Extracto
Los datos recientes proporcionan evidencia de un papel importante de los trombocitos en linfagiogénesis dentro enfermedad maligna humana. El objetivo de este estudio fue investigar el papel de las plaquetas en la LI en el cáncer de esófago humano. Perioperatorias recuentos de plaquetas de la sangre periférica (PBPC) se evaluaron retrospectivamente en 320 pacientes con cáncer de esófago, que comprende 184 adenocarcinomas (AC), y 136 carcinomas de células escamosas (SCC). Los datos sobre la LI evaluados por inmunotinción anti-podoplanin estaban disponibles a partir de estudios anteriores, las plaquetas en el tejido tumoral se evaluaron mediante inmunotinción CD61. Para
in vitro
estudios, se aislaron células endoteliales linfáticas humanas (LEC) y co-cultivadas con las plaquetas de la sangre periférica. racimos trombocitopénica del estroma (STC) fueron evidentes en 82 muestras (25,6%), y las agrupaciones vasculares trombocitopénica (VTC) en 56 (17,5%). STC y VTC se asociaron con una PBPC significativamente mayor en la investigación de todos los casos. La presencia de STC se asoció con una mayor densidad de los microvasos linfático (p & lt; 0,001), PBPC y STC se asociaron con invasión linfovascular de células tumorales en un modelo de regresión. La presencia de cláusulas y condiciones se asoció con menor DFS de todos los pacientes (p = 0,036, prueba de Breslow), y VTC con DFS más cortos en en SCC (p = 0,025, prueba de Breslow). En cultivo celular, la proliferación LEC se ve reforzada por el co-cultivo con las plaquetas humanas en una dosis y tiempo dependiente mediada por la liberación de PDGF-BB y VEGF-C. Las plaquetas desempeñan un papel importante en la linfangiogénesis y la invasión linfovascular en el cáncer de esófago, que influyen en el pronóstico. Por lo que la interrupción de las vías entre las plaquetas, células tumorales y el endotelio linfático de señalización puede ser de beneficio para los pacientes
Visto:. Schoppmann SF, Alidzanovic L, Schultheis A, T Perkmann, Brostjan C, Birner P (2013) Los trombocitos correlacionar con Linfangiogénesis en el cáncer de esófago humano y mediar crecimiento de las células endoteliales linfático
in vitro
. PLoS ONE 8 (6): e66941. doi: 10.1371 /journal.pone.0066941
Editor: Claudia Daniela Andl, Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 8, 2013; Aceptado: 13-may de 2013; Publicado: 26 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Schoppmann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adenocarcinoma esofágico (AC) de la unión gastroesofágica son. se cree que está inducida principalmente por reflujo gastroesofágico, mientras que los carcinomas de células escamosas (SCC) se atribuyen principalmente al consumo de alcohol y el tabaco [1], [2]. En las últimas décadas, la incidencia de AC ha elevado dramáticamente en los países occidentales [3]. A pesar de las estrategias terapéuticas multimodales, resultado global para los pacientes con cáncer gastroesofágico sigue siendo pobre. Por lo tanto se necesitan urgentemente nuevos conceptos terapéuticos, y acerca de la fisiopatología de la enfermedad son un requisito previo para su desarrollo. Al igual que muchos otros carcinomas, los cánceres de esófago propagan principalmente a través del sistema linfático, y la invasión linfovascular de las células tumorales se asocia con una disminución pronóstico de los pacientes [4].
Hoy existe evidencia sorprendente que los tumores pueden establecer no sólo su propia sangre los buques de suministro, pero también puede inducir la formación de nuevos vasos linfáticos (linfangiogénesis) y migrar de forma activa en esta vasos recién formados para promover su difusión [5].
Así que la posible inhibición de este proceso podría ser de beneficio para los pacientes, especialmente en lo que los datos recientes sugieren que el proceso de la LI y la invasión de vasos linfáticos (LVI) no sólo se limita a los tumores primarios, pero también es evidente en las metástasis de ganglios linfáticos, lo que resulta en una mayor propagación de las células tumorales [6].
La formación de vasos linfáticos asociados al tumor es un proceso complejo y actualmente se entiende sólo en parte. Durante la angiogénesis embrionaria, las plaquetas parecen jugar un papel clave en la separación de la sangre y vasos linfáticos [7]. Sin embargo, existe una creciente evidencia de que las plaquetas puedan interactuar con el sistema linfático humano también en la enfermedad maligna, y podrían facilitar la LI y la metástasis del tumor [8], [9].
El objetivo de este estudio fue investigar el papel de las plaquetas con respecto a la LI en el cáncer de esófago humano.
Materiales y Métodos
los pacientes
a todos los pacientes sometidos a resección quirúrgica de carcinomas de esófago o de la unión gastroesofágica entre 1992 y 2011 en el Departamento de Cirugía de la Universidad de Medicina de Viena, se incluyeron en este estudio si el tejido suficiente y recuento trombocitopénica preoperatorio estaban disponibles. Los tumores de todos los pacientes fueron reevaluados según la 7ª edición de la UICC de estadificación TNM.
Declaración de Ética se obtuvo
Revisión Institucional aprobación de la junta (Junta Institucional de la Universidad de Medicina de Viena, Austria Review, EK 1122/2009). Debido a la naturaleza retrospectiva de este estudio, utilizando sólo el tejido archivado, se requirió y obtuvo sin el consentimiento informado de los pacientes, tal como fue aprobado por el comité de revisión. Las muestras específicos utilizados en este estudio se han utilizado ya en las publicaciones anteriores [4], [10] - [15].
Análisis de sangre periférica recuento de plaquetas (PBPC)
PBPC de pacientes se determinó de forma rutinaria antes de la cirugía y también antes de iniciar la quimioterapia neoadyuvante, si se administra.
Análisis de PBPC se realiza de forma rutinaria en los analizadores hematológicos automatizados estándar en el Departamento de Medicina de Laboratorio de la Universidad de Medicina de Viena. Durante el período de observación 1992-2011 se aplicaron los siguientes analizadores hematológicos: hasta 1995 Coulter STKS (Coulter, Hialeah, FL), de 1995 a 2001 Sysmex NE-8000 (TOA Medical Electronics, Kobe, Japón), desde 2001 Sysmex XE- 2100 (Sysmex Corporation, Kobe, Japón).
Inmunoticción
La inmunohistoquímica (IHC) se realizó en muestras incluidas en parafina fijadas en formol al 4% tamponado, utilizando tres micras de espesor secciones histológicas.
los datos sobre los vasos linfáticos evaluados por el D2-40 anticuerpo anti-podoplanin monoclonal de ratón (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) estaban disponibles a partir de estudios anteriores [4], [15].
Para la detección de trombocitos inmunotinción se realizó usando un anticuerpo CD61 monoclonal anti (NCL-CD61-308, Leica Biosystems, Newcastle, Reino Unido) en una dilución de 1:1600. Se utilizó un immunostainer Ultra Benchmark (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) para inmunohistoquímica se realizó
El análisis de inmunotinción anti-podoplanin como se describe anteriormente [16]:.
En resumen, para la determinación de LMVD, el área dentro o justo al lado de formaciones tumorales con el mayor número de microvasos claramente resaltados ( "punto caliente") fue seleccionado a bajo aumento. LMVD A continuación se determinó mediante el recuento de todos los buques immunostained con un aumento total de x200 en un campo de exploración de 0,25 mm
2. Un caso fue considerada como positiva con respecto a la LVI cuando en la exploración de la totalidad inmunote~nido deslizar un racimo de células tumorales era visible dentro de un decorado podoplanin espacio vascular.
Para el análisis de anticuerpos anti-CD61 inmunotinción, superficial, exulcerated o sangrado áreas tumorales fueron excluidos del análisis. Un tumor se puntuó como positivo para los clústeres en los vasos trombocitopénica (VTC), si por lo menos en dos buques de estas agrupaciones se observaron (Fig. 1A)
A:. Vascular clúster trombocitopénica (VTC) en una muestra de cáncer de esófago (x400 aumento del original). B: estroma clúster trombocitopénica (STC) en una muestra de cáncer de esófago evaluados por el anti - inmunotinción CD61 (x400 aumento del original). C: muestra de cáncer de esófago con alta densidad de microvasos linfáticos (LMVD) evaluada por inmunotinción podoplanin anti- (x200 aumento del original). D: la invasión linfovascular de las células tumorales evaluadas por inmunotinción anti-podoplanin (x200 aumento del original). E: Doble tinción de los vasos linfáticos usando (rojo, anti-podoplanin) y trombocitos (marrón, anti-CD61) (x400 aumento del original). F-H: Las barras de error que muestran los valores medios ± 2 × error estándar. los recuentos de plaquetas de sangre periférica (PBPC) fueron significativamente mayores en las muestras con VTC (F). PBPC (G) y LMVD (H) fueron significativamente mayores en las muestras de cáncer de esófago con STC.
Un tumor se considera que tienen grupos trombocitopénica dentro del estroma tumoral (STC), si más de una inequívoca CD61 clúster inmunote~nido era visible dentro del estroma tumoral (fig. 1B).
el análisis de inmunohistoquímica se llevó a cabo por dos investigadores independientes (SFS, PB) cegados a los datos clínicos. Los casos con resultados divergentes se evaluaron juntos usando un microscopio de múltiples cabezas.
Análisis estadístico
T-test, prueba de Mann-Whitney, Chi cuadrado pruebas de regresión lineal y se utilizaron en su caso. Todos los números dados son valores medios ± desviación estándar, si no se indica lo contrario.
La supervivencia global (OS) se define como el tiempo entre la cirugía primaria y la muerte del paciente, la supervivencia hasta el final del período de observación fue considerado como observación censurada. supervivencia libre de enfermedad (DFS) se definió como el tiempo desde el día de la cirugía hasta la primera evidencia de la enfermedad de progresión. El análisis univariante de supervivencia se realizó mediante el test de Breslow, el análisis multivariado mediante el modelo de riesgos Proporcional de Cox. edad del paciente, la radicalidad de la resección, tumor y los ganglios linfáticos etapa (de acuerdo con la actual clasificación de la UICC), grado del tumor y los ganglios linfáticos fueron incluidos en la regresión de Cox. Un valor de p de dos colas de ≤0.05 fue considerado significativo, SPSS 19,0 se utilizó para todos los cálculos.
endotelial Aislamiento y cultivo de células
células endoteliales primarias fueron aisladas de muestras de prepucio humano proteolítica digest, y se purifica usando perlas magnéticas acopladas de anticuerpos anti-CD31 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Los aislados se cultivaron en medio de crecimiento endotelial microvascular EGM2-MV (Clonetics®, Lonza, Walkersville, MD) que contiene 1 mg /ml de fibronectina, 5% de FCS y factores de crecimiento humanos sin la suplementación de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Para una separación adicional de las células linfática y sanguínea endoteliales (LEC y BEC), anticuerpo anti-podoplanin se aplicaron perlas magnéticas acopladas. Todos los aislados mostraron ≥98% de pureza y viabilidad.
Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 mm en 30 pozos durante 24 h. Después de un extenso lavado con solución salina tamponada con fosfato, las células se incubaron con 10
5-10
7 de gel de plaquetas filtradas en EBM-2 medio básico (Lonza) que contiene 0,5% de FCS. Para los experimentos de bloqueo, se añadieron los siguientes reactivos a los compañeros de las culturas: de cabra anti-humano PDGFR-β neutralización de IgG a 1 mg /ml (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN), ratón anti-humano VEGFR-2 neutralización de IgG
1 a 50 ng /ml (R & amp; D Systems) y competidor soluble de VEGFR-3 /Fc humana a 1 mg /ml (Cell Sciences, Canton, MA). Para el control negativo, IgG de cabra no específica, IgG de ratón
1 e IgG humana se aplicaron a las mismas concentraciones.
El análisis de las células se llevó a cabo después de 24 a 72 horas. Las imágenes digitales de las células fueron tomadas con un microscopio Axiovert 40CFL (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Las células fueron posteriormente liberados a partir de placas de cultivo por tripsinización y el recuento celular se evaluó mediante tinción con azul tripán. Los datos mostrados representan la media y desviación estándar de las muestras por triplicado. Cada experimento se llevó a cabo ≥ 3 veces con LEC aislados de diferentes donantes.
plaquetas Aislamiento
Se extrajo sangre venosa de voluntarios sanos en tubos de citrato de sodio y se sometió a centrifugación a 85 x g y RT para 20 minutos. El sobrenadante de plasma rico en plaquetas obtenido se purificó por filtración en gel utilizando 2B sepharose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La activación plaquetaria durante la purificación se inhibió con 100 mu M de prostaglandina E1. Después de la centrifugación de las plaquetas filtradas en gel a 3000 × g y RT durante 1,5 minutos, las plaquetas se resuspendieron en EBM-2 medio que contiene 0,5% de FCS y la concentración de plaquetas se determinó con un contador de Sysmex (Kobe, Japón).
Cell Formazan base ensayo de proliferación de
el no radiactivo de proliferación celular y ensayo de citotoxicidad (EZ4U®, Biomedica, Viena, Austria) se utilizó para determinar la actividad metabólica de los LEC por tetrazolio reducción. se añadieron 100 l de sustrato cromogénico disuelto para cada 30 mm bien y se incubaron a 37 ° C durante 2 h. A partir de entonces, el sobrenadante de cultivo se recuperó y la absorbancia a 450 nm se midió con un lector de placas Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA).
Mediciones factor de crecimiento
Co- los sobrenadantes de cultivo se analizaron para el contenido de VEGF-a, -C, -D y PDGF-BB mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (Quantikine; R & amp; D Systems) según las instrucciones del fabricante
resultados
.
Las muestras quirúrgicas
En total, 320 cánceres de esófago invasivos fueron incluidos en este estudio: 184 adenocarcinomas (AC), y 136 carcinomas de células escamosas (SCC)
Los datos clínicos de los pacientes tienen. recogen en la tabla 1, la quimioterapia neoadyuvante antes de la cirugía se administró en 98 pacientes. Para los cálculos, en estos pacientes PBPC generalmente antes se utilizaron inicio de la quimioterapia neoadyuvante. En 11 pacientes, no existen datos sobre PBPC antes de la quimioterapia neoadyuvante estaban disponibles. Dado que no hay diferencia significativa en la PBPC antes y después de la quimioterapia neoadyuvante se encontró en los 87 pacientes restantes (p & gt; 0,05, t-test), PBPC después de la quimioterapia neoadyuvante (inmediatamente antes de la cirugía) se utilizaron en estos pacientes para el análisis. STC estaban presentes en 82 muestras (25,6%; 36 CA, 46 SCC), VTC en 56 (17,5%, 22 CA, 34 SCC). La Figura 1 da muestras de inmunotinción. En general, STC (p = 0,004, prueba de Chi cuadrado) y VTC (p = 0,002, prueba de Chi cuadrado) fueron más comunes en SCC en comparación con AC. Una asociación significativa entre los CFPs de presencia y STC fue visto en la investigación de todos los casos y en la investigación de CA y SCC por separado. (P & lt; 0,001, respectivamente, prueba de Chi cuadrado)
Mientras que ninguna asociación de la presencia de STC con la estadificación del tumor y la clasificación histológica se observó en todos los casos y AC, en SCC estado de los ganglios linfáticos más avanzado se observó en tumores con STC (mediana de pN1 en ambos casos, p = 0,024, Mann Whitney).
La presencia de VTC se asoció con estadio tumoral avanzado más en todos los casos (mediana de pT3 en ambos casos con una tendencia hacia una mayor puesta en escena en pacientes con VTC, p = 0,036, Mann Whitney), pero esta asociación no se observó en la investigación de CA y SCC por separado.
PBPC fueron mayores en los casos con VTC en la investigación de todos los casos (275 ± 83 vs 250 ± 79 g /l, p = 0,001, t-test) (Fig. 1F ), pero esta asociación fue visto en investigación separada de tipos de tumores sólo en SCC (282 ± 75 vs 243 ± 81 g /l; p = 0,007, t-test), pero no en AC (p = 0,077, t-test) . No se encontró asociación de VTC con LMVD se observó en todos los casos y AC y SCC por separado. (P & gt; 0,05, t de ensayo).
La presencia de STC se asoció con un mayor PBPC en investigación de todos los casos en comparación con los pacientes sin STC (279 ± 88 g /l frente a 246 ± 76 G /l; p = 0,001, prueba de la t) (figura 1G).. En la investigación de tipos de tumores por separado, tal asociación se encontró sólo en SCC (282 ± 75 g /l frente a 243 ± 82 g /l, p = 0,007, prueba de t), pero se perdió importancia en CA (274 ± 101 g /l vs 247 ± 73 /l, p = 0,077, t-test G). La presencia de STC se asoció con mayor LMVD en todos los casos (16 ± 7 frente a 12 ± 5 microvasos /campo; p & lt; 0,001, t-test) (Fig. 1H) y también en CA (16 ± 6 frente a 12 ± 5 microvasos /campo, P & lt; 0,001, prueba t) y SCC (17 ± 7 frente a 13 ± 6, p = 0,002, t-test) por separado
No se encontró asociación directa de la STC o VTC con LVI. fue visto (p & gt; 0,05, prueba de Chi cuadrado)., pero en un modelo de regresión lineal con LVI como variable dependiente e incluyendo PBPC, STC y VTC mostraron que PBPC (p = 0,035, coeficiente de regresión & lt; 0,001) y VTC (p = 0,018, coeficiente de regresión de 0,175) se asociaron con LVI.
En un segundo modelo de regresión lineal utilizando LMVD como variable dependiente, incluyendo las mismas variables independientes, de nuevo PBPC (p = 0,034, coeficiente de regresión -0.009) y STC. (p & lt; 0,001, coeficiente de regresión 5.415) influyó LMVD
Análisis de supervivencia
el tiempo medio de observación fue de 50 ± 3 (error estándar) meses, durante este período de observación, 154 pacientes (48,1 %) desarrollaron la enfermedad recurrente, y 131 (40,9%) murieron.
La presencia de STC se asoció con menor DFS de todos los casos en el análisis univariado (p = 0,036, prueba de Breslow, Fig. 2A). En la investigación de tipos de tumores por separado, tal influencia se encontró en AC, pero al análisis de SCC (p = 0,037, test de Breslow, Fig. 2B). STC se asociaron con DFS más cortos en el análisis multivariante de CA (p = 0,022, regresión de Cox, el cuadro 2, la figura 2C.)
Figura 2A:. La presencia de grupos del estroma trombocitopénica (STC) se asoció con una menor DFS en todos los casos. En la investigación de tipos de tumores por separado, STC se asoció con DFS más cortos en el cáncer de células escamosas (SCC) (Fig. 2B), así como en el adenocarcinoma (AC) (Fig. 2C). Higo. 2D: La presencia de grupos trombocitopénica vasculares (VTC) se asoció con DFS más cortos en SCC. Higo. 2E: Sorprendentemente, VTC se asoció con SSE significativamente más larga en la CA en el análisis multivariante. Sin embargo, tenga en cuenta que sólo relativamente pocos eventos se ven en la curva VTC +, y las curvas se cruzan entre sí a través, calificando este hallazgo. Higo. 2F: VTC se asoció con el sistema operativo más corto en SCC
Sin influencia de STC fue visto en la SG a la investigación de todos los casos, además de en la investigación de CA y SCC por separado (p & gt; 0,05. , prueba de Breslow o regresión de Cox, respectivamente;. tabla 2)
Sin relevancia de VTC sobre SLE se observó en la investigación de todos los casos. En la investigación de CA y SCC separado, VTC se asoció con DFS más cortos en el análisis univariado en las CEC (p = 0,025, prueba de Breslow, la mediana DFS 506 ± 82 vs 794 ± 139 días; Fig. 2D), pero asociado a más largo en DFS análisis multivariado de AC (p = 0,008, regresión de Cox, la mediana DFS 2928 ± 990 vs. 700 ± 141 días; Figura 2E). Presencia de VTC también se asoció con OS significativamente más corto en SCC (p = 0,049, prueba de Breslow, la figura 2F.)
PBPC no se asoció con la SSE ni en la SG en uni o análisis multivariante (p & gt;. 0.05, regresión de Cox uni o multivariado, respectivamente).
Cell Cultura y
LEC se sembraron a 1 × 30 mm por 10∧5 así, y después de 24 horas se añadieron las plaquetas aisladas a las 3 × 10 ∧7, 10∧6 o 10∧5 por pocillo y las células se cultivaron durante otras 48 h. Como se muestra en la Figura 3A-E, de células LEC recuento aumenta con el número de plaquetas aisladas añadido, lo que indica que la proliferación LEC se ve reforzada por co-cultivo con plaquetas humanas de una manera dependiente de la dosis
A:. Proliferación LEC se ve reforzada por co-cultivo con plaquetas humanas de una manera dependiente de la dosis. LEC fueron sembradas a 1 × 30 mm por 10∧5 bien. Después de 24 horas se añadieron aislados plaquetas a 3 x 10∧7, 10∧6 o 10∧5 por pocillo y las células se cultivaron durante otras 48 h. Para la cuantificación de la proliferación celular, el recuento de LEC se determinó (barras negras, escala derecha) y la actividad metabólica se midió mediante ensayo de reducción de tetrazolio (barras blancas, escala izquierda). B-E: Correspondiente imágenes microscópicas a A: B: Control; C: EC + Px10∧7, D: EC + Px10∧6, E: EC + Px10∧5. F: la proliferación LEC se ve reforzada por la co-cultivo con plaquetas humanas de una manera dependiente del tiempo. LEC fueron sembradas a 1 × 30 mm por 10∧5 bien. 24 horas después se añadieron las plaquetas aisladas en 1 × 10∧7 por pocillo y las células se cultivaron durante otras 24, 48 y 72 horas. Los recuentos de células se determinaron para co-cultivos LEC-plaquetas (línea continua) en comparación con los LEC sin adición de plaquetas (línea discontinua). G + H: liberación del factor de crecimiento durante el co-cultivo de los LEC y las plaquetas humanas. LEC fueron sembradas a 1 × 30 mm por 10∧5 bien. Después de 24 horas se añadieron aislados plaquetas en 7 × 10∧7, 10∧6 o 10∧5 por pocillo y las células se cultivaron durante otras 48 h. El sobrenadante del cultivo se recogió, se centrifugó (para eliminar los componentes celulares) y luego se ensayaron para la concentración de PDGF-BB (G) y VEGF-C (H) mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. I: proliferación LEC-plaquetaria inducida está mediada por PDGFRß, VEGFR-2 y -3. LEC fueron sembradas a 1 × 30 mm por 10∧5 bien. Después de 24 horas se añadieron aislados plaquetas en 7 × 10∧7 por pocillo con o sin el bloqueo de reactivos contra PDGFRß, VEGFR-2 y /o VEGFR-3. Las células se cultivaron durante otras 48 h antes de determinar los recuentos de LEC.
Como segundo experimento, se investigó si la proliferación LEC se ve reforzada por las plaquetas humanas de una manera dependiente del tiempo. Para este propósito, se añadieron las plaquetas en 1 × 10∧7 por pocillo a los LEC aisladas (1 × 10∧5 por 30 mm bien) y las células se cultivaron durante otras 24, 48 y 72 horas. Higo. 3F muestra que la proliferación LEC se ve reforzada por la co-cultivo con plaquetas humanas de una manera dependiente del tiempo en comparación con los LEC sin adición de plaquetas.
Como siguiente paso, se investigó si los factores pro-lymphangiogenic se liberan durante el co-cultivo de LEC y plaquetas. Se añadieron plaquetas aisladas en 7 × 10∧7, 10∧6 o 10∧5 por pocillo a los LEC (1 × 10∧5 por 30 mm así) después de 24 horas, y las células se cultivaron durante otras 48 h. El sobrenadante del cultivo se recogió, se centrifugó para eliminar los componentes celulares y a continuación, se ensayaron para la concentración de PDGF-BB y VEGF-C por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.
Figura 3G y 3H muestran que a una concentración de plaquetas de 10∧ 6, PDGFR-β y VEGF-C fueron puestos en libertad, y esta liberación de factores de crecimiento se incrementó fuertemente a una concentración de plaquetas de 10∧7
Como último paso, se realizaron experimentos de bloqueo:.
LEC fueron sembradas a 1 × 30 mm por 10∧5 bien. Después de 24 horas se añadieron aislados plaquetas en 7 × 10∧7 por pocillo con o sin el bloqueo de reactivos contra PDGFRß, VEGFR-2 y /o VEGFR-3. Las células se cultivaron durante otras 48 h antes de determinar los recuentos de LEC. Higo. 3I muestra que la proliferación de células LEC se reduce en parte por la adición de los compuestos individuales en comparación con LEC /plaquetas de co-cultivo sin sustancias de bloqueo. La inhibición de VEGFR-3 (el bloqueo de la señalización de VEGF-C) era más potente y la disminución de la proliferación LEC de plaquetas mediada por 90%. Este efecto no se podría mejorar mediante la combinación con anti-PDGFRß y los anticuerpos anti-VEGFR-2
Discusión
Las plaquetas desempeñan un papel importante en la enfermedad maligna humana:. Así se ha demostrado en muchos estudios que preoperatoria elevada cifra de plaquetas en la sangre periférica predice un mal pronóstico en una variedad de cánceres humanos [17] entre ellos el cáncer gástrico también [18].
en el cáncer de esófago (SCC y AC), un aumento en el recuento de plaquetas después de la resección en bloque se ha informado de que se asocia con un mejor pronóstico en un estudio [19], y en un estudio de Pakistán, bajo recuento de plaquetas preoperatorios fueron asociados con un mal pronóstico [20]. Por el contrario, otro estudio encontró que la trombocitosis preoperatoria indica mal pronóstico en esofágico SCC [20].
Sin embargo, no es del todo claro si los recuentos de plaquetas elevados son inducidas por un fenotipo más agresivo de los tumores, o contribuyen a sí mismos comportamiento clínico de los tumores. Lo más probable tumores pueden inducir trombopoyesis directamente, por ejemplo, a través del factor como la IL-6 [21].
Las plaquetas también parecen promover la metástasis, pero los mecanismos exactos aún no están claros [22], [23].
Las plaquetas desempeñan también un papel en la angiogénesis tumoral después de la activación, por ejemplo, en respuesta al daño endotelial [24]. Este efecto parece ser inducida no sólo por la secreción de factor plaquetario, sino también por la estimulación directa de la angiogénesis [25].
Es bien sabido que las plaquetas humanos periféricos son capaces de secretar factores pro-lymphangiogenic como VEGF-C y PDGFR-B, que se libera durante la activación plaquetaria [26]. Además, las plaquetas desempeñan un papel importante en el desarrollo embrionario del sistema linfático [7]. Así que se ha informado que inhiben la proliferación y migración de células endoteliales linfáticas durante el desarrollo embrionario de la activación por la interacción de CLEC2 y podoplanin, que se expresa en las células endoteliales linfáticos [27].
En la enfermedad maligna, la interacción entre plaquetas y podoplanin vía CLEC-2 induce una serie de vías de señalización implicadas en la migración de células tumorales y el crecimiento [28].
Sorprendentemente, a nuestro conocimiento no existen datos sobre el papel de las plaquetas en la LI en la enfermedad maligna humana por lo el momento.
en nuestro estudio, hemos investigado en una serie amplia de cánceres esofágicos la asociación de PBPC con las plaquetas en los vasos del tumor, dentro del estroma del tumor y con la LI.
perioperatoria PBPC se asociaron con la presencia de plaquetas en el tejido tumoral, y plaquetas en el tejido tumoral se asoció con un aumento de la linfangiogénesis. Si bien no se observó ninguna asociación directa de la STC o VTC con LVI de las células tumorales, PBPC y VTC influenciados LVI en analysis.This de regresión indica que una interacción compleja entre PBPC, VTC y STC promueve la LVI de las células tumorales.
Para investigar nuestros hallazgos en detalle
in vitro
, hemos realizado experimentos de cultivo celular, lo que demuestra que las plaquetas promueven el crecimiento de la LEC de una manera dosis-y tiempo-dependiente. Esta inducción del crecimiento LEC parece estar inducida por la secreción de factores pro-lymphangiogenic como VEGF-C y PDGF-BB.
Así que nuestros hallazgos podrían ser una posible explicación de por qué el aumento de PBPC preoperatorio se asocia con el pronóstico en una disminución variedad de cánceres humanos, aunque esto no fue evidente en nuestro estudio. Aunque podoplanin interactúa con las plaquetas durante el desarrollo, una interacción entre las células endoteliales linfáticas y las plaquetas no se ha descrito previamente. Esto podría explicarse por el hecho de que los trombocitos no se encuentran dentro del sistema vascular linfático. Sin embargo, las plaquetas facilitan la extravasación por la liberación de metaloproteinasas de la matriz y por la estimulación de tumor y las células endoteliales [28]. Como es evidente en nuestro estudio, los cúmulos de plaquetas podrían también encontraron no sólo dentro de los vasos sanguíneos, sino también dentro del estroma tumoral, lo que indica vasos con fugas. Desde racimos vasculares y plaquetas estromal correlacionados, la migración de las plaquetas fuera de los vasos parece estar inducida por grupos vasculares. Los factores lymphangiogenic secretadas dentro del estroma por las plaquetas extravasados pueden inducir el crecimiento del endotelio linfático, apoyando así la formación de vasos linfáticos recién formados.
A se muestra en nuestros experimentos de cultivo celular, esta estimulación de la proliferación de los LEC por las plaquetas parece ser inducida en un tiempo y dosis de manera dependiente principalmente por VEGF-C y PDGF-BB, que son secretadas por las plaquetas. experimentos de bloqueo indican un papel predominante de VEGF-C en este proceso.
Como se informó en una variedad de estudios, el aumento de vasos linfáticos se correlaciona con la probabilidad de desarrollar LVI y posteriores metástasis en los ganglios linfáticos. [29] - [34]. El hecho de que las plaquetas promueven la extravasación de las células tumorales es bien conocido [17], pero en base a nuestros datos, parece muy probable que las plaquetas en el estroma tumoral también promueven la invasión de células tumorales en el sistema linfovascular
en resumen, se muestra por primera vez en grandes series de pacientes humanos con cáncer y también
in vitro con descuento que las plaquetas sanguíneas periféricas desempeñan un papel importante en la LI cáncer de esófago y LVI, influyendo así en el pronóstico de pacientes. Por lo que la interrupción de las vías entre las plaquetas, células tumorales y el endotelio linfático de señalización puede ser de beneficio para los pacientes.