Extracto
El diagnóstico tardío de cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de altas tasas de mortalidad en el cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón es una enfermedad heterogénea que induce una respuesta inmune a diferentes antígenos tumorales. Se han descrito varios métodos para autoanticuerpos búsqueda que se basa en paneles de antígenos purificados conocidos. El objetivo de nuestro estudio es encontrar evidencia de que las partes de la unión al antígeno en el dominio de los anticuerpos se comparten entre los pacientes con cáncer de pulmón. Esto fue investigado por un nuevo enfoque basado en la secuencia de unión a antígeno-fragmentos (Fab) de las inmunoglobulinas utilizando técnicas proteómicas sin la necesidad de paneles de antígenos conocidos previamente. A partir de suero de 93 participantes del ensayo NELSON IgG fue aislada y posteriormente digerido en fragmentos Fab y Fc. Fab se purificó de la mezcla digerida por SDS-PAGE. Las bandas que contienen gel Fab fueron extirpados, tríptico digiere y se medirán en un sistema nano-LC-Orbitrap-espectrometría de masas. El análisis multivariado de los datos de espectrometría de masas por análisis discriminante canónica lineal combinada con etapas de regresión logística dio lugar a un modelo de 12-anticuerpo-péptido que era capaz de distinguir a los pacientes con cáncer de pulmón de los controles en una población de alto riesgo con una sensibilidad del 84% y una especificidad del 90%. Con nuestro enfoque Fab-purificación Orbitrap-espectrometría de masas combinado, encontramos péptidos a partir de las partes de variables de anticuerpos que son compartidas entre los pacientes con cáncer de pulmón
Visto:. De Costa D, Broodman I, W Calame, Stingl C, Dekker LJM, Vernhout RM, et al. (2014) Los péptidos de la región variable de anticuerpos específicos son compartidos entre los pacientes con cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (5): e96029. doi: 10.1371 /journal.pone.0096029
Editor: Sophia N. Karagiannis, el Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 22 Julio, 2013; Aceptado: 3 Abril de 2014; Publicado: May 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 de Costa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores Roche Diagnostics gracias por su beca de investigación sin restricciones y NOW (Organización Holandesa para la investigación Científica) por su apoyo financiero (Zenith subvención 93511034). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Esta investigación fue financiada en parte por Roche Diagnostics por una beca de investigación sin restricciones. Roche Diagnostics no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. El apoyo de Roche Diagnostics no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de pulmón es actualmente el cáncer más común con la tasa de mortalidad más alta ( 28%) en el mundo debido a un diagnóstico en un estadio avanzado. [1], [2] Sin embargo, con la demostración de una reducción de la mortalidad por cáncer de pulmón 20% en el ensayo NLST (National Cancer screening Trial) prueba CT dosis baja de pulmón el cáncer está recibiendo un interés creciente. [3] en el ensayo NELSON (belga-holandesa cáncer de pulmón ensayo de cribado) mostró que después de tres detección redondea el 3,6% de todos los participantes de este estudio tuvo un resultado positivo falso en pantalla. [4] a pesar de que, siendo aproximadamente un el 27% de los participantes fueron sometidos a procedimientos invasivos que se encuentran enfermedades pulmonares benignos en el cribado de línea de base (primera ronda ensayo NELSON). [5] Un buen marcador biológico (el panel) reducirá este número de procedimientos invasivos innecesarios. En el momento de la selección individuos de alto riesgo para el cribado se realiza por la edad y los antecedentes de tabaquismo. Un panel de biomarcadores o biomarcador sería de gran ayuda en la selección de los individuos de alto riesgo para la detección de CT, ya que puede detectar el cáncer de pulmón en una etapa anterior a la TC.
Los anticuerpos pueden ser interesantes como marcadores para distinguir los pacientes con cáncer de pulmón de cáncer al pulmón- individuos libres. Estos anticuerpos son producidos por la respuesta inmune que se dirigen a antígenos asociados a tumores específicos (TAA) durante el desarrollo del cáncer, probablemente en una etapa temprana [6] -.. [12] Recientemente Liu et
al
mostró que la concentración de autoanticuerpos circulantes IgG contra transportador ABCC3 fue significativamente mayor en pacientes con adenocarcinoma de mujeres que en los controles hembra [13].
Los anticuerpos humanos consisten en cuatro cadenas, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Cada cadena ligera tiene una variable (V
L) y dominio constante (C
L). Las cadenas pesadas tienen tres dominios constantes diferentes (C
H1, C
H2 y C
H3) y un dominio variable (V
H). Las primeras partes constantes y variables forman el fragmento de unión al antígeno (Fab). Las dos partes constantes restantes de la cadena pesada forman la región Fc. Dentro de las seis regiones determinantes de la complementariedad (Fab CDR1, CDR2 y CDR3) se encuentran entre los marcos. Estas CDR determinan la especificidad de antígeno y forman una superficie complementaria a una forma que es parte del antígeno. CDR son las regiones hipervariables del anticuerpo. [14] anticuerpos, o inmunoglobulinas, son moléculas altamente complejas con gran variación en su secuencia de aminoácidos. La posible diversidad de inmunoglobulinas se estima entre 10
13 y 10
50 y por lo tanto el hallazgo de secuencias idénticas similares o incluso en diferentes individuos por casualidad es en teoría, muy poco probable. [14], [15] Sin embargo, estudios de diferentes grupos de investigación han demostrado recientemente que a pesar de esta pequeña posibilidad teórica de tener anticuerpos idénticos entre los individuos, es posible identificar secuencias similares o idénticas [16] - [19]. Un estudio realizado por nos mostró que en PNS (neurológico paraneoplásico existen síndrome) pacientes secuencias de aminoácidos primaria mutadas idénticas de regiones determinantes de complementariedad (CDR). Estas CDR son específicos para antígenos onconeural conocidos, tales como HUD y Yo en pacientes PNS, y lo más interesante fueron compartidos entre diferentes pacientes SNP [20].
El objetivo de este estudio es encontrar evidencia de que los péptidos de anticuerpos específicos son compartidos entre los pacientes con cáncer de pulmón en contraste con los individuos sin cáncer de pulmón. Como el cáncer de pulmón es una enfermedad heterogénea y con la variabilidad de un anticuerpo que puede ser un desafío para detectar anticuerpos relacionados con el tumor idénticos en el suero. Experimentalmente la hipótesis de que determinadas regiones altamente variables de un anticuerpo que incluye las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) pueden compartirse entre los pacientes con cáncer de pulmón. Nuestro enfoque experimental para verificar esta hipótesis se basa en la secuenciación de péptidos de anticuerpo mediante espectrometría de masas. Medición de suero mediante un espectrómetro de masas puede ser demasiado complejo, debido a la alta variabilidad como se mencionó anteriormente. La purificación de Fab de IgG del suero reducirá la complejidad de la muestra de un paciente con cáncer de pulmón y dará la posibilidad de centrarse en las fracciones de anticuerpos puros.
Materiales y Métodos
Ética y aprobación legal
el ensayo NELSON fue aprobado por el Consejo Holandés de Salud, el Ministerio de Salud y médicos por los comités éticos de todos los centros participantes (número de ensayos clínicos ISRCTN63545820). Todos los participantes de este estudio proporcionado consentimiento informado por escrito para el uso de sus muestras de suero. El donante de la muestra de referencia utilizado a lo largo de este estudio proporcionó
NELSON prueba gratis consentimiento escrito para el uso de su /su suero para fines científicos de acuerdo con las directrices del Banco de Sangre Sanquin, Rotterdam, Países Bajos.
El ensayo NELSON (belga-holandesa ensayo de cribado del cáncer de pulmón) ha comenzado el reclutamiento en 2003 mediante el envío de cuestionarios a 548,489 hombres y mujeres entre 50-75 años de edad. Los participantes tenían que ser fumadores actuales o anteriores durante al menos 25 años, fumar al menos 15 cigarrillos por día o fumar al menos 30 años, el fumar al menos 10 cigarrillos por día. De los 548,489 hombres y mujeres 15.822 participantes fueron incluidos en el ensayo. Estos participantes fueron asignados al azar a un brazo de la pantalla o el control. El brazo de detección recibido prueba CT en años 1,2 y 4. El grupo de control no recibió el cribado (atención habitual). Los participantes con un resultado positivo de la prueba fueron derivados a un neumólogo. Si se estableció el diagnóstico de cáncer de pulmón el paciente fue tratado y se fue cribado. Los participantes con un resultado indeterminado fueron sometidos a un análisis de seguimiento de tres meses más tarde. Si se obtiene un resultado negativo en la prueba del TC de segunda ronda estaba prevista para 12 meses más tarde [5], [21].
Población de estudio
Para este estudio, se seleccionaron cáncer de pulmón 44 casos y 49 controles (Figura S1) de la prueba de detección del cáncer NELSON pulmonar. [5], [21] Para los casos del conjunto de descubrimiento, NELSON 1, sólo la fase inicial (I y II) de células escamosas (n = 4) o adenocarcinomas fueron seleccionados (n = 21). Ellos fueron emparejados con cuidado para los controles por edad, sexo, tabaquismo, la duración y el número de cigarrillos fumados por día, estado de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la exposición al amianto y el sitio de toma de muestras (Tabla S1). Los criterios de selección de los casos de la NELSON 2 (validación) establecido (n = 19) fueron similares, excepto que de todo no pequeñas histología de células y estadios de la enfermedad fueron permitidos (Tabla S1) con el fin de impugnar los resultados de la fase de descubrimiento . En efecto, las características clínicas de los pacientes de control no son similares a la NELSON 1 juego con respecto al consumo de tabaco y la EPOC. Por lo tanto, este conjunto NELSON 2 no se corresponde con el conjunto NELSON 1. Mediante el uso de un conjunto de muestras de validación (NELSON 2) elegido de esta manera, la robustez del método se puede determinar.
Se recogieron muestras de suero para ambos NELSON NELSON 1 y 2 obtenidos a partir de la detección de línea de base CT (primera ronda) .
Fab de IgG de depuración y nanoLC Orbitrap MS los análisis
Antes de todos los procedimientos de preparación de muestras, todas las muestras fueron cegados y la clave para el desenmascaramiento fue puesto en el coordinador de la base de datos del ensayo NELSON. la purificación de IgG y Fab nano-LC Orbitrap MS análisis se realizaron de acuerdo con el método descrito antes. [22] Para una descripción más extensa que se refieren a los métodos S1. En resumen, se aisló IgG del suero y se digirió en fragmentos Fab y Fc (Figura 1). La parte Fab se aisló de la mezcla digerida por SDS-PAGE. Las bandas de gel que contienen Fab fueron extirpados y se digirieron con tripsina. Un trozo de gel que no estaba cargada de proteínas se cortó y se trató como a las bandas Fab extirpados para la evaluación de fondo.
En este diagrama de flujo en las diferentes etapas de purificación Fab, Fab se ilustran la medición y el análisis de datos. En amarillo se muestra la purificación de Fab, en azul la medición de la espectrometría de masas, en verde el análisis de datos y en el análisis estadístico de color rosa.
LCMS mediciones se realizaron en un sistema de Ultimate 3000 nano LC (Thermo Fisher científico /Dionex, Amsterdam, Países Bajos) en línea acoplado a una trampa de iones lineal híbrido /Orbitrap MS (LTQ XL Orbitrap; Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). 4 l de la Fab digerido se cargaron en el sistema. Para más ajustes y soluciones nos referimos a métodos complementarios S1 y obra publicada anterior. [22] Todas las muestras fueron asignados al azar antes de la medición y se midieron en lotes de 11 muestras, incluyendo una muestra de referencia. Una muestra de referencia se utilizó como un control de calidad para cada etapa de medición y análisis. Una muestra en blanco se llevó a cabo al inicio y al final de la medición para determinar el valor y la existencia de arrastre durante la cromatografía.
Análisis de datos
archivos de datos brutos se cargan en el software de progénesis ( Figura 1) (Versión 3.1;. Nonlineair Dinámica Ltd, New Castle, Reino Unido) y los procesos que se han descrito anteriormente [22] Además, se realizó un análisis progénesis donde en lugar de la detección de características (péptido de masas (m /z)) en todo el muestras al mismo tiempo por el programa de software, detección de características se llevó a cabo individualmente por muestra. Características escogidas de ese modo se adaptan a la tabla de resultados progénesis que contiene todas las muestras con una tolerancia de masa de 5 ppm. Esto era de ventaja, ya que ofrece a menudo ocurrir con bajas intensidades en una muestra y, posteriormente, se hacen coincidir por progénesis en todas las otras muestras. Este resultado de los errores relacionados con el fondo si se tiene el espectro de masas en cuenta respectiva. Con este ajuste pequeño en relación asegura que una característica se detecta con mayor precisión a lo largo de las muestras. Los datos adquiridos por este enfoque se filtró utilizando la misma configuración por defecto. [22] Se generó una matriz de datos separada para cada caso y de control que consta de todas las características con las correspondientes abundancia y el tiempo de retención en bruto. Para generar una matriz de datos de gran tamaño que incluye todos los casos y los controles de estas matrices de datos separadas, se realizaron búsquedas en las masas de las matrices de datos separados por caja o el control de la matriz de datos completa generada a partir del análisis estándar progénesis. Cada masa tenía que cumplir tres criterios: 1) m /z (± 5 ppm), 2) tiempo de retención (± 1 min) y 3) de carga idéntica. Si una masa se reunió estos tres criterios de la abundancia en bruto de la matriz completa (generado por un procedimiento general [22] recomendado por el fabricante) se utilizó. Si la masa no cumplía estos criterios se generó un cero por la abundancia en bruto.
espectros MS /MS se extrajeron de los archivos de datos brutos y se convierte en archivos compatibles con la mascota del uso de extracto de msn (parte de Xcalibur versión 2.0. 7, Thermo Fisher Scientific Inc.). Mascot (versión 2.3.01; Matrix Science Inc., Londres, Reino Unido) se utilizó para realizar búsquedas en las bases contra la base de datos NCBInr subgrupo humano (versión de marzo de 11
ª, 2009; restricción de las especies Homo sapiens; 222,066 secuencias) de la extraída los datos de MS /MS (Figura 1). Base de datos (NCBInr) la identificación de péptidos dependiente y
de novo
resultados de secuenciación (picos de software; Versión 5.2; Bioinformática Solutions Inc., Waterloo, Canadá) también se incluyeron en el progénesis proporcionan matriz. Para los ajustes utilizados para la búsqueda de bases de datos y
secuenciación de novo
anterior nos referimos a los métodos de trabajo y publicada S1. [22] para
de novo
secuencias hasta ahora no conocidos a partir de una base de datos, los picos software identifica una leucina para los aminoácidos isobárica leucina e isoleucina. Resultados de la base depende de la identificación de péptidos o
de novo
resultados de la secuenciación fueron incluidos en la matriz, según la puntuación más alta identidad péptido (datos S1, S2 y S3 de datos de datos). Todas las secuencias de péptidos de los casos y los controles identificados por la mascota o picos fueron alineadas posteriormente a bases de datos que contienen V, secuencias de línea germinal D, J o C-región derivados de la base de datos IMGT (IMGT, la inmunogenética sistema de información internacionales http: //www.imgt. org) utilizando el algoritmo BLAST (Figura 1). [23] los péptidos con suficiente partido (bitscore ≥12.5 y la alineación puntuación ≥70%) de la base de datos de la región V fueron asignados a una posición en la molécula de inmunoglobulina con diferentes longitudes de CDR (datos S1, S2 y S3 de datos de datos).
archivos de datos en bruto, de las muestras de referencia de cada conjunto de datos se cargaron por separado en el software progénesis y siguieron los procedimientos estándar como se mencionó anteriormente. Para determinar la proporción de la variación entre las mediciones de la muestra de referencia realizadas en diferentes puntos de tiempo, R cuadrados medios se calcularon para cada muestra. Cada muestra se comparó con todas las otras muestras de referencia medidos en ese conjunto de datos y una mediana r-cuadrado se calculó para cada muestra. La comparación se basa en la abundancia en bruto de cada característica. Esto se realizó por separado para los dos conjuntos de datos independientes, Nelson NELSON 1 y 2 (Tabla S2a y S2b).
Para determinar la proporción de variación (Figura 1) entre las muestras (casos y controles) de los dos conjuntos de datos independientes , se llevaron a cabo los mismos cálculos como se describió anteriormente para cada caso y de control de ejemplo. Este análisis se realizó por separado para los dos conjuntos de datos (Tabla s2c y S2D). Sobre la base de la distribución de los r cuadrados medianos de cada muestra, decidimos establecer un punto de corte en r cuadrados & gt; 0,70. Los casos y controles que obtuvieron una mediana r-cuadrado inferior a 0,70 fueron excluidos del conjunto de datos y análisis adicionales. Los cálculos se realizaron utilizando Microsoft Excel 2007.
Análisis estadístico
Se han utilizado dos conjuntos de datos independientes, NELSON NELSON 1 y 2. El primer paso en el análisis estadístico consistió en la prueba de normalidad utilizando la asimetría y las características de distribución de curtosis de la intensidad de la abundancia en bruto de las características [24].
a continuación, se realizó un análisis univariante, la aplicación ya sea una prueba t no apareado (paramétrica) o una prueba u de Mann-Whitney ( no paramétrico) para detectar diferencias significativas en la abundancia prima entre los casos y controles en el conjunto NELSON 1. [25] el límite de significación se fijó en 0,05 (dos caras). Todas las características identificadas que se encontraron diferencias significativas fueron utilizados para la selección de características para distinguir a los pacientes con cáncer de pulmón de los controles.
En segundo lugar, se utilizó para el análisis multivariante sólo las características identificadas de manera significativa que se había disparado ≥2 MS espectros. Se aplicó un análisis multivariado de las características que cumplen estos criterios con un (logística) modelo de regresión por pasos (y = a
1 × 1 + a
2 × 2 + a
3 × 3 ... .a
nx
n + c) en combinación con el análisis discriminante lineal canónica (Tabla S3a). [26], [27] Esto dio lugar a una combinación de características con alta sensibilidad y especificidad en el conjunto de datos NELSON 1. Esta combinación de características a continuación, se ensayó de la NELSON 2 conjunto de datos utilizando la misma metodología que se ha descrito anteriormente. [26], [27] Nótese que para la NELSON 2 conjunto de datos que era necesario para optimizar los coeficientes en la ecuación de modelo con el fin (Tabla S3b ) para optimizar la sensibilidad y especificidad en el conjunto de datos NELSON 2.
para evitar un efecto aleatorio de errores en el modelado, se verificó la base estadística de la combinación de características en un conjunto de datos permutada. La evaluación consistió en el fondo del mismo flujo de trabajo utilizado para la construcción de modelos, a excepción de que al comienzo de la asignación de casos y controles de NELSON 1 se permutado (Figura S2). Esta permutación se realizó doce veces y se pusieron a prueba los resultados obtenidos para la significación contra el resultado modelo por z-test (de un solo lado; p & lt; 0,05). Desde la construcción del modelo se basa en los datos conforme a lo dispuesto en NELSON 1 después de lo cual la validación de este modelo se realizó utilizando los datos en Nelson 2, el mismo enfoque se tomó después de cada permutación individual. También en este caso, tenga en cuenta que para NELSON 2 conjunto de datos se optimizaron los coeficientes en la ecuación del modelo.
Todos los análisis sobre la construcción de modelos, validación y evaluación de fondo se realizaron utilizando STATA, versión 12 (StataCorp, Texas, Estados Unidos). Durante todo el estudio, utilizando la prueba de dos caras (a excepción de un solo lado de pruebas para valores Z), se consideró que los valores de p de 0,05 o menor para ser estadísticamente significativa. Los análisis estadísticos de los datos que se muestran en la Tabla S1 fueron generados por SPSS (IBM SPSS Statistics 20). El tiempo para el cáncer se generó mediante el cálculo del intervalo entre el muestreo de sangre y el diagnóstico de cada caso.
Resultados
Características clínicas de la población estudiada
No hubo diferencia significativa en las características clínicas entre los casos y controles en la NELSON 1 juego (Tabla S1). En el conjunto NELSON 2, estado de fumador y EPOC actual o anterior difería significativamente entre los casos y controles (Tabla S1). En el 72% y el 84% de los casos del conjunto NELSON 1, 2 y Nelson conjunto, respectivamente, el intervalo de tiempo entre la toma de muestras de sangre y el diagnóstico del cáncer de pulmón fue de entre 0-1,5 años. La duración mediana de seguimiento después de la toma de muestras de sangre fue para la población de control 1925 días (rango 1075-2086 días) y 1861 días (rango 347 a 2135) en el conjunto NELSON 1 y 2 NELSON conjunto, respectivamente. Ninguno de los controles desarrollaron cáncer de pulmón durante el período de seguimiento.
variante técnica
Durante las mediciones de espectrometría de masas de las muestras biológicas se midió una muestra de referencia en diferentes puntos temporales. Los valores R-cuadrado se calcularon a partir de las abundancias de proteínas identificadas en cada medición de referencia para demostrar la reproducibilidad técnica. El valor R-cuadrado más bajo observado en las diferentes mediciones varió entre 0,84 y 0,93 (Figura 2).
Muestra de referencia medido en diferentes puntos temporales durante la medición del conjunto de muestras NELSON 1. Una réplica de la muestra de referencia (eje x) se comparó con la otra muestra replicada en base a la abundancia en bruto de cada función. Se calculó un valor de r-cuadrado. Cada punto representa un valor de r-cuadrado (eje Y) para la comparación de que la replicación específica con otra réplica. Para cada réplica se muestra el R-cuadrado y la desviación estándar media (SD).
Se realizó el mismo cálculo de r-cuadrado para 5 muestras biológicas tomadas al azar del conjunto NELSON 1 que se midieron en dos diferentes LC-columnas (mismo lote) en diferentes puntos de tiempo. La reproducibilidad técnica dentro de cada columna dio lugar a valores más bajos de I-cuadrado que van 0,75-0,93, pero la reproducibilidad técnica de las cinco muestras biológicos medidos en dos columnas similares independientes fue menor. Para las dos columnas independientes similares se observó una mediana r-cuadrado de 0,52. En la figura 3 la correlación entre cada muestra y entre las columnas se muestran.
Este dendrograma muestra la correlación entre cinco diferentes muestras biológicas medidos en dos columnas diferentes de un mismo lote, la columna 1 y la columna 2 (eje y). En el eje y se muestran las cinco muestras diferentes. Muestra 1-5 se miden en la columna 1 y 6 a 10 se miden en la columna 2. Muestra 1 y 6 son del mismo individuo. Esto también se aplica para la muestra 2 y 7, 3 y 8, 4 y 9 y 5 y 10. En el eje X se muestra la distancia euclidiana entre cada muestra. Una fuerte correlación por columna se encuentra
En la Figura 4A se muestran los tiempos de retención para los péptidos identificados con alta confianza (Mascota puntuación & gt; 60). En las muestras de referencia, medida simultáneamente con ambas NELSON 1 y Nelson 2. Esta figura muestra que el rendimiento de la columna era comparable entre las dos columnas de LC diferentes para estos péptidos abundantes (r-cuadrado 0,996). Además, las abundancias observadas para estos péptidos también se correlacionó bien (Figura 4B; r-cuadrado 0,995). Esto sugiere que tanto la cromatografía y la espectrometría de masas realizaron nominalmente, al menos por los péptidos identificados con alta confianza en abundancia relativamente alta. Por lo tanto, la variación técnica vemos deriva principalmente de péptidos en menor abundancia, más cerca de los límites de detección (Figura S3).
Para las muestras de referencia que se midieron durante tanto NELSON NELSON 1 y 2, se compararon los péptidos que eran identificado con alta confianza por una búsqueda de la mascota con un resultado de más de 60 en ambos conjuntos. Para este subconjunto de péptidos, se compararon los tiempos de retención observados en Nelson 1 y Nelson 2 (A) y también su abundancia (B). Para estos parámetros se observó valores de r-cuadrado de 0,996 y 0,995, respectivamente.
Una estimación de la variación biológica se realizó y resultó en una mediana r-cuadrado de 0,43. Este resultado fue mucho más baja que la más baja r-cuadrado (0,84) observado para la variación técnica. Por lo tanto, la variación biológica es mayor en comparación con la variación técnica.
Estos resultados muestran que la variación técnica debe ser tomado en cuenta y es necesario un ajuste para la comparación de conjuntos de la muestra medidos de forma independiente desde la NELSON 1 y 2 NELSON conjunto de datos eran medido en dos columnas diferentes en diferentes puntos temporales. Para superar esta variación técnica, hemos aplicado una serie de filtros en los datos antes de poder iniciar un análisis de datos como se describe en Material & amp; sección de métodos.
Con estos datos se realizó un análisis univariado separado sobre todos los péptidos que se encuentran en los casos y los controles de la serie de datos separada NELSON NELSON 1 y 2. Hemos sido capaces de observar 49 péptidos que fueron significativamente diferentes entre los casos y controles en el conjunto de datos NELSON 1. Sin embargo, estos péptidos, con una excepción, no mostraron esta diferencia en el conjunto de datos NELSON 2. No hubo una tendencia observada (r-cuadrado 0,004) en los valores de p para los dos conjuntos de datos. Por lo tanto, las pruebas univariately de esta manera o bien no fue la estrategia de análisis derecha o las características seleccionadas al azar de proceso generados (azar). Por lo tanto, los péptidos significativos de NELSON 1 se analizaron como un paso siguiente de una forma multivariante.
Anticuerpos Péptidos Modelo
Una combinación óptima de 12 péptidos fue identificado por las estadísticas multivariantes utilizados en la NELSON 1 juego (juego de descubrimiento). Esta combinación de péptidos podría distinguir a los pacientes con cáncer de pulmón de los controles con sensibilidad y especificidad de 96% y 100%, respectivamente. Este modelo péptido anticuerpo fue capaz de detectar el cáncer de pulmón 373 días en promedio (rango de 39-1193 días) antes de que se determina el diagnóstico. En la Figura 5 se muestra que la combinación de los 12 péptidos fue capaz de distinguir los casos de los controles. Los 12 péptidos corresponden a 1 secuencia de solapamiento con la región CDR2, 1 secuencia de superposición de la región CDR3, 7 secuencias solapantes de la región marco 1 y 3 secuencias solapantes con la región marco 3 de acuerdo con la base de datos de IMGT (Tabla 1).
las abundancias primas se rellenaron en la ecuación del modelo (y = a
1 × 1 + a
2 × 2 + a
3 × 3 ... .a
nx
n + c ) del conjunto de la muestra correspondiente. En el eje Y (en unidades arbitrarias) se muestran las cifras generadas por la ecuación.
Se realizó una validación externa en el conjunto NELSON 2 (validación). Cuando se aplicó el mismo modelo 12 péptido a este conjunto, los casos y los controles ya no se podían distinguir. Sin embargo, con los mismos péptidos, pero después de volver a la optimización de los coeficientes del modelo, se observó una sensibilidad y especificidad del 84% y 90%, respectivamente. A medida que se ajustan los coeficientes de la ecuación que teníamos para comprobar si hay la posibilidad de sobreajuste de los datos. Por lo tanto, una evaluación de fondo se llevó a cabo, que se describirá más tarde. Dentro de la validación NELSON 2 establece la combinación de péptidos fue capaz de detectar el cáncer de pulmón de 281 días en promedio (rango 54-777 días) antes del diagnóstico de cáncer de pulmón.
Se comparó la abundancia en bruto de los 12 péptidos entre los dos conjuntos de datos Nelson. Se observó que la abundancia prima promedio de cinco péptidos fue mayor en los casos en comparación con la abundancia media de los controles del conjunto de datos NELSON 1. Estos datos fueron consistentes con los hallazgos de la NELSON 2 conjunto de datos (Tabla S4). Los otros siete péptidos tenían una abundancia prima promedio más alto en los controles del conjunto de datos NELSON 1 en comparación con la abundancia en los casos de este conjunto de datos. Por tan sólo uno de estos siete péptidos, esta diferencia podría ser confirmado en el conjunto de datos NELSON 2 (Tabla S4).
Evaluación Antecedentes de anticuerpo del péptido Modelo
Además de la conclusión de la combinación óptima de péptidos que distinguen significativamente los casos de los controles, se realizó un análisis de fondo. Como los coeficientes de la ecuación del modelo se ajustaron para cada conjunto de datos se verificó los resultados de una contribución de la selección aleatoria de los datos y por lo tanto la posibilidad de encontrar un modelo comparable por casualidad. El mismo flujo de trabajo se aplicó para la construcción de modelos, excepto que en el comienzo del flujo de trabajo los casos y controles de NELSON 1 fueron permutados al azar (Figura S2). El descubrimiento se realizó en las 12 veces permutated NELSON 1 conjuntos de datos, cada vez con 12 péptidos diferentes que muestra el más bajo valor de p (p & lt; 0,05) en el NELSON 1 juego para que la permutación en particular. La validación de estos modelos se realizó en NELSON 2. El rendimiento del modelo multivariado de los conjuntos de descubrimiento permutados (NELSON 1) se muestra en la Figura 6A (puntos azules), donde la sensibilidad se representa frente a la especificidad. La potencia correspondiente en los conjuntos de validación (Nelson 2) se muestra en la Figura 6B (puntos azules). Por lo tanto, cada punto en la figura 6A (punto azul) se corresponde con un punto (punto azul) en la figura 6B. Además, el rendimiento encontraron resultados para los conjuntos de datos reales en los que se encontró el modelo de péptido anticuerpo se traza (punto rojo). Se puede observar que el ajuste multivariante de los conjuntos de datos permutados produce modelos razonables, incluso para los datos permutables en el conjunto de descubrimiento.
Doce veces una permutación (fondo) se realizó en la NELSON NELSON 1 y 2 conjunto de datos. La sensibilidad y especificidad del modelo de péptido de anticuerpos se muestran en rojo. evaluación Antecedentes: A) Doce carreras de permutación se muestran con la correspondiente sensibilidad y especificidad de la NELSON 1 conjunto de datos (azul). Los mismos 12 péptidos que se encuentran en la evaluación de fondo NELSON 1 se ensayaron en NELSON 2. B) Los 12 carreras se muestran con la correspondiente sensibilidad y especificidad de NELSON 2 conjunto de datos (azul). Tenga en cuenta, ya que algunos resultados del análisis de los antecedentes se produjeron más de una vez, se añadieron un número aleatorio entre -1 y 1 para cada número de sensibilidad y especificidad para asegurarse de que cada análisis (punto azul) se puede ver en la figura.
Sin embargo, sobre todo en los conjuntos de datos de validación, los datos reales (modelo de péptido anticuerpo) realizaron significativamente mejor (p & lt; 0,05) que los conjuntos de datos permutados, lo que sugiere que los péptidos de inmunoglobulina albergan información relacionada con el estado de la enfermedad del paciente. Por lo tanto, los resultados obtenidos no provienen de un artefacto en el procesamiento de datos.
CT Proyección de resultados en NELSON NELSON 1 y 2 del conjunto de datos
En la Figura 7A y 7B los resultados de la evaluación de la línea de base las tomografías computarizadas se muestran para el conjunto NELSON NELSON 1 y 2, respectivamente. De acuerdo con el protocolo de detección del ensayo NELSON, una repetición de la exploración CT se realizó siguiendo un resultado indeterminado de cribado, aproximadamente 3 meses más tarde.
Resultados de la tomografía computarizada de la A) NELSON 1 y B) NELSON 2 conjuntos de la muestra son se muestra en el momento de la extracción de sangre (línea de base). Asimismo, los resultados se muestran CT del seguimiento de tomografía computarizada después de aproximadamente tres meses (Seguimiento). Para un caso de la NELSON 1 juego sin resultado TC de seguimiento estaba disponible. La última fila representa el número de resultados positivos TC, indeterminados y negativos de la línea de base, incluyendo los resultados del seguimiento.
Hemos observado que el 68% de los casos tuvo un resultado de detección positiva tanto en la NELSON 1 y Nelson 2 juegos durante los 3 primeros meses del programa de cribado, los otros tipos de cáncer de pulmón fueron diagnosticados tras otra repetición de la exploración CT después de 3 meses o durante la segunda ronda de cribado. Después de una media de 367 días (rango 39-1193 días) para NELSON 1 y 269 días (rango 54-777 días) para NELSON 2, el resultado de cribado fue positivo, es decir sospecha de cáncer de pulmón y resultando en trabajo clínico en marcha por el neumólogo