Extracto
Celular y enfoques moleculares se están explorando para encontrar un biomarcador que puede predecir el desarrollo de la radiación inducida toxicidad aguda antes de la terapia de radiación. SNPs en los genes sensibles a la radiación pueden ser consideradas como un enfoque para el desarrollo de herramientas para la búsqueda de la base hereditaria de radiosensibilidad clínica. El presente estudio intenta detectar polimorfismos de un solo nucleótido /deleciones en respuesta al daño del ADN, la reparación del ADN, citoquinas profibrotic así como la respuesta de los genes antioxidantes y su potencial predictivo con las reacciones adversas de tejido normal de pacientes con cáncer 183 de cabeza y cuello sometidos a quimioterapia o radioterapia basada en platino solo. Se han analizado 22 polimorfismos en 17 genes que tienen relevancia funcional de respuesta a la radiación. La radioterapia induce mucositis oral y eritema de la piel se consideró como punto final para la radiosensibilidad clínica. correlación directa de alelos heterocigotos y mutantes con reacciones agudas, así como correlación haplotipo revelaron NBN variantes de ser de importancia en el análisis predictivo mucositis oral antes de la radioterapia. Además, el desequilibrio de ligamiento genético existía en XRCC1 polimorfismos de & gt; grado 2 mucositis oral y reacción de la piel que indica el patrón de herencia compleja. El presente estudio indica una asociación de polimorfismo en NBN con radiosensibilidad del tejido normal y además garantiza la reproducción de este tipo de estudios en una amplia serie de muestras
Visto:. Venkatesh GH, Manjunath VB, Mumbrekar KD, Negi H, Fernandes DJ, Sharan K, et al. (2014) Los polimorfismos en genes Radio-Responsive y su asociación con Toxicidad aguda entre los de cabeza y cuello pacientes. PLoS ONE 9 (3): e89079. doi: 10.1371 /journal.pone.0089079
Editor: Jian Jian Li, de la Universidad de California en Davis, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Agosto, 2013; Aceptado 14 de enero de 2014; Publicado: 4 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Venkatesh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiado por Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India, número de concesión TC /01 /COE /06/02/07 (http://dbtindia.nic.in/index.asp). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
precisas metodologías de administración de la radiación han mejorado significativamente la curación del tumor y la tasa de supervivencia debido a los acontecimientos recientes, sin embargo, ha sido a expensas de un aumento significativo de la toxicidad del tejido normal. La heterogeneidad en radiorespuesta tejido normal se observa en los pacientes tratados con dosis idénticas de radiación, lo que conduce además a un proceso dinámico y acumulativo de toxicidad tisular normal. En pacientes con cáncer de cuello (CCC) y la cabeza, la mucositis oral y eritema de la piel son las principales complicaciones durante el transcurso de la quimiorradioterapia. Afecta el control del dolor y la aplicación del tratamiento adecuado, lo que conduce a la radioterapia no anticipada rompe (RT), lo que compromete la eficacia del tratamiento [1]. experiencias clínicas anteriores han indicado que sólo el 20% de la variabilidad fue debido a estocástico o eventos aleatorios, mientras que el resto el 80% eran debido a factores genéticos relacionados con el paciente [2]. La asociación entre la radiosensibilidad severa y síndromes genéticos como la ataxia-telangiectasia, la anemia de Fanconi, y síndrome de Bloom, etc., nos proporciona una prueba del principio de la participación de componente genético detrás de las reacciones agudas de tejidos normales [3]. Además, los resultados anteriores demuestran causa genotipo-dependiente para efectos agudos y tardíos de RT observados en los tejidos normales [4] [5]. Aparte de los aspectos moleculares, nuestros estudios anteriores sugieren que existe una base celular para sensibilidad normal radiación tejido [6]. Dos tercios de los estudios realizados hasta la fecha en el informe de la asociación de la variación genética en los genes candidatos con la toxicidad inducida por la radiación, pero la mayoría de estos estudios son con escaso número de pacientes y carece de validación independiente [7]. Aunque se han realizado estudios para asociar el polimorfismo en genes candidatos seleccionados con efectos adversos observados clínicamente normales del tejido, su aplicabilidad clínica como biomarcador /s sigue siendo cuestionable [8] [9]. Por lo tanto, bien diseñados estudios clínicos son necesarios con cientos de muestras de buscar un biomarcador para el desarrollo de protocolos de tratamiento individuales [10] [11].
En el presente estudio, polimorfismos de nucleótido único /deleciones en genes candidatos seleccionados relacionados con la se analizaron los daños y reparación del ADN, enzimas de desintoxicación y de respuesta antioxidante y citoquinas profibrotic. Se seleccionaron SNPs en genes de respuesta de radiación candidato como ATM, XRCC1, XRCC3, la XRCC4, Ku70, Ku80, LIG4, OGG1, NBN, RAD51, TGFß1, SOD2, CAT y GST. La gravedad de la reacción de la mucositis y la piel oral se registra de acuerdo con Radiation Therapy Oncology Group criterios (RTOG) [12] y la asociación entre el polimorfismo genético y la reacción de la mucositis y la piel por vía oral, se evaluó el aumento del riesgo de desarrollar estas reacciones adversas del tejido normal.
Materiales y Métodos
los pacientes y los datos clínicos
el estudio se realizó entre 183 pacientes sometidos a quimioterapia HNC en el hospital Kasturba, con la aprobación previa del Comité de ética de la Universidad (UEC /15/2007) y un consentimiento informado por escrito de los pacientes antes de la recogida de sangre antes de la RT. Todos los pacientes fueron tratados con 3-dimensional radioterapia conformacional. volumen bruto del tumor (GTV), Clínica volumen de destino (CTV) y el volumen blanco de planificación (PTV) se define por el uso de estos TAC de planificación. volumen de tumor macroscópico abarcaba toda la enfermedad macroscópica conocido como definido por los hallazgos del examen físico y de imágenes clínicas. Los pacientes con enfermedad bruto se trataron usando Linac acelerador-6 MV de rayos X lineal (Elekta digital exacto, Estocolmo, Suecia) con la dosis tumoral total de 70 Gy (2 Gy por día durante 5 días a la semana). Los pacientes después de la resección quirúrgica que tiene márgenes positivos se les dio una dosis de 66 Gy en 33 fracciones. Los pacientes con márgenes positivos no se les dio 60 Gy en 30 fracciones. Dosis de la glándula parótida, submandibular glándulas salivales, los músculos constrictores y otras estructuras no se limita a la vista de la planificación del tratamiento de 3 dimensiones en todos los pacientes. quimioterapia con cisplatino (100 mg /m
2 por una vez en 3 semanas) se le dio a la mayoría de los pacientes cuando la creatinina sérica fue normal. Los pacientes ancianos recibieron una dosis semanal de 40 mg /m
2 por 6 semanas y los pacientes que tienen la elevación de la creatinina sérica en el límite recibido carboplatino (área bajo la curva (AUC) @ 1,5) una vez por semana durante 6 semanas. Un total de 148 pacientes recibieron quimioterapia concurrente y los pacientes restantes se recibieron radioterapia sola. Se excluyeron los pacientes con recidiva tumoral y metástasis a distancia. eventos adversos agudos (mucositis oral y reacción de la piel) se registraron durante y después de la finalización de la terapia de acuerdo a criterios de la RTOG [10]. Los detalles de las características del paciente HNC se describen en la tabla 1.
Genotipado, haplotipos y análisis de desequilibrio de ligamiento
aislamiento del ADN genómico se lleva a cabo mediante el empleo de la extracción con fenol cloroformo y precipitación con etanol procedimiento convencional . La genotipificación se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa restricción basada en el polimorfismo de longitud de fragmentos. Los detalles están disponibles en la tabla 2. El cinco por ciento de las muestras fueron seleccionados al azar y re-genotipo para evaluar la consistencia en los resultados.
El análisis estadístico
Cada polimorfismo fue probado para la desviación de equilibrio de Hardy-Weinberg. La significación estadística se analizó mediante la prueba exacta de Fisher. odds ratio se calcula para comprobar si existe alguna asociación entre el grado de toxicidad aguda y /SNP haplotipos seleccionados. El análisis del haplotipo y desequilibrio de ligamiento cálculos se realizaron utilizando el software SHEsis [13]. Todas las pruebas estadísticas se realizaron utilizando Prism v.5.0 (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.) y el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (Versión 16.0, Chicago, EE.UU.).
Resultados
La distribución de los pacientes en función de la clasificación histopatológica, estadio del tumor y los grados de toxicidad aguda se presenta en la tabla 1. el grupo de edad media de los pacientes considerados en el estudio fue de 54.74 años. se administraron dosis de radiación que van de 60 a 70 Gy (mediana = 66 Gy) en 30 a 35 fracciones a los pacientes. Un total de 148 pacientes fueron sometidos a quimioterapia basada en platino, mientras que el restante se le dio la radioterapia sola. Un total de 183 pacientes, 71 (38,79%) pacientes experimentaron mucositis grave (grado 3 y 4) y 44 (24,04%) experimentaron reacciones graves de la piel. Se analizó la presencia de factores de confusión como la diabetes, la hipertensión, el tabaquismo, el alcohol, la cirugía y la quimioterapia y encontramos que los pacientes con alcoholismo se asoció con el grado ≤2 mucositis (p = 0,02) (Tabla 3).
de acuerdo con los oncólogos de radiación, toxicidad hasta grado 2 es usualmente tolerado por los pacientes sin ninguna intervención terapéutica pero de grado 3 y 4 requiere la intervención con agentes terapéuticos. Con base en esto, y teniendo en cuenta los informes de los estudios anteriores [14] [15], se agruparon los datos de toxicidad de tejidos normales del paciente como de grado ≤2 o & gt; 2. Dado que la dosis expuesta a la región de la cavidad /faringe oral, varía de 0-40% en hipofaringe, laringe, tiroides y la región de origen desconocido, se excluyeron los datos de los cánceres en estas regiones para el análisis de la mucositis oral. De probaron todos los polimorfismos, RAD51 (rs1801321) Ku70 (rs2267437) y XRCC4 (rs1805377) se encontraron para desviarse de Hardy-Weinberg. El análisis univariado mostró que ninguno de los polimorfismos presentó ninguna asociación significativa con la reacción de la piel (Tabla 4). Sin embargo, indicó que las probabilidades de los pacientes que experimentan la mucositis oral grave (grado & gt; 2) con el alelo recesivo de NBN (rs1805794) fue 3,75 veces superior que tiene un intervalo de confianza de 1,201 a 11,70 yp = 0,023. Además, las variantes de heterocigotos en CAT (rs7943316) muestran 0.452 (valor de probabilidades) veces menor propensos a experimentar la mucositis oral grave (grado & gt; 2) con un intervalo de confianza de 0,206-0,993 y p = 0,048. En la continuación, el análisis multivariado indicó que las probabilidades de pacientes que experimentaron mucositis oral grave (grado & gt; 2) con el alelo recesivo de NBN (rs1805794) fue 4,72 veces superior que tiene un intervalo de confianza de 1,384 a 16,151 y p = 0,013 (Tabla 5). Sin embargo, cuando se categorizaron como los datos de la quimiorradioterapia y la radioterapia como grupos separados, no se observó dicha asociación significativa con la toxicidad del tejido normal en el grupo de quimioterapia (Tabla S1 y el cuadro S2). Además, como el número de la muestra es menor en la radioterapia sola (n = 35) que es difícil concluir con eficacia los resultados.
Haplotyping y la combinación de alelos de riesgo
análisis de haplotipo se realizó durante 4 SNPs en XRCC1, 2 polimorfismos en RAD51, así como 2 polimorfismos en NBN para explorar asociación del efecto combinatorio de estas variantes con una mayor radiosensibilidad del tejido normal. El análisis de haplotipos de NBN (rs1805787, rs1805794) del gen demostró G-C haplotipo que se asocia con el desarrollo de la mucositis oral (odds ratio de 1.687 y el IC del 95% de 1,005 a 2,831 con p = 0,047) (tabla 6). Además, para determinar si cualquier múltiplo SNP tiene un efecto aditivo en la mucositis oral, así como reacción de la piel, se analizó el número medio de alelos variantes por paciente en cada grupo RTOG (Figura 1). Sobre la base de la frecuencia de los alelos reportados en la base de datos dbSNP, hemos reportado el tipo silvestre, heterocigotos y genotipos recesivos. Se consideró que el alelo menor en este grupo como el alelo de riesgo y contó el número de alelos de riesgo en cada paciente. Los resultados sugieren que el número de alelos variantes no tiene ningún efecto sobre la gravedad de la toxicidad tejido normal
Los resultados de la prueba de Kruskal-Wallis demuestran que la comparación entre los grupos son no significativa (p & gt; 0,05).. Las barras de error representan el mínimo de los valores máximos de alelo de riesgo representadas en cada grupo.
Además, se analizó el patrón de desequilibrio de ligamiento de SNP en XRCC1 y encontró que rs3213245, rs1799782, y rs25489 rs25487 estaban vinculados con la mucositis oral severa, mientras que, rs1799782 y rs25489 estaban vinculados con la reacción severa de la piel. Además, para validar esta SNPs vinculados fueron analizadas para determinar el patrón de desequilibrio de ligamiento por separado en fenotipos normales overreactor tejido y no overreactor. Los valores de d 'fueron notablemente más alta en fenotipos radiosensibles tejido normal (Figura 2).
Valores
Los números dentro de cada caja representan R2 (%) del desequilibrio de ligamiento.
Discusión
a pesar de que el creciente volumen de datos SNP sugiere la base genética de la susceptibilidad a la radioterapia inducida por efectos agudos, es menos claro si el SNP puede servir como un biomarcador para predecir la toxicidad del tejido normal. La identificación de los perfiles genéticos asociados con un mayor riesgo de complicaciones o reducida de radioterapia parece ser un factor más prometedora para mejorar la eficacia de la radioterapia [9] [16]. La cantidad de diversidad genética humana es inmensa, y estamos ahora empezando a comprender cómo tales cambios afectan a la expresión fenotípica específica. Existen notables variaciones genéticas entre las poblaciones y la comprensión de esta variación nos ayudarán a adaptar la terapia con un enfoque personalizado para el resultado más seguro y eficaz.
Sobre la base de la importancia funcional de genes en respuesta a la radiación, se analizó la asociación de algunos de las variantes de genes importantes que pertenecen a la respuesta de daño en el DNA, la reparación del ADN, citoquinas profibrotic, genes antioxidantes con fenotipo overreactor tejido normal (grado & gt; 2 de toxicidad). No se encontró ninguna asociación significativa tanto para los SNPs seleccionados o de los haplotipos con el riesgo de desarrollar mucositis oral y reacción de la piel en pacientes con CCC. Sin embargo, se observó una asociación para NBN polimorfismo (rs1805794) en univariado, así como modelo multivariado de análisis. Además, uno de los haplotipo NBN se asoció con mucositis orales graves. NBN es un componente del complejo MRE (MRE11-RAD50-NBN) que está implicado en la detección de daños, de señalización y de responder a las DSBs [17]. Este polimorfismo provoca el cambio en la proteína Nibrin en la posición codón 185a a partir de ácido glutámico en glutamina y la importancia funcional de este cambio sigue siendo poco clara [18]. Se informó de que rs1805794 no se asoció con efectos secundarios agudos de la radioterapia en pacientes con cáncer de mama [18] [19]. Además, hay estudios que indiquen que no asociación de rs1805794 y tardíos toxicidades de radiación [20] [21].
En la actualidad existen muy pocos estudios relacionados con la toxicidad tejido normal y el análisis del genotipo en pacientes con CCC, y es menos claro si los SNPs puede servir como un biomarcador para predicitng la toxicidad tejido normal. Werbrouck y compañeros de trabajo [22] informan de que SNPs en genes de reparación del ADN XRCC3 (rs861539) y Ku70 (rs2267437) pueden ayudar a determinar el riesgo de disfagia aguda. Estudio realizado por Pratesi et al. [23] ha sugerido que los pacientes con XRCC1 (rs25487) y RAD51 (rs1801320) tienen una mayor probabilidad de desarrollar mucositis oral y disfagia en pacientes con CCC. A diferencia de los informes anteriores, las variantes son nulos de GSTM1 y GSTT1 también mostraron ninguna asociación con el desarrollo de las reacciones agudas [24]. Además, un análisis a gran escala para la detección de SNPs 3.144 de pacientes con cáncer de mama 156 ha revelado que ABCA1 y el polimorfismo IL12RB2 son altamente susceptibles a dermatitis inducidas por la radiación [25]. Por el contrario, varios estudios encaminados a validar el efecto de TGFß1 [26], [27], ATM, GSTP1, SOD2, TGFß1, XPD y XRCC1 [28] han indicado tal asociación para el riesgo de desarrollar toxicidad tejido normal. Informes anteriores con el enfoque de análisis de haplotipos han revelado varios haplotipos con evidencia significativa para predecir las reacciones agudas de la radioterapia [4] [29] [30]. Nuestro análisis de haplotipo XRCC1 no asociar con el riesgo de aumento de las reacciones agudas, pero NBN haplotipo tenido una asociación para la mucositis oral .. Los estudios sugieren que los SNP o haplotipos en genes candidatos funcionalmente importantes por sí mismas no contribuir a reacciones agudas inducidas por radiación. Además, una amplia revisión de la literatura [8], [31] ha indicado una asociación contradictorio que la susceptibilidad a la toxicidad inducida por la radiación, lo que apoya la necesidad de más estudios.
En conclusión, nos informan de que las variantes genéticas y de haplotipos NBN están asociados con el riesgo de desarrollar mucositis oral en pacientes con cáncer de cabeza y cuello sometidos a quimioterapia /radioterapia. Además de la detección de variantes raras que tiene grandes efectos y las variantes comunes con pequeños efectos, es necesario identificar otros tipos de variación y explorar las interacciones gen de entorno para el desarrollo de modelos predictivos. Además la replicación de los resultados en grandes conjuntos de datos con el enfoque basado en la vía y grandes del genoma estudios de asociación amplia con enfoque metodológico puede ser de gran utilidad para el desarrollo de biomarcadores predictivos para este rasgo complejo y los resultados debe ser confirmado de forma independiente en diferentes poblaciones.
Información de Apoyo
Tabla S1. El análisis univariado de
candidatos polimorfismos de nucleótido único y reacciones cutáneas inducidas por la radiación después de la clasificación de las muestras en base a la quimiorradioterapia y la radioterapia sola
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089079.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2. El análisis univariante
de polimorfismos de un solo nucleótido candidato y la mucositis oral inducida por la radiación después de la clasificación de las muestras en base a la quimiorradioterapia y la radioterapia sola
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089079.s002 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos a todos los pacientes participantes por su cooperación. Estamos en deuda con el Dr. K. Satyamoorthy, Director de la Facultad de Ciencias de la Vida por su aliento y la Universidad Manipal para proporcionar las instalaciones, mientras que la realización de este estudio. Agradecemos al Prof. P. Gopalakrishna Bhat, Prof. S. Padmalatha Rai y el Dr. Saadi Abdul Vahab útil para los comentarios sobre el manuscrito.