Extracto
Los retinoides, los derivados naturales o sintéticos de la vitamina A (retinol), son esenciales para el normal, desarrollo de la próstata y se ha demostrado que modulan la progresión del cáncer de próstata in vivo, así como para modular el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata varios. 9-cis-retinoico ácido y todo-trans-retinoico ácido son los dos metabolitos más importantes de retinol. Las uniones comunicantes, formados por proteínas llamadas conexinas, son conjuntos de canales intercelulares que permiten el intercambio de moléculas reguladoras pequeña de crecimiento entre las células adyacentes. Gap comunicación en ocasiones es instrumental en el control del crecimiento celular. Se examinó el efecto del ácido 9-cis-retinoico y todo trans del ácido retinoico sobre la formación y la degradación de las uniones comunicantes, así como en la comunicación de la unión en una línea celular de cáncer de próstata andrógeno-sensibles, LNCaP, que expresó introdujo retrovıricamente connexin32, una connexin expresado por las células luminales y células bien diferenciadas de los tumores de próstata. Nuestros resultados mostraron que el ácido 9-cis-retinoico y el ácido trans-retinoico mejoran el montaje de connexin32 en las uniones comunicantes. Nuestros resultados mostraron además que el ácido del ácido 9-cis-retinoico y todo-trans-retinoico impedido la degradación regulada por andrógenos de uniones de hendidura, después de la traducción, independiente de la señalización mediada por receptor de andrógenos. Por último, nuestros resultados mostraron que la formación de uniones comunicantes sensibiliza las células LNCaP que expresan connexin32 al crecimiento modificando efectos del ácido 9-cis-retinoico, todo-trans-retinoico y los andrógenos. Por lo tanto, los efectos de los retinoides y los andrógenos sobre el crecimiento y la formación y degradación de las uniones intercelulares y su función podría estar relacionado con su capacidad para modular el crecimiento de la próstata y el cáncer de
Visto:. Kelsey L, P Katoch, Johnson KE , Batra SK, Mehta PP (2012) los retinoides regulan la formación y la degradación de las uniones comunicantes en las células sensibles a andrógenos cáncer de próstata humano. PLoS ONE 7 (4): e32846. doi: 10.1371 /journal.pone.0032846
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Octubre, 2011; Aceptado: 31 Enero 2012; Publicado: 13 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Kelsey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el NIH CA113903, el DOD PCRP (Departamento de Programa de Investigación de cáncer de próstata Defensa) 081198, y del estado de Nebraska de Grant LB506 (PPM). Agradecemos el apoyo del Centro de Nebraska para la Señalización Celular y NCI beca de formación de Kristen Johnson. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los retinoides, los derivados naturales o sintéticos de la vitamina a, regulan no sólo el desarrollo embrionario, sino también la organogénesis en tejidos adultos [1]. Un requisito para la vitamina A para la proliferación, la diferenciación se ha demostrado en muchos estudios en los que una deficiencia de esta vitamina resultó en múltiples defectos de desarrollo [1] - [3]. Todo el ácido trans-retinoico (ATRA) y ácido 9-cis-retinoico (9-CRA) son los dos metabolitos más importantes de la vitamina A (retinol) con diversas funciones fisiológicas [1]. Los retinoides son miembros de la superfamilia del receptor nuclear de factores de transcripción y ejercen sus efectos pleiotrópicos mediante la regulación de la expresión de varios genes diana [3] - [5]. Hay seis receptores de retinoides, a saber α RAR, b, g, que se unen a ATRA y 9-CRA y RXR α, ß, γ, que se unen sólo a los 9-CRA. la señalización iniciada retinoide regula varios mecanismos de control homeostático durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos y uno de esos mecanismos de control susceptibles de ser regulados es la comunicación directo célula-célula mediada por una clase especial de uniones de las células llamadas uniones comunicantes (GJS) [6] - [ ,,,0],8]. Gap cruces son conjuntos de canales intercelulares que señalan al permitir el intercambio directo de pequeñas moléculas (≤1500 Da) entre celdas contiguas. Las proteínas constituyentes de GJS, llamadas conexinas (CXS), están codificados por 21 genes, que han sido designados de acuerdo con su masa molecular [9]. canales célula-célula son estructuras bicelular formados por la asociación de dos células. Para formar un canal de célula-célula GJ, CXS oligomerizar primero como hexámeros, llamados connexons, que muelle con los connexons que aparecen en las células contiguas [10]. Múltiples líneas de evidencia le da credibilidad a la idea de que la comunicación en ocasiones presentan diferencias es un importante mecanismo de control homeostático para regular el crecimiento y la diferenciación celular. Por ejemplo, alteración de la expresión Cx, o pérdida de la función, ha sido implicado en la patogénesis de varios tipos de cáncer, y las mutaciones en varios genes Cx se han detectado en los trastornos genéticos caracterizados por una proliferación celular aberrante y la diferenciación [8], [10] - [12]
Nuestros estudios previos demostraron que las células luminales de próstata expresan Cx32 y su expresión coincidieron con la adquisición del estado diferenciado de estas células [13], [14]. Hemos demostrado que la progresión del cáncer de próstata (PCA) de un estado dependiente de andrógenos a un estado invasivo, independiente de andrógenos se caracterizó por el fracaso de Cx32 de montar en GJS [14], [15]. Además, hemos demostrado que la reintroducción de Cx32 en línea sensibles a andrógenos humano PCA celular, LNCaP, retarda el crecimiento celular
in vivo
y
in vitro
[14], [16]. Posteriormente, hemos demostrado que los andrógenos regulan la formación y la degradación de GJS alterando el nivel de expresión de Cx32, después de la traducción. En ausencia de andrógenos, una importante fracción de Cx32 se degradó por retículo endoplásmico degradación asociada (ERAD) mientras que en su presencia esta fracción fue rescatado de la degradación de [17]. La importancia de estos hallazgos es subrayada por el hecho de que los andrógenos juegan un papel importante en la supervivencia y el mantenimiento de la secreción función de las células epiteliales luminales de próstata normal (relacionados con la diferenciación), así como de las células tumorales como la ablación de andrógenos induce la apoptosis o desdiferenciación de estas células [18], [19]
al igual que los andrógenos, los retinoides son también esenciales para el desarrollo normal de la próstata y modulan la progresión de la PCA en ciertos modelos de ratón, así como suprimir el crecimiento de andrógeno-dependiente y - PCA líneas celulares humanas independientes. Se observó metaplasia escamosa de la próstata entre los descendientes de carencia de vitamina A [20] y RARγ ratones knock out [21]. Además, la inactivación específica de tejido de RAR en la próstata dio lugar a la hiperplasia intraepitelial multi-focal [22]. Estudios epidemiológicos han demostrado que la disminución de vitamina A niveles séricos aumentar la incidencia de PCA y la progresión, y que la restauración de los niveles de retinoides podría tener un papel en la reversión del fenotipo maligno [23], [24]. Varios estudios, incluyendo el nuestro, han demostrado que la capacidad de los retinoides para suprimir el crecimiento de células tumorales e inducir la diferenciación es contingente sobre su capacidad para mejorar la comunicación de la unión brecha [25] - [28]. Debido Cx32 se expresa por las células epiteliales luminales de la próstata normal en el que se ensambla en GJS y por las células epiteliales de los tumores de próstata en el que se forma ineficiente ensamblados en GJS [13] - [15] y porque la formación de GJS ha sido implicado en el mantenimiento de la estado polarizado y diferenciado de las células epiteliales [29], que razonó que los efectos quimiopreventivos, inhibidor del crecimiento y pro-diferenciadores de 9-CRA y ATRA podrían ser el resultado de su capacidad para controlar la formación y degradación de gjs. Por lo tanto, se investigó si la formación y degradación de los compuestos de Cx32 gjs estaban regulados por 9-CRA y ATRA en células humanas de PCA. Debido a que los retinoides han demostrado aumentar la expresión del receptor de andrógenos (AR) en las líneas sensibles a andrógenos humanos PCA de células [30], se razonó que podrían modular la formación de andrógenos reguladas y la degradación de GJS y afectar el crecimiento de las células de PCA sensibles a andrógenos que expresan Cx32. Mediante el uso de células LNCaP sensibles a andrógenos, que expresan de forma retroviral introdujeron Cx32 cuya degradación es regulada por andrógenos [17], se muestra que el 9-CRA y ATRA, como los andrógenos, aumentan la expresión de Cx32 y su posterior ensamblaje en gjs. Por otra parte, una vez más demuestran aquí que en este modelo de cultivo celular, ATRA y 9-CRA prevenir la degradación regulada por andrógenos de GJS, independiente de la señalización mediada por AR. Por último, nuestros resultados muestran que la expresión de Cx32 y la formación de gjs sensibiliza estas células para la modificación de crecimiento efectos de 9-CRA, ATRA y andrógenos.
Materiales y Métodos
Cell Culture
células LNCaP sensibles a andrógenos fueron un regalo del Dr. Lin [31]. Uno de los varios clones de células LNCaP que expresan rata retrovıricamente transducidas Cx32, de aquí en adelante como células LNCaP-32, y uno de los varios clones de control seleccionadas en G418 después de la infección con el retrovirus de control, de aquí en adelante como células LNCaP-N, se aislaron como se describe [17] y se utilizaron en el presente estudio junto con las células LNCaP parentales, de aquí en adelante como células LNCaP-P. células LNCaP-P se cultivaron en RPMI que contenía suero bovino fetal al 5% en una atmósfera de aire y culturas de valores /95% de CO2 5% se mantuvieron semanal como se describió anteriormente. células LNCaP y LNCaP-N-32 se mantuvieron en RPMI que contenía 5% de suero bovino fetal y G418 a 200 mg /ml como se describe [17]. Durante el transcurso de estos estudios, se utilizaron dos lotes separados de suero fetal bovino obtenidos de Sigma y Hyclone Laboratories, con efecto casi similar en el crecimiento de las células LNCaP. suero de esteroides-empobrecido (tratado con carbón vegetal) se obtuvo de Hyclone Laboratories (Salt Lake City, UT). También se utiliza fenol rojo RPMI libre de experimentos en los que se utilizó el suero tratado con carbón vegetal [17].
Los anticuerpos y Inmunoticción
hibridoma M12.13 (un regalo del doctor Dan Goodenough, Harvard Universidad) se ha descrito anteriormente [14], [16], [17], [32], [33]. Mouse anti-ocludina (clon OC-3F10) fue de Zymed Laboratories Inc. (South San Francisco, CA). Rabbit anti-α-catenina, conejo anti-β-catenina, conejo anti-Cx32, y el ratón anti-β-actina (clon C-15) fueron de Sigma (St. Louis, MO). Ratón anti-E-cadherina, ratón anti-α-catenina, los anticuerpos anti-β-catenina de ratón fueron generosamente proporcionadas por los Dres. Johnson y Wheelock (Eppley Institute) y se han descrito [17], [32], [33]. Un anticuerpo anti-receptor de AR policlonal de conejo era de Santa Cruz Biotech (sc-13062, San Diego, CA). Las células se inmunoti~neron después de la fijación con 2% de paraformaldehído durante 15 minutos como se describe anteriormente [17], [32], [33]. Brevemente, las células (1,5 × 10
5), se sembró en seis grupos de pozos que contienen cubreobjetos de vidrio y se dejaron crecer hasta aproximadamente 50 a 70% de confluencia, se inmunotiñeron a temperatura ambiente con diversos anticuerpos en diluciones adecuadamente calibrados. Los anticuerpos secundarios (conejo o ratón) conjugado con Alexa 488 y Alexa 594 fueron utilizados como apropiado. Imágenes de células inmuno fueron adquiridas con el microscopio Leica DMRIE (Leica Microsystems, Wetzler, Alemania) equipado con cámara Hamamatsu ORCA-ER CCD (Hamamatsu-City, Japón). Para los estudios de co-localización, Z-secciones seriadas (0,5 micras) fueron recogidos y analizados utilizando el software de procesamiento de imágenes (Volocity; Improvisación, Inc; Perkin Elmer).
Imagenes Soluciones
Las soluciones madre de diversos reactivos se prepararon como sigue: 9-CRA y ATRA (BIOMOL, Plymouth, PA) se prepararon en etanol a 3 mM de cada uno y se almacena en alícuotas a -80 ° C protegido de la luz. Todos los experimentos relativos a 9-CRA y ATRA se llevaron a cabo a la luz amarilla como se describe [26], [27]. Las soluciones madre de un andrógeno sintético, mibolerona (MB), (BIOMOL), y de un andrógeno natural, dihidrotestosterona (DHT), se prepararon a 1 mM en etanol y se almacenaron a -20 ° C en alícuotas pequeñas protegidas de la luz. Se diluyeron apropiadamente con el medio en el momento del tratamiento.
andrógenos agotamiento y Otros Tratamientos
Las células fueron sembradas en seis grupos de pozos que contienen cubreobjetos de vidrio (1,5 × 10
5 células por pocillo) y en 6-cm (2 × 10
5 células por placa) o platos in10 cm (3,5 × 10
5 células por placa) en 2, 4 y 10 ml de medio de cultivo completo, respectivamente. Las células fueron tratadas cuando aproximadamente el 50% de confluencia, por la reposición con medio fresco que contiene diferentes reactivos a la concentración deseada añadido partir de soluciones madre de modo que la concentración final del disolvente no excedió de 0,3%. Para hacer crecer células en medio de andrógenos empobrecido, medio de cultivo celular normal se reemplazó con medio de cultivo celular andrógeno-empobrecido (fenol RPMI libre de rojo que contiene 5% de suero tratado con carbón vegetal). Los controles recibieron medio fresco que contenía suero normal.
análisis de transferencia Western y detergente Solubilidad de Connexin32
lisis celular, el ensayo de solubilidad de detergente con 1% de Triton X-100 (TX-100) y la expresión nivel de Cx32 se analizaron mediante análisis de transferencia Western como se describe [17], [32], [33]. Brevemente, 5 × 10
5 LNCaP-P, LNCaP-N y células LNCaP-32 fueron sembradas por placa de 10 cm en 10 ml de medio completo y se cultivaron hasta confluencia, después de lo cual las células se lisaron en SSK tampón (Tris 10 , EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaF 10 mM, NEM 10 mM, Na 10
2VO
4, 10 mM yodoacetamida, 0,5% TX-100, pH 7,4) suplementado con el cóctel inhibidor de la proteasa (Sigma , St. Louis, MO). Total, detergente soluble y extractos -insoluble se separaron mediante ultracentrifugación a 100.000 xg durante 60 min (35.000 rpm en analítica ultracentrífuga Beckman; Modelo 17-65 usando un rotor SW50.1). Las pastillas de detergente insolubles se disolvieron en tampón C (70 mM Tris /HCl, pH 6,8, 8 M urea, 10 mM NEM, 10 mM yodoacetamida, 2,5% SDS, y 0.1 M DTT). Tras la normalización basada en el número de células, el total, fracciones TX-100-solubles y -insoluble se mezclaron con 4 x tampón de carga SDS-a una concentración final de 1 × y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h (para Cx32) antes de SDS PAGE
Ensayos communication Francia comunicación en ocasiones
Gap se ensayó mediante la microinyección de los siguientes trazadores fluorescentes:. amarillo Lucifer (MW 443 Da; sal de litio); Alexa Fluor 488 (MW 570 Da; A-10436), y Alexa Fluor 594 (MW 760 Da; A-10438). Las soluciones madre de colorantes Alexa, obtenidos como sales de sodio de hidrazida de Molecular Probes (Carlsbad, CA), se prepararon en agua a 10 mM. Amarillo lucifer se microinyectó como solución madre acuosa al 2,5%. sistemas de microinyección Eppendorf InjectMan y FemtoJet (modelos 5271 y 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, NY), montados en Leica DMIRE2 microscopio como se ha descrito anteriormente, se utilizaron para microinyectar trazadores fluorescentes. Las imágenes de las células microinyección fueron capturadas con la ayuda de la cámara CCD (Retiga 2000R, FAST 1394) utilizando QCapture (British Columbia, Canadá) y se almacenan como archivos TIFF. transferencia de la unión de trazador fluorescente se cuantificó anotando el número de células fluorescentes (excluyendo el inyectado) de las imágenes TIFF capturados, ya sea en 1 min (Lucifer Yellow), 3 min (Alexa 488) y 15 min (Alexa 594) después de microinyección en célula de ensayo como se describe [14], [17], [32], [34].
formación de colonias y el crecimiento celular Los ensayos
El crecimiento celular se evaluó ya sea por la formación de colonias de ensayo o contando células como se describe [14], [34]. Para el ensayo de formación de colonias, 2 × 10
3 células fueron sembradas en 6 cm platos, por triplicado, en medio de cultivo 3 ml. Después de 24 h, un medio que contiene ml MB, 9-CRA y ATRA se añadió a los platos para dar la concentración final deseada. Las células se cultivaron durante 3-4 semanas (con un cambio de medio cada 4-5 días que contienen la concentración apropiada de MB, DHT, 9-CRA y ATRA) cuando se formaron colonias visibles. Las colonias en placas se fijaron con 3,7% de formaldehído tamponado, se tiñeron con solución de 0,025% de violeta de cristal en PBS, y se fotografiaron. Para medir el crecimiento celular, 5 × 10
4 células fueron sembradas en 6 cm platos en la replicación y se trató con MB, 9-CRA y ATRA ya sea solo o en combinación como se describe anteriormente. Las células se dejaron crecer durante 9-11 días con un cambio de medio el día 5. Las células se trataron con tripsina y se contaron en un hemocitómetro.
Resultados
Los retinoides Mejorar Cx32 Expresión Nivel
se utilizaron células LNCaP-32 transducidas con retrovirus que expresan Cx32 rata [17] ya que las células de los padres LNCaP y LNCaP-P-N están desprovistos de niveles detectables de CxS conocidos y no forman gjs funcionales (ver Materiales y Métodos). Estudios anteriores demostraron que en las células LNCaP-32 andrógenos regula la formación y la degradación de GJS mediante el control del nivel de expresión de Cx32 después de la traducción, mediante el rescate de su ERAD mediada por la degradación [17]. Sobre la base de la lógica descrita anteriormente (véase la introducción) y en nuestra experiencia con otras líneas celulares [26], [27], LNCaP-32 células fueron tratadas con 9-CRA y ATRA durante 48 horas para examinar si afectan el nivel de expresión Cx32. Se encontró que 9-CRA y ATRA aumentaron nivel de expresión Cx32 en una forma dependiente de la dosis (Figura 1, A). mejora significativa, sin embargo, sólo se observó a una concentración de 1 M o más altas. Según la evaluación por el ensayo de formación de colonias, concentraciones superiores al 1 mM fueron tóxicos para estas células (datos no mostrados) y por lo tanto elegimos 1 M de 9-CRA y ATRA para estudios posteriores. estudios de evolución en el tiempo demostraron que mejora con ambos retinoides se produjo a los 24 h post-tratamiento y alcanzó una meseta a las 72 h (Figura 1, B). El efecto de la 9-CRA y ATRA en el nivel de expresión de Cx32 fue comparable a la observada con un andrógeno sintético, mibolerona (MB), y no se observó con ligandos de RAR específica, 13-CRA y ácido tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic (TTNPB), o con 4-hidroxi-phenretinamide (4-HPR) (Figura 1 C). También se examinó si 9-CRA y ATRA aumentaron el nivel de expresión de otras proteínas asociadas de unión celular. Se encontró que tanto el 9-CRA y ATRA no tenían ningún efecto significativo en el nivel de expresión de las proteínas de unión adherente E-cadherina y α- y ß-catenina, proteína sin embargo, el nivel de expresión de la unión estrecha asociada, ocludina, se ha mejorado en cierta medida, (Figura 1D). Además, 9-CRA y ATRA ni induce la expresión endógena de Cx32 en las células LNCaP parentales ni alteraron el nivel de expresión de mRNA Cx32 retrovirus transcrito en las células LNCaP-32 tal como se mide por análisis de RT-PCR semi-cuantitativa (datos no mostrados).
Cx32 que expresan las células LNCaP-32 fueron tratadas con el 9-CRA, ATRA, MB y otros retinoides como se indica. A. aumento dependiente de la dosis del nivel de expresión de Cx32 en 9-CRA y el tratamiento con ATRA durante 48 h. Tenga en cuenta que la mejora significativa se observa sólo a concentraciones por encima de 0,5 mM. B. Cinética de la mejora del nivel de expresión Cx32 tras el tratamiento con 9-CRA y ATRA (1 M) durante los tiempos indicados. Tenga en cuenta que la mejora se observa ya en 24 h. C. Sólo el 9-CRA y ATRA y MB aumentan el nivel de expresión Cx32. Tenga en cuenta que los retinoides RAR-específica, TTNPB (ácido tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic), y 13-CRA (ácido 13-cis-retinoico) y el otro retinoide no relacionado, 4-HPR, son ineficaces. Tenga en cuenta que MB (2,5 nM) es al menos 300-500 veces más potente que 9-CRA y ATRA en base equimolar. D. Efecto de 9-CRA y ATRA en adherentes y la unión de proteínas asociadas apretados. La expresión de las proteínas de unión adherente asociados E-cadherina y alfa y beta catenina, y el apretado nudo de la proteína asociada, ocludina, se analizó mediante análisis de transferencia Western de lisado celular total (5 mg). Tenga en cuenta que sólo la expresión de ocludina parece cambiar notablemente.
Los retinoides Mejorar Gap Asamblea y Junction ocasiones la comunicación
A continuación examinó el efecto de la 9-CRA y ATRA en el conjunto de Cx32 en gjs y de comunicación en ocasiones. Concomitante con un aumento en el nivel de expresión de Cx32, 9-CRA y ATRA aumentó montaje GJ según la evaluación immunocytochemically (Figura 2 A) y bioquímicamente mediante análisis de transferencia Western de total y Triton X (TX) extractos -100 insolubles en [16], [17], [35] preparado en diversos momentos después del tratamiento (Figura 2 B). Por otra parte, como se muestra en la Tabla 1, la mejora de montaje GJ fue acompañado por aumento paralelo en la comunicación de la unión, medida por la transferencia de la unión de tres marcadores fluorescentes permeable GJ, Lucifer Yellow (MW 443), Alexa 488 (MW 570) y Alexa 594 (MW 760). Por ejemplo, 9-CRA y ATRA aumentaron la transferencia de la unión de Alexa 594 (MW 760) 2-3 pliegues comparación con los controles (Tabla 1). Debido a que la E-cadherina se ha demostrado que facilita el montaje de CxS en gjs [32], [33], y la expresión Cx se ha demostrado que facilita el montaje de las uniones estrechas [29], se examinó también si 9-CRA y ATRA aumentaron el nivel de expresión de Cx32 y su montaje en GJS indirectamente facilitando el montaje de otras uniones de las células tal como se evaluó por el detergente insolubilidad de su constituyente y proteínas asociadas. Se encontró que tanto el 9-CRA y ATRA no tenían ningún efecto significativo en el nivel de expresión de unión adherente proteína E-cadherina, sin embargo, el conjunto de apretada la salida de proteínas, ocludina, pero no su proteína asociada ZO-1, parecía haber sido mejorada (Figura 2 B). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que 9-CRA y ATRA, como andrógenos, mejorar el nivel de expresión de Cx32, y su posterior montaje en GJS, sin alterar significativamente la expresión de E-cadherina, que se ha demostrado que modulan el montaje de GJS [32], [33], [36], [37]. Como se ha observado en nuestros estudios anteriores con los andrógenos, el montaje de Cx32 y ocludina en uniones celulares, o viceversa, parece estar regulada coordinadamente [17], [29], [38], [39].
A. células LNCaP-32, que se cultiva bien en seis grupos de pozos o placas de 10 cm, se trataron con 9-CRA y ATRA durante varios tiempos. Asamblea de Cx32 (verde) en gjs se evaluó immunocytochemically. E-cadherina se muestra en rojo. Tenga en cuenta que la formación GJ se ha mejorado con 9-CRA y el tratamiento con ATRA y MB. B. Montaje de Cx32 en GJS, de unión proteína asociada apretado, ocludina y ZO-1, y la proteína de unión adherens, E-cadherina, se evaluó bioquímicamente por el ensayo de insolubilidad TX100 como se describe en Materiales y Métodos. Tenga en cuenta también que tanto el nivel total y la fracción insoluble en detergente de Cx32 se incrementó significativamente. Tenga en cuenta también que el detergente solubilidad de las proteínas asociadas de unión adherente, E-cadherina, no se ve afectada de manera significativa mientras que la de la unión estrecha asociada a la proteína, ocludina, se ha mejorado marginalmente. En (A), los núcleos (azul) se tiñeron con DAPI.
Formación retinoides modulan regulada por andrógenos y la Degradación de Uniones Comunicantes
Nuestros estudios anteriores mostraron que Cx32 se degradó en el agotamiento de andrógenos por ERAD, y que los andrógenos mejorado la formación GJ por la re-enrutamiento de la piscina orientada ERAD de Cx32 a la superficie de la célula [17]. Impulsada por los datos mostrados en las Figuras 1 y 2, el próximo examinó el nivel de expresión de Cx32 y su destino de unión y no unión en el agotamiento de andrógenos en presencia y ausencia de 9-CRA y ATRA. Para estos estudios, las células se hicieron crecer en, medio de cultivo celular libre de rojo fenol andrógenos empobrecido (tratado con carbón vegetal). De acuerdo con estudios anteriores [17], se encontró que el agotamiento de andrógenos disminuyó el nivel de expresión Cx32, que fue impedido tras la adición de MB y DHT (Figura 3 A). Sin embargo, se encontró que la disminución en el nivel de expresión de Cx32 también fue impedido cuando el medio de andrógenos empobrecido se reponía con 9-CRA y ATRA (Figura 3 A). Además, el tratamiento combinado con MB y 9-CRA o ATRA no era ni sinérgico ni aditivo con respecto al nivel de expresión Cx32 (Figura 3 A). En apoyo de los datos anteriores, se evaluó la formación de GJS immunocytochemically (Figura 3 B), bioquímicamente mediante un ensayo de insolubilidad detergente (Figura 3 C), y funcionalmente midiendo la transferencia de la unión de Lucifer Yellow (MW 443 Da), Alexa 488 (MW 570 Da), y Alexa 594 (MW 760 Da) (Tabla 2). Como se muestra en la Figura 3B, el agotamiento de andrógenos redujo el número de GJS drásticamente a medida que Cx32 específica inmunotinción se observa raramente en las áreas de contacto célula-célula, mientras que GJS se detectaron fácilmente en las células cuando el medio de andrógenos empobrecido se complementó con 9-CRA y ATRA y con MB y DHT (Figura 3 B). En consonancia con los datos inmunocitoquímica, transferencia de la unión de Lucifer Yellow disminuyó significativamente en el agotamiento de andrógenos, lo que fue impedido en la reposición de medio de andrógenos empobrecido con MB, ATRA y 9-CRA (Tabla 2). El ensayo de detergente insolubilidad corrobora aún más la inmunocitoquímica y transferir datos de unión (Figura 3 C). Como se ha observado en nuestros estudios anteriores, el agotamiento de los andrógenos no tuvo efecto significativo sobre la solubilidad de detergente de E-cadherina y β-catenina y apretado unión proteína asociada, ZO-1 (Figura 3 C). Como control, el agotamiento o la adición de andrógenos, 9-CRA y ATRA a las células LNCaP-N resistentes a G418 parental LNCaP-P y ni montaje GJ inducida ni tuvo ningún efecto sobre la transferencia de la unión (datos no mostrados). En conjunto, estos datos sugieren que la 9-CRA y ATRA previenen la degradación regulada por andrógenos de Cx32 y mejorar la formación de GJ en las células LNCaP-32. Dado que el tratamiento combinado con los andrógenos y los retinoides no era ni sinérgico ni aditivo, los datos sugieren además que la formación GJ se ve reforzada por el rescate de la misma agrupación de Cx32 que se apunta para ERAD en el agotamiento de andrógenos.
LNCaP-32 células, cultivadas a 70% de confluencia, ya sea en seis grupos de pozos o placas de 10 cm, se cambiaron a, (Gaza) medio con carbón vegetal andrógeno-agotado. El nivel de expresión de Cx32 y la formación de GJS se analizaron mediante transferencia Western (A) y el análisis inmunocitoquímico (B) después de 48 h en presencia y ausencia de 9-CRA y ATRA (1 M) y MB (2,5 nM) y DHT (10 Nuevo Méjico). C. Formación de GJS también se analizó por análisis de Western blot del total, detergente soluble y fracciones -insoluble como se describe en Materiales y Métodos. Tenga en cuenta que Cx32 y gjs se degradan en medio de andrógenos empobrecido y la degradación se bloquea a la reposición con 9-CRA, ATRA, MB y DHT. Tenga en cuenta también que sólo el nivel de expresión de Cx32 y su solubilidad detergente cambió significativamente mientras que la de E-cadhiern (E-cad), β-catenina (β-cat) y ZO-1 no se vio afectada de manera significativa. En (B), los núcleos (verde) se tiñeron con DAPI. En A, se analizaron 10 g de proteína total.
Enhance Gap Junction Formación Independiente de la función del receptor de andrógenos
El tratamiento de células LNCaP con 9-CRA se ha demostrado
Los retinoides para mejorar el nivel de expresión de AR [30]. Para probar si 9-CRA y ATRA mayor expresión AR en medio normal y andrógenos empobrecido, que creció células LNCaP-32 en el control, con depleción de andrógenos, y andrógenos empobrecido más 9-CRA, ATRA y MB que contenía medio durante 48 h. Según la evaluación por análisis de transferencia Western, se encontró que el agotamiento de andrógenos reduce tanto el nivel de expresión de AR y Cx32, que fue impedido a la reposición con MB, DHT, 9-CRA y ATRA (Figura 4 A). Estos datos plantean la posibilidad de que el 9-CRA y ATRA mejorado conjunto de GJ de una manera dependiente de AR - y no de forma independiente. Para probar esta idea, se trataron las células LNCaP-32 con Casodex (bicalutamida), que bloquea los andrógenos de acción compitiendo con los andrógenos por la unión a la AR y la función [40] inhibir, [41], y examinamos el nivel de expresión de Cx32 y GJ formación tras el tratamiento con 9-CRA, ATRA y MB en presencia y ausencia de Casodex en medio normal y andrógenos empobrecido. De acuerdo con estudios anteriores, se encontró que el tratamiento con Casodex causó la degradación de AR (Figura 4 B), así como abolió el efecto de Mo y DHT en la expresión de Cx32 como se observó en nuestros estudios anteriores [17]. Sin embargo, la degradación de AR también se observó con Casodex en presencia de 9-CRA y ATRA tanto en medio de andrógenos agotado y normal. A pesar de la disminución de firmeza nivel de expresión de AR, se encontró que Casodex no tuvo efecto en 9-CRA- y mejora mediada por ATRA nivel de expresión de Cx32. En apoyo de esa disminución y aumento de la expresión Cx32 fue acompañada por cambios paralelos en la formación de GJ, se analizó la formación de GJS immunocytochemically en las células tratadas con Casodx en presencia y ausencia de MB, 9-CRA y ATRA. GJS no se formaron cuando las células fueron tratadas con Casodex en el suero normal o en medio de andrógenos empobrecido que contiene MB o DHT (Figura 5). Por otra parte, se encontró que eran abundantes GJS cuando las células fueron tratadas con Casodex junto con 9-CRA o ATRA (Figura 5). Estos datos sugieren que el mecanismo por el que 9-CRA y ATRA previenen la degradación de Cx32 y mejorar la formación de GJ en el agotamiento de andrógenos es independiente del nivel de expresión de AR y /o función, o ambos.
A. células LNCaP-32 fueron cultivadas a 70-80% de confluencia en placas de 6 cm. Las células se cambiaron a tratado con carbón vegetal, medio de andrógenos empobrecido (ST) que contiene 9-CRA y ATRA (1 M) y MB (2,5 nM) y DHT (10 nM) durante 24 h. Las células en medio que contiene andrógenos (NS) o medio de andrógenos empobrecido (ST) se utilizaron como controles. El nivel de expresión de Cx32 y AR se analizó por transferencia Western. Tenga en cuenta que el nivel de expresión de ambos Cx32 y AR disminuye en el agotamiento de andrógenos y la disminución se bloquea tras el tratamiento con 9-CRA, ATRA, MB y DHT. B. LNCaP-32 células, sembradas como anteriormente, se trataron con de 9-CRA y ATRA (1 M) y MB (2,5 nM) y DHT (10 nM) en presencia y ausencia de Casodex (10 mM) en condiciones normales y andrógenos empobrecido medio. El nivel de expresión de Cx32 y AR fue examinado después de Western Blot. Tenga en cuenta que en Casodex que contiene medio, el nivel de expresión Cx32 no disminuye en presencia de 9-CRA y ATRA (1 M) en un medio con carbón vegetal a pesar del bajo nivel de expresión de AR. Esto no se observa con MB y DHT.
células LNCaP-32, sembradas en seis grupos de pozos que contienen cubreobjetos de vidrio, se dejaron crecer a 70% de confluencia. Las células fueron cultivadas durante 24 h adicionales en un medio normal (NS), en con carbón vegetal, medio de andrógenos empobrecido solo (ST), en el suero normal que contiene Casodex (NS + CDX), y en medio de andrógenos empobrecido suplementado con MB ( ST + MB), con MB y Casodex (ST + MB + CDX), con 9-CRA (ST + CRA), 9-CRA y CDX (ST + CRA + CDX), con ATRA (ST + ATRA), y con ATRA y CDX (ST + ATRA + CDX). La degradación y la localización subcelular de Cx32 se analizaron immunocytochemically como se describe en Materiales y Métodos. Tenga en cuenta que GJS (verde) no se degrada en las células tratadas con 9-CRA y ATRA, tanto en presencia como en ausencia de Casodex mientras que se degradan en suero normal y andrógenos agota pero MB complementado medio que contiene Casodex.
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