Extracto
Nuevas estrategias son necesarias para mejorar la respuesta a la quimioterapia en el cáncer de endometrio avanzado y recurrente. Aquí, demostramos que terpenoides presentes en el vapor destiló Extracto de jengibre (SDGE) son potentes inhibidores de la proliferación de células de cáncer de endometrio. SDGE, aislado de seis diferentes lotes de rizomas de jengibre, consistente inhibió la proliferación de las líneas celulares de cáncer de endometrio Ishikawa y ECC-1 en IC
50 de 1,25 g /ml. SDGE también aumentó el efecto antiproliferativo de la radiación y cisplatino. Disminución de la proliferación de células de Ishikawa y ECC-1 fue un resultado directo de la apoptosis inducida por SDGE como se demuestra por FITC-anexina V tinción y la expresión de la caspasa escindido análisis 3. GC /MS identificó un total de 22 compuestos terpenoides diferentes en SDGE, con el isómeros neral y que constituye geranial 30-40%. Citral, una mezcla de neral y geranial inhibe la proliferación de Ishikawa y células ECC-1 a una IC
50 10 M (2,3 mg /ml). compuestos fenólicos tales como gingerol y shogaol no se detectaron en SDGE y 6-gingerol fue un inhibidor más débil de la proliferación de las células de cáncer de endometrio. SDGE fue más eficaz en la inducción de muerte celular de cáncer de citral, lo que sugiere que otros terpenos presentes en SDGE también estaban contribuyendo a la muerte de células de cáncer de endometrio. tratamiento SDGE resultó en un aumento rápido y fuerte en el calcio intracelular y una disminución del 20-40% en el potencial de membrana mitocondrial. Ser-15 de p53 se fosforiló después del tratamiento 15 min de las células de cáncer con SDGE. Este aumento de la p53 se asoció con la disminución de 90% en Bcl2 mientras que se observó ningún efecto sobre Bax. Inhibidor de p53, pifithrin-α, atenuados los efectos anticancerígenos de SDG & apoptosis y tampoco se observó en el p53
neg Skov-3 células. Nuestros estudios demuestran que los terpenoides de SDG & median la apoptosis mediante la activación de p53 y por lo tanto deben ser investigados como agentes para el tratamiento del cáncer de endometrio
Visto:. Liu Y, Whelan RJ, Pattnaik BR, Ludwig K, E Subudhi, Rowland H, et al. (2012) Los terpenoides de
Zingiber officinale gratis (jengibre) inducir la apoptosis en células de cáncer endometrial a través de la activación de p53. PLoS ONE 7 (12): e53178. doi: 10.1371 /journal.pone.0053178
Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital de & amp; Centro de Investigación, Arabia Saudita
Recibido: 10 Agosto, 2012; Aceptado: November 26, 2012; Publicado: 31 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los fondos para esta investigación fue proporcionado por las subvenciones del Departamento de Obstetricia y Ginecología de AK y MSP, una donación de caridad de Jean McKenzie y becas de investigación de la Alianza contra el cáncer de Wisconsin de ovario a MSP y la Rebecca Meyer Marrón Cátedra del Instituto de investigación de la Universidad de Wisconsin-ojo (retina Fundación de Investigación) de BRP. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En el año 2011, aproximadamente 8.010 mujeres murieron por cáncer de endometrio y de casi 47.130 pacientes se diagnosticó nuevamente con este tipo de cáncer [1]. En aproximadamente el 70% de las mujeres con un diagnóstico de cáncer de endometrio, la enfermedad se encuentra localizado en el cuerpo uterino y de supervivencia a cinco años es tan alta como 85% [2]. pacientes con cáncer endometrial avanzado y recurrente, matriculados en varios ensayos del Grupo de Oncología Ginecológica (GOG) para los agentes que incluyen platino, taxanos y antraciclinas, rara vez tienen respuestas completas a la terapia [3] - [9]. regímenes de combinación muestran mayores tasas de respuesta, pero el período libre de progresión con estas terapias es relativamente baja (5-7 meses) con una mayor morbilidad y la continua falta de curación [10]. Estas estadísticas ponen de relieve la necesidad de que el desarrollo de nuevos y quimiopreventivo eficaz y agentes quimioterapéuticos para el cáncer de endometrio.
De origen natural componentes de la dieta proporcionan una importante fuente de compuestos bioactivos que pueden servir tanto quimiopreventivo, así como agentes quimioterapéuticos contra el endometrio y otros tipos de cáncer [11]. Nuestro laboratorio está investigando las propiedades anticancerígenas de compuestos presentes en los rizomas de jengibre (
Zingiber officinale
). Estos estudios son apoyados por investigaciones previas que demuestran que el jengibre en polvo seco o solventes de extracción de raíces de jengibre induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en la piel, mama, próstata, colon y células de cáncer ovárico [12] - [17]. La aplicación tópica del extracto etanólico de jengibre disminuyó la incidencia, el tamaño y el número de tumores inducidos por DMBA /TPA en ratones SENCAR [18].
La mayoría de los estudios anteriores han concluido que los componentes bioactivos de la polvo seco y el extracto disolvente de rizomas de jengibre responsable de las actividades contra el cáncer son los compuestos fenólicos de 4, 6, 8 y 10- gingeroles, paradol, y shogaol, un producto formado después del secado o calentamiento de las raíces [19] , [20]. Estos compuestos fenólicos, y en especial los gingeroles exhiben anti-proliferativa y anti-angiogénicos como se demuestra por
in vitro
y
in vivo
estudios realizados en varios modelos de cáncer [13], [14], [16], [21] - [25]. células de cáncer colorrectal humano cuando se trató con 6-gingerol, inhibieron la proliferación celular mediante la inducción de la detención del ciclo celular G1 y la apoptosis [26]. Gingerols presentan estos efectos contra el cáncer a través de múltiples mecanismos, que incluyen la degradación de proteínas, así como β-catenina, PKC delta, y GSK3 beta vías [26]. Estudios en el modelo de cáncer de ovario se ha demostrado que 6-shogaol inhibe la secreción de VEGF por las células del cáncer [16]. 6-gingerol induce la apoptosis en la línea celular de cáncer de próstata LnCaP mediante el aumento de la expresión de p53 y Bax y al mismo tiempo la disminución de la expresión de Bcl-2 [16], [17], [21].
Además de el jengibre en polvo y el disolvente de extracción, compuestos bioactivos también se pueden aislar mediante destilación al vapor de esta rizomas [27], [28]. A lo mejor de nuestro conocimiento, se han realizado estudios limitados para demostrar las propiedades anticancerígenas de los extractos destilados de vapor de jengibre. El análisis químico del extracto de vapor destilado de jengibre indica que los compuestos fenólicos bioactivos identificados anteriormente están presentes en muy baja concentración en los extractos destilados de vapor de jengibre [27]. En el presente estudio hemos demostrado que los extractos de vapor destilada de jengibre son potentes mediadores de la apoptosis en células de cáncer de endometrio. Nuestros estudios sugieren que uno de los principales componentes bioactivos del extracto de vapor destilado de jengibre es citral (una mezcla de dos isómeros terpenoides, neral y geranial). Se demuestra que el tratamiento de las células de cáncer de endometrio con el extracto destilado al vapor de los resultados de jengibre en aumento significativo en el calcio intracelular, disminución en el potencial de membrana mitocondrial, aumento en la expresión de la caspasa 3, la fosforilación de p53, y una disminución significativa en la expresión de Bcl-2. Las observaciones señaladas en nuestros estudios demuestran que el extracto destilado al vapor de jengibre y sus componentes bioactivos tienen el potencial de ser desarrollado como quimiopreventivos y quimioterapéuticos agentes para el cáncer de endometrio.
Materiales y Métodos
Reactivos y Líneas celulares
Pifithrin-α fue adquirido de Sigma Ciencias de la vida. DMEM (modificación de de Medio Eagle de Dulbecco), RPMI-1640, Hanks solución salina equilibrada (HBSS), y solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) eran de Cellgro (Manassas, VA). DiOC6, ionomicina e indo-1 AM se adquirieron de Life Technologies (Grand Island, NY). SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato tampón RIPA y de cóctel inhibidor de la proteasa eran de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). anticuerpo primario de conejo caspasa-3, anticuerpo de conejo Bcl-2, Bax anticuerpo de conejo, fosfo-P53 anticuerpo de ratón y anticuerpo de ratón β-actina se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). AffiniPure de cabra anti-conejo anticuerpo IgG conjugado con peroxidasa y el anticuerpo AffiniPure de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa fueron de Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA). kit FITC-anexina V de detección de apoptosis fue adquirido de BD Pharmingen (San Diego, CA). ECC-1 [29], [30] e Ishikawa [31] Las células fueron un regalo de los Dres. Elaine y David Alarid oliva (Madison, WI), respectivamente. células SKOV-3 se adquirieron de ATCC (Manasas, VA).
Cell Cultura
Ishikawa células se cultivaron en DMEM y ECC-1 y SKOV-3 células fueron cultivadas en medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina /estreptomicina los antibióticos en un 5% de CO
2 incubadora.
destilación al vapor de jengibre rizomas
rizomas del jengibre se obtuvieron de proveedores locales , se limpian con agua destilada y se corta en trozos de 0,5 cm. Aproximadamente 250-300 g de las piezas de jengibre cortados fueron transferidos a los 1000 ml en matraz de fondo redondo del aparato de destilación al vapor Clevenger. Las raíces de jengibre se sumergieron en 500 ml de agua desionizada (18 MOhm-cm) y la destilación de vapor se llevó a cabo durante 4-6 horas calentando el matraz. La separación de aceite en el aparato de Clevenger era más ligero que el agua y se separó por drenaje periódicamente el líquido se acumula en el tubo de separación de la unidad. El aceite se dividió en alícuotas inmediatamente en tubos de microcentrífuga y se congeló hasta su utilización en ensayos. La densidad del aceite se calculó que era 0,87 g /ml y esta medición se utilizó para calcular la concentración del extracto utilizado para llevar a cabo los ensayos biológicos.
celulares Ensayos de proliferación
Efecto de vapor extractos destilados jengibre, citral, y 6-gingerol sobre la proliferación de las líneas celulares de cáncer se determinó por el 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT) método de captación de [32 ], [33]. Brevemente, las células cancerosas se sembraron en placa de 96 pocillos a una densidad de 5000 células /pocillo en su respectivo medio. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de extracto de jengibre (0,025 g, 0,25 g, 2,5 g, 6,25 g y 12,50 g /ml) y se incubaron a 37 ° C en un CO 5%
2 ambiente durante 24 h, 48 hy 72 h. Después de que el período de tiempo designado, se añadió 20 l de 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) bromuro de tetrazolio -2,5-difenil a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 ° C durante 3 h adicionales. Los cristales de formazán formados en los pocillos se disolvieron en 100 l de DMSO. La absorbancia se midió a 570 nm usando un Spectra MAX 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
El tratamiento combinado de las células cancerosas con SDGE y radiación o quimioterapia
Se llevaron a cabo ensayos de MTT para determinar si SDGE aumentó el efecto anti-proliferación de la radiación o la quimioterapia en las células de cáncer de endometrio. Ishikawa células o ECC-1 se sembraron en placas de 96 pocillos múltiples (5 × 10
3 células /pocillo) en el día 1 del experimento. Después de permitir que se añadieron las células a estabilizarse, medios de comunicación o SDGE a los pocillos que contienen las células de cáncer de endometrio en el Día 2. Las células en algunos de los pozos fueron también tratados con cisplatino (5 M), mientras que otros se irradiaron con una dosis única de 4 Gy el uso de un radiador de cesio-137. Después de estos tratamientos, las células se cultivaron durante 72 horas a 37 ° C en 5% de CO
2 medio ambiente. Efecto del tratamiento sobre la proliferación de las células de cáncer de endometrio se determinó mediante la realización de los ensayos de MTT como se describe anteriormente.
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de SDGE
separación e identificación de los compuestos en las muestras de SDGE utilizado un cromatógrafo de gases Shimadzu GC-17A equipado con un analizador de masas cuadrupolar QP-5000 (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD). Antes del análisis, 20 l de SDGE recién descongelado se disolvió en 1000 l de pentano. 1 l de este extracto disuelto se inyectó manualmente en el cromatógrafo de gas utilizando una relación de división 1:50 de entrada y helio como gas portador a un caudal de 1,4 ml /min. El cromatógrafo de gas contenía una columna no polar RTX-5MS (30 m de longitud, 0,25 mm ID, 0,25 micras de espesor de película;. Restek, Bellefonte, PA) Temperatura de la columna fue inicialmente 70 ° C seguido por una rampa en 4 ° C /min a 180 DO. detección de ionización de electrones estaba en exploración completa, modo de iones positivos a través de una relación masa-carga (m /z) rango de 41 a 300. Los compuestos fueron identificados tentativamente mediante la búsqueda en una biblioteca NIST y por comparación de los índices de retención de aritmética a los valores reportados por Adams [34].
Medición de la apoptosis por citometría de flujo
la apoptosis se midió usando el kit de FITC-anexina V Detección de apoptosis (BD Pharmingen, San Diego, CA). Brevemente, 2 × 10
6 células se trataron con 0,25 g /ml de extracto de jengibre con o sin 100 mM Pifithrin-α. Después de incubación a 37 ° C durante 0-16 h, las células se lavaron dos veces con PBS frío y se resuspendieron en tampón de unión 1 x (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM
2) a una concentración de 1 x 10
6 células /ml. A continuación, 1 × 10
5 células en 100 l de tampón de unión, se transfirieron a tubos de 5 ml y se tiñeron con 5 l de FITC-anexina V y 5 l de yoduro de propidio (PI). Las células se agitaron suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Después de lavar las células con tampón de unión 1 x para eliminar el exceso de FITC-anexina V y PI, las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur. Los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo.
ensayo del ciclo celular.
Las células de cáncer de endometrio fueron tratados con SDGE (250 ng /ml o 2,5 mg /ml) durante 24, 48 y 72 marido. Después del tratamiento, las células se recogieron, se lavaron con PBS y se fijaron en 75% de etanol, se lavó con PBS, y se tiñeron con yoduro de propidio. El flujo entonces citometría se realizó para analizar las muestras tanto de estatuto de la apoptosis y el ciclo celular como se describió anteriormente [35].
Análisis de Western Blot
Después de tratamiento de las células con el vapor de agua destilada extractos de jengibre , las células cancerosas se lavaron con fosfato enfriada con hielo de solución salina tamponada (PBS) y se lisaron con tampón RIPA (Pierce, Rockford, IL) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa (Thermo Scientific, Rockford, IL). La cantidad total de proteína en el lisado se determinó usando el ensayo BCA (Pierce). Los lisados celulares se cargaron en 25 g /pocillo en un gel de poliacrilamida resolver 7,5 o 12% y se separaron por electroforesis, después de lo cual, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% de leche en Tris solución salina tamponada y se sondearon con los anticuerpos primarios apropiados. Peroxidasa de rábano conjugada secundaria de anticuerpos y SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato (Thermo Scientific, Rockford, IL) fueron utilizados para la detección de las proteínas en las transferencias. Las películas fueron escaneados utilizando FluorChem 890 y el software Image J se utilizó para cuantificar las intensidades de las bandas.
mitocondrial potencial de membrana Ensayo
Las células de cáncer de endometrio se cultivaron en matraces de cultivo de tejido T25. Células en crecimiento exponencial se trataron con 0,025 g /ml o 0,25 mg /ml de extracto de jengibre durante 24 hrs. Después, las células se lavaron y se recogieron. 1 × 10
se añadieron 6 células a cada tubo de flujo sin tratar, 0,025 g /ml y las células tratadas /ml de extracto de jengibre 0,25 g. Las células fueron tratadas con 40 nM DiOC6 a 37 ° C durante 30 min. Después, las células se lavaron, se resuspendieron en 400 l de PBS que contenía 2% de FBS y se analizaron mediante FACSCalibur citómetro de flujo para evaluar la membrana mitocondrial se analizaron los datos utilizando el software FlowJo potential.The.
Mediciones del flujo de calcio
los Ishikawa células en la fase logarítmica de crecimiento se recogieron usando tripsina. Las células (1,2 × 10
7) se lavaron tres veces y se suspendieron en 1 ml de 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) que contiene solución salina tamponada de Hanks que no contiene ningún cationes divalentes. Las células se cargaron con Indo 1-AM (2 M) en presencia de probenecid 4 mM durante 30 minutos a 37 ° C en 5% de CO
2 medio ambiente. Después, las células se lavaron y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía 0,5% de BSA y CaCl 1 mM
2 a una concentración final de 2 x 10
6 células /ml. Las células se filtraron a través de un filtro de membrana de 35 micras antes de la citometría de flujo en LSR-II citómetro. Las células se analizaron inicialmente para 3 min para determinar la concentración intracelular de calcio basal. SDGE (0,025, 0,25, o 2,5 g /ml) o ionomicina (1 M usado como control positivo) se añadieron posteriormente a las células y el cambio en la fluorescencia de Indo-1 se determinó mediante la transmisión de manera continua de las células a través del citómetro de flujo para aproximadamente 7 minutos. Los datos obtenidos fueron analizados mediante el software FlowJo.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prizm. El umbral para la significación estadística es una probabilidad de 0,05. Los datos fueron analizados usando la prueba t para datos independientes.
Resultados
Aislamiento de vapor destiló extractos de raíces de jengibre
Los aceites esenciales pueden ser convenientemente aislados de raíces de jengibre por destilación al vapor de un aparato de Clevenger modificado. Hemos sido capaces de aislar aproximadamente 300 mg de aceites esenciales a partir de 250 g de raíces de jengibre obtenidos de proveedores comerciales locales. Un total de cinco lotes de rizomas de jengibre, cada uno obtenido de una fuente comercial separada, se utilizaron para aislar los aceites esenciales por destilación de vapor. Dos de estos cinco lotes de jengibre se obtuvieron de proveedores locales en Bhubaneshwar, India y la destilación al vapor también se llevó a cabo en el lugar. Los tres lotes restantes de jengibre se obtuvieron de vendedores en Wisconsin y destilación con vapor de jengibre se llevó a cabo en el en laboratorio en la Universidad de Wisconsin. El rendimiento del aceite esencial fue comparable entre todos los lotes de raíces de jengibre utilizados en este estudio y la densidad de SDG & se determinó que era de aproximadamente 0,87 g /L.
El vapor destiló el extracto de jengibre es un potente inhibidor de cáncer endometrial la proliferación de células
los aceites esenciales de jengibre se probaron por su efecto sobre la proliferación de dos cáncer de endometrio (ECC-1 y Ishikawa) líneas celulares. Ambas líneas celulares de cáncer de endometrio fueron sensibles a SDGE en concentración tan baja como 250 ng /ml (Fig 1A y B.), La proliferación celular se inhibió significativamente (P & lt; 0,05) a 2,5 mg de concentración /ml. Los datos de proliferación celular de las dos líneas celulares se muestran en la Fig. 1A y B representan los datos acumulativos obtenidos de los experimentos llevados a cabo con SDG & aislado de tres diferentes lotes de rizomas de jengibre. Dieciséis repeticiones se utilizaron para cada condición de prueba para cada lote de SDGE. Por lo tanto, cada punto de datos en la Fig. 1 es una media de 48 lecturas separadas y muestra sólo pequeñas variaciones en las mediciones, lo que demuestra claramente los efectos altamente reproducibles de los lotes SDGE sobre la proliferación de células ECC-1 y de Ishikawa. El análisis de los datos de la ensayo de proliferación demostró que en el punto de tiempo 72 h, la IC
50 de SDGE para ambas líneas celulares era de aproximadamente 1,25 g /ml.
Efecto de SDGE sobre la proliferación celular se determinó por la realización de ensayos de MTT. La células de Ishikawa (A), y ECC-1 (B) se incubaron con las concentraciones de SDG & representados por 24, 48 y 72 h. densidad óptica a 570 nm se determinó para cuantificar el número de células vivas en los cultivos. De control (CON) pozos en todos los experimentos fueron tratadas con DMSO, el control del vehículo. se muestran los datos acumulados de SDG & aislado de tres diferentes lotes de rizomas de jengibre. Cada punto de datos en todas las figuras es media de 48 lecturas individuales. efecto anti-proliferativo producido por SDGE (2,5 g /ml) en Ishikawa (C y E) y ECC-1 (D y F) de las células fue comparable con el tratamiento de estas dos líneas celulares con la radiación (C y D) o cisplatino (E y F). Las células se trataron simultáneamente con SDGE y la radiación (4 Gy) o cisplatino (5 M). Se llevaron a cabo ensayos de MTT para determinar el efecto de estos tratamientos sobre la proliferación de las líneas celulares ECC-1 Ishikawa y. Cada barra en C-F representa una media de ocho repeticiones. * P & lt; 0,001,
#p & lt; 0,05, y
† p & gt;. 0.05 (no significativo) guía empresas
El tratamiento combinado con SDGE y Radiación o cisplatino Produce actividad anti-proliferativa efecto
cáncer de endometrio avanzado es tratada mediante el uso de la radiación y la quimioterapia. Por ello, investigó si el tratamiento combinado de las células de cáncer de endometrio con SDGE y radiación o cisplatino produjo un efecto anti-proliferativo en las células mejorada ECC-1 y de Ishikawa. Los resultados del ensayo MTT demostraron que el tratamiento SDGE disminuyó la proliferación de las dos líneas celulares en un 40% y esta disminución en la proliferación, en las células ECC-1, fue comparable a la observada en las células que fueron tratados con radiación sola (Fig. 1C y D). En el caso de las células de Ishikawa, la inhibición de la proliferación producida por SDGE fue aproximadamente 10% mayor que la observada con la radiación sola (Fig. 1C). Por último, en el caso de ambas células ECC-1 e Ishikawa, el tratamiento combinado con SDGE y la radiación mejorada efecto inhibidor sobre la proliferación de 23-25% en comparación con las células que fueron tratados solamente con la radiación (Fig. 1C y D) .
a continuación también probó el efecto combinado de SDG & y cisplatino en Ishikawa y las células ECC-1. ensayos de MTT llevaron a cabo después de 72 h de tratamiento demostró que el tratamiento combinado con SDGE y cisplatino disminuyó la proliferación de las células de Ishikawa por un 26% adicional en comparación con el cisplatino único tratamiento (Fig. 1E). Por el contrario, no se observó una mejora adicional en la inhibición de la proliferación cuando las células ECC-1 fueron tratados con una combinación de SDG & y cisplatino (Fig. 1F).
Estos experimentos también nos permitió realizar un pariente comparación de los efectos citotóxicos de SDGE con los de cisplatino. Cuando se utiliza como agente único, el cisplatino (5 M; 1,5 mg /ml) disminuyó la proliferación de Ishikawa y células ECC-1 por 59% y 61%, respectivamente, en comparación con el control (Fig 1E y F.). Cuando se utilizó SDGE (2,5 g /ml) como agente único, la inhibición de la proliferación de Ishikawa y células ECC-1 era 37% y 42%, respectivamente, en comparación con los controles (Fig. 1E y F). Estos resultados sugieren que al igual que el cisplatino, SDGE también era muy potente en la inhibición de la proliferación celular del cáncer endometrial, proporcionando una fuerte justificación para el estudio adicional del mecanismo por el cual este extracto botánico estaba produciendo sus efectos contra el cáncer.
La inhibición de la la proliferación de células del cáncer endometrial a través de la apoptosis
los ensayos de MTT indicó que la SDGE era un potente inhibidor de la proliferación de las líneas celulares de cáncer de endometrio. La disminución de la proliferación de las líneas celulares de cáncer de endometrio era un resultado directo de la apoptosis inducida en las células después del tratamiento SDGE. SDGE a concentraciones tan bajas como 250 ng /ml provocó un aumento de la superficie de unión de FITC-anexina V y yoduro de propidio tinción como se determina por citometría de flujo (Fig. 2A). Aumento de las células FITC-anexina V positivas se observó tan pronto como 30 minutos después de SDG & se añadió a los cultivos celulares (Fig. 2A). El análisis de transferencia Western confirmó la expresión aumentada de la caspasa 3 en el ECC-1 (datos no presentados) y las células de Ishikawa que fueron tratados durante 24, 48, y 72 h con 250 ml de concentración /ng de SDGE (Fig. 2B). Siguiente hemos probado si SDGE también se induce la detención del ciclo celular en las células de cáncer de endometrio. Por lo tanto, las células de Ishikawa se trataron con 250 ng /ml o 2,5 mg /ml de SDGE para 24, 48, y 72 h. Las células se marcaron con yoduro de propidio y el estado del ciclo celular se monitorizó mediante citometría de flujo (Fig. 2C). Este análisis indicó que SDGE no indujo ningún efecto importante sobre el estado del ciclo celular de las células. Sólo se observó disminución marginal en el porcentaje de células en la fase S del ciclo celular. Sin embargo, no se observó esta disminución sólo cuando las células de Ishikawa se trataron con 2,5 mg /ml. El tratamiento de las células con 250 ng /ml no indujo ningún cambio en el estado del ciclo celular a pesar de que esta concentración de SDGE apoptosis inducida en las células cancerosas.
Células
Ishikawa se trataron con 250 ng /ml de SDGE para 30 min, 2 h, 4 h, y 16 h. Después de la incubación con SDGE, la supervivencia celular se determinó mediante el etiquetado de las células con FITC conjugado con FITC-anexina V y yoduro de propidio (A). Las células se analizaron por citometría de flujo y la muerte celular y la apoptosis se identificaron como los sucesos que eran solas positivo para FITC-anexina V (cuadrante inferior derecho) o doble positiva tanto para FITC-anexina V y yoduro de proidium (cuadrante superior derecho). la muerte celular apoptótica SDGE inducida en las células de cáncer de endometrio se confirmó mediante la detección de la caspasa 3 escindida en el análisis de Western blot (B). Se observó un aumento de la caspasa 3 niveles escindido cuando las células de Ishikawa se trataron con SDGE (250 ng /ml) durante 0, 24, 48, y 72 h. Los datos de A y B es representativa de los resultados obtenidos en tres experimentos separados,
Composición química de SDG &
Nos Los potentes efectos anticancerígenos de SDG & llevó a investigar los posibles componentes bioactivos de jengibre que probable inducir la apoptosis en las líneas celulares de cáncer de endometrio. SDGE aislado de fueron analizados por GC-MS tres lotes separados de raíces de jengibre. El extracto de jengibre se diluyó en pentano y los componentes volátiles se separaron a través de una columna no polar RTX-5MS (Fig. 3). Los picos individuales se eluyen de la columna se analizaron por ionización electrónica espectrometría de masas. Un análisis de los índices de retención y espectros de masa nos permitió identificar un total de 22 compuestos en la SDGE (Tabla 1). El porcentaje relativo de cada uno de los componente identificado también se determinó en este análisis. Los datos indicaron que SDG & aislado de diferentes lotes de rizomas de jengibre fue comparable en sus constituyentes químicos
.
tres preparaciones separadas de SDGE, dos de los EE.UU. (denominado Wisconsin 1 y 2) y uno de la India se separaron en una columna de cromatografía de gas no polar. Los compuestos que separan en esta columna fueron identificados por espectrometría de masas. Los compuestos identificados a través de este análisis, junto con sus abundancias relativas se muestran en la Tabla 1.
El análisis por GC-MS también nos llevó a la conclusión de que SDG & no contiene cantidades significativas de los compuestos fenólicos, gingerol, shogaol, y Paradol que han sido previamente identificados como los agentes anti-cáncer presentes en el jengibre en polvo y los solventes de extracción de los rizomas de jengibre [20], [24], [25], [36]. Esta técnica ha sido apoyada por nuestra observación de que el 6-gingerol no inhibe la proliferación de células de Ishikawa y ECC-1, incluso cuando se ensayó a concentraciones tan altas como 150 M (Fig. 4A y B).
ensayos de MTT fueron llevado a cabo para determinar el efecto de 6-gingerol (a y B) y citral (C y D) sobre la proliferación de Ishikawa y células ECC-1. Cada punto de datos es una media de 16 lecturas individuales. Sobre la base de estos datos, el IC
50 de citral se calculó que era de 15-25 M.
Los terpenoides eran los principales componentes de SDG & identificado en el análisis GC-MS. Neral y geranial son isómeros que se conocen colectivamente como el citral. Estos dos compuestos constituían aproximadamente el 35-45% de los componentes químicos totales identificados en nuestro análisis (Tabla 1). En los
in vitro
ensayos se observó que el tratamiento con citral resultó en una disminución significativa en la proliferación de Ishikawa y células ECC-1. El IC 50
para citral para ambas líneas celulares fue de entre 15 a 25 mM (Fig. 4C y D). Este IC
50 concentración de citral corresponde a 2.28 a 3.8 g /ml. En comparación, el SDGE fue eficaz en un IC
50 de 1,25 g /ml. Puesto que sólo 35 a 45% de la SDGE se compone de neral más geranial, la IC
50 concentración de SDGE corresponde solamente a una concentración de 2.8 a 3.7 M de citral. Este nivel de citral es significativamente menor que la IC
50 concentración calculada para este agente en nuestros ensayos de proliferación in vitro (Fig. 4C, D). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que además de citral, hay otros componentes bioactivos que contribuyen significativamente a los efectos contra el cáncer de SDGE. Por lo tanto, hemos llevado a cabo los estudios sobre los mecanismos que figuran a continuación utilizando SDGE en lugar de citral como el agente bioactivo.
SDG & induce flujo de calcio y deteriora membrana mitocondrial potencial
El tratamiento de células con SDG & Ishkawa dio lugar a una significativa afluencia de calcio intracelular (Fig. 5A). El aumento en el calcio intracelular se observó aproximadamente 3 min después de la adición de SDGE. La cinética de tiempo y el perfil general del flujo de calcio fueron similares a la observada en las células tratadas con ionomicina. La amplitud de la respuesta de flujo de calcio dependía de la concentración de SDGE. En la mayor concentración de prueba SDGE, el flujo máximo de calcio observado fue de aproximadamente el 60-70% de la respuesta observada con ionomicina (1 m). Ionomicina indujo un aumento repentino en los niveles intracelulares de calcio que luego disminuyó dentro de un minuto, pero para todas las concentraciones de SDGE probado la subida y la posterior disminución de calcio intracelular fue relativamente lenta (Fig. 5A). El flujo de calcio disminuyó 5-6 minutos después de la adición de SDG & pero no alcanzó los niveles previos al tratamiento (Fig. 5A).
Efecto de SDGE en el flujo de calcio intracelular se determinó mediante el tratamiento de Indo-1 cargado células Ishikawa (A) . Inmediatamente después de la adición de SDGE a las suspensiones de células, las células de Ishikawa se hicieron fluir a través del citómetro y aumento de la fluorescencia se midió para detectar el flujo de calcio. Disminución del potencial de membrana mitocondrial se detectó mediante la carga de las células de Ishikawa con DiOC6 (B). SDGE o vehículo de control se añadió a las células. Después de 24 h de tratamiento, se recogieron las células y se incubaron con DiOC6 para 15 min. La fluorescencia se midió para determinar los cambios en el potencial de membrana mitocondrial.
El aumento en el calcio y la inducción de apoptosis en el SDGE tratada ECC-1 y las células de Ishikawa sugiere un déficit en la función mitocondrial. Medición del potencial de membrana mitocondrial indica una disminución de 2 veces en las células Ishikawa que fueron tratados durante 24 h con 25 ng /ml o 250 ng /ml de SDGE (Fig. 5B).
Tratamiento SDGE Resultados en un aumento en el Bax /Bcl-2 Ratio
Bcl-2 es una proteína anti-apoptótica que se asocia con la membrana mitocondrial. Las disminuciones en el potencial de membrana mitocondrial nos llevó a determinar el efecto de SDGE (250 ng /ml) en Bcl-2 expresión. Tanto en el ECC-1 (datos no presentados) y las células de Ishikawa (Fig. 6), disminución de Bcl-2 expresión se observó después del tratamiento 24, 48, y 72 h con SDGE.