8, 24 y 48 horas) después del tratamiento con ActD. Había una regulación a la baja en la expresión de proteínas en UGT1A6 * 1 en comparación con la variante UGT1A6 a las 48 horas después del tratamiento con ActD. actividad UGT1A6 se evaluó mediante la evaluación de la producción de glucurónido serotonina usando lisado de la variante UGT1A6 (VT) y UGT1A6 * 1 (WT) a 0 horas (C) y 48 horas (D) después del tratamiento ActD, con concentraciones de sustrato varió de 0,5 a 30 serotonina mM. Las actividades se expresan como la velocidad de reacción (nanomoles de glucurónido serotonina formada por minuto y por miligramo de proteína).
Discusión
Este es el primer estudio para describir la asociación entre polimorfismos UGT1A6 y de pulmón cáncer. El gen UGT1A6 es responsable de la detoxificación de carcinógenos tales como BaP del humo del cigarrillo [13] - [15]. alteraciones cuantitativas o cualitativas en la expresión de UGT1A6 pueden afectar la tasa de glucuronidación, modificando de este modo el riesgo de desarrollar cáncer de pulmón
.
Varios polimorfismos se han reportado en la región reguladora 5 ', el exón 1 y intrones de UGT1A6 [24 ], [25]. Entre éstos, tres polimorfismos no sinónimos en los codones 7, 181 y 184 (UGT1A6 19T & gt; G, 541A & gt; G y 552A & gt; C, respectivamente), referidos colectivamente como UGT1A6 * 2, fue la más estudiada. Se clasifica como una variante 'baja actividad' durante varios compuestos fenólicos, incluyendo la aspirina [26] y se asocia con una reducción de adenoma colorrectal en los sujetos que tomaron aspirina [27] a largo plazo.
En este estudio, hemos tenido demostrado que los individuos con UGT1A6 * 2 (haplotipo#2 y 6) había aumentado el riesgo de cáncer de pulmón. Nuestro hallazgo es coherente con un informe de la actividad de glucuronidación reducida en individuos con el alelo UGT1A6 * 2 en comparación con el tipo salvaje [26]. Krishnaswamy
et al
también demostraron niveles inferiores al 50% de mRNA UGT1A6 (p = 0,026) en los portadores de UGT1A6 19T & gt;. G polimorfismo en comparación con los no portadores, pero sin un efecto significativo en el contenido de proteína UGT1A6 o actividades de glucuronidación [24]. Debe tenerse en cuenta que no había informes contradictorios de al menos 2 estudios, lo que sugiere una mayor actividad de la enzima en UGT1A6 * 2 alozimas [28], [29]. Sin embargo, el aumento de la actividad en el allozyme variante UGT1A6 no se tradujo en un aumento del aclaramiento de sustrato en microsomas de hígado humano variantes [29]. Es probable que, aparte de la actividad enzimática, la degradación del mRNA puede ser responsable de la variabilidad de la actividad UGT1A6
Dos polimorfismos de UGT1A6 105C & gt;. T y IVS1 + 130G & gt; T se encontró que se asocia con la reducción del riesgo de cáncer de pulmón . La UGT1A6 105C & gt; T es un SNP sinónimo que se encuentra en el exón 1 del gen UGT1A6. Aunque el polimorfismo no da lugar a la modificación cualitativa de UGT1A6, nuestro
in vitro
resultados han demostrado que el alelo T está asociado con un aumento de la estabilidad del ARNm y la actividad UGT1A6 alta en proteína variante en comparación con el de tipo salvaje. Esto puede explicar el efecto protector de la UGT1A6 105 alelo T en la reducción de riesgo de cáncer de pulmón. Además, el efecto protector de UGT1A6 105C & gt; T puede ser debido a su vinculación inversa con UGT1A6 * 2 (UGT1A6 541A & gt; G y 552A & gt; C).
UGT1A6 IVS1 + 130G & gt; T se encontró que era la Sólo SNP asociado con un menor riesgo de cáncer de pulmón en el análisis multivariante. No está claro cómo UGT1A6 IVS1 + 130G & gt; T modula el riesgo de cáncer de pulmón ya que se encuentra en la primera región intrónica del gen UGT1A6. En silico análisis utilizando el programa Humana Buscador de empalme (http://www.umd.be/HSF/) sugirió que este SNP no afecta a ninguno de nucleótidos conservados de la sucursal en la región intrónica (datos no mostrados) y sería poco probable que afecte la actividad de empalme
Aunque encontramos UGT1A6 IVS1 + 130G & gt;. t estar en desequilibrio de ligamiento moderada con UGT1A6 541A & gt; G (denotado como UGT1A6 * 5), no se puede explicar el efecto protector observado. Mientras UGT1A6 es la isoforma predominante UGT1A expresado en el pulmón, otras isoformas UGT1A (UGT1A1 y 1A9) expresado en el hígado todavía puede afectar aclaramiento sistémico de carcinógenos asociados con el consumo de cigarrillos [30], [31].
Es posible que IVS1 + 130G & gt; T pueden estar en desequilibrio de ligamiento con polimorfismos en otras isoformas UGT1A que juegan un papel "protector" del riesgo de cáncer de pulmón. . Por ejemplo, Saeki
et al
[32] demostraron que UGT1A6 IVS1 + 130G & gt; T es en estrecha LD con UGT1A9 * 22, un alto alelo actividad enzimática que se sabe que aumenta la transcripción. Además, UGT1A6 se ha demostrado estar en desequilibrio de ligamiento con UGT1A1 y UGT1A7 [33] - [36]. Aunque no se expresa en el pulmón, estas isoformas de UGT han demostrado ser importantes para la remoción de BaP [30], [31].
La principal fortaleza de este estudio es que nuestro hallazgo fue validado en una cohorte independiente. El análisis se restringió a un grupo étnico para minimizar la probabilidad de resultados falsos positivos debido a la heterogeneidad de la población. Hay, sin embargo, varias limitaciones en nuestro estudio que reconocemos. En primer lugar, los pacientes con cáncer de pulmón y controles sanos no fueron emparejados por edad, sexo y antecedentes de tabaquismo. En segundo lugar, dos SNPs, UGT1A6 19T & gt; G y IVS1 + 130G & gt; T se desviaron de la ecuación de Hardy Weinberg. La desviación de la ecuación Hardy Weinberg puede ser causada por errores de genotipado [37], [38]. Habíamos tomado medidas para descartar errores de genotipado mediante el uso tanto de pirosecuenciación y el método de secuenciación directa para identificar los SNPs variantes en nuestros sujetos de estudio
.
En conclusión, este estudio sugiere que los polimorfismos UGT1A6 pueden modular el riesgo de cáncer de pulmón. UGT1A6 105C & gt; T se demostró para aumentar la estabilidad del mRNA, proporcionando una explicación plausible de su asociación con la reducción de riesgo de cáncer de pulmón. Nuestro estudio sugiere que la determinación del genotipo UGT1A6 puede integrarse en estrategia de cribado del cáncer de pulmón para ayudar a identificar las poblaciones susceptibles.
Apoyo a la Información sobre Table S1. List de PCR y cebadores de secuenciación. Se muestra la lista de todos los cebadores utilizados para amplificar y secuenciar cada uno de los ocho SNPs UGT1A6, con información sobre los SNP rsid y su localización proporcionada. También se muestra el tamaño de los productos de PCR y la temperatura de hibridación para cada reacción de PCR. cebadores biotinilados para pirosecuenciación ensayo se indican con el §
doi:. 10.1371 /journal.pone.0042873.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos Dr.Michael H. Corte (Escuela Universitaria de Medicina de Tufts, Boston, Massachusetts) para que nos proporciona plásmido vector de codificación de longitud completa UGT1A6 * 1 secuencia.