Extracto
Introducción
Numerosos agentes anti-angiogénicos se desarrollan actualmente para limitar el crecimiento tumoral y la metástasis. Mientras que estos fármacos ofrecen esperanza para los enfermos de cáncer, su efecto transitorio en la vasculatura del tumor es difícil de evaluar en la práctica clínica. endomicroscopía láser confocal (CLE) es una nueva tecnología de formación de imágenes endoscópico que permite el examen histológico de la mucosa gastrointestinal. El objetivo del presente estudio fue evaluar la viabilidad de utilizar CLE a la imagen de la red vascular en biopsias frescas de tejido colorrectal humano. Con este fin hemos fotografiado muestras normales y malignos tejido de biopsia y se compara los parámetros de red vasculares obtenidos con CLE con técnicas de histopatología establecidos.
Materiales y Métodos
frescas muestras no fijadas de biopsia de tanto normales y la mucosa colorrectal maligno se tiñeron con anticuerpos anti-CD31 marcados con fluorescencia y imaginada por CLE utilizando un sistema endomicroscopía dedicado. Correspondientes muestras de biopsia se sometieron a tinción inmunohistoquímica para CD31, la evaluación de la densidad microvascular (MVD) y áreas vasculares para la comparación con los datos de evaluación a nivel institucional, los cuales fueron medidos en línea usando software específico.
Resultados
Los vasos fueron imágenes por CLE en ambas muestras normales y tumorales. El diámetro medio de los vasos normales fue de 8,5 ± 0,9 micras, mientras que en las muestras de tumor era 13,5 ± 0,7 micras (p = 0,0049). la densidad vascular fue 188,7 ± 24,9 vasos /mm
2 en el tejido normal vs. 242,4 ± 16,1 vasos /mm
2 en las muestras de cáncer colorrectal (p = 0,1201). En las muestras de inmunohistoquímica, la MVD fue 211,2 ± 42,9 /mm
2 y 351,3 ± 39,6 /mm
2 de mucosa normal y maligno, respectivamente. El área vascular fue de 2,9 ± 0,5% de la superficie total del tejido de la mucosa normal y 8,5 ± 2,1% para el tejido de cáncer colorrectal primario.
Conclusión
imagen selectiva de los vasos sanguíneos con CLE es factible en el tejido normal y tumoral colorrectal mediante el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra un marcador endotelial. El método podría traducirse en la práctica clínica para el seguimiento de la terapia antiangiogénica
Visto:. Cartana T, Saftoiu A, Gruionu LG, Gheonea DI, Pirici D, Georgescu CV, et al. (2012) confocal láser Endomicroscopía para la Evaluación morfométrica de microvasos en el cáncer colorrectal humano usando Targeted anti-CD31 anticuerpos. PLoS ONE 7 (12): e52815. doi: 10.1371 /journal.pone.0052815
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: Septiembre 10, 2012; Aceptado: 21 Noviembre 2012; Publicado: December 28, 2012
Derechos de Autor © 2012 Cartana et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo de la beca de investigación titulado "Modelado clínica y biomatemático de cambios vasculares Tras anti-angiogénico terapia en carcinoma colorrectal avanzado", financiado por el Consejo Superior de investigaciones Científicas (CNCS), Rumania, número de contrato PN-II-ID-PCE-2011- 3-0664. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
terapia
anti-angiogénico ha planteado recientemente un interés creciente debido a las posibles consecuencias relacionadas con el tratamiento específico y la estratificación de pronóstico para una variedad de tumores sólidos [1]. No obstante, la llegada de nuevos agentes anti-angiogénicos en la práctica clínica oncológica ha generado la necesidad de métodos de imagen mejorados para la evaluación de la red microvascular durante el tratamiento.
La angiogénesis se ha evaluado tradicionalmente mediante la medición de la densidad de los microvasos (MVD ) en tejido fijado a inmunotinción para una variedad de marcadores endoteliales como el factor VIII, CD31, CD34 [2] y los estudios previos han identificado la densidad microvascular (MVD) como un factor de pronóstico potencial para un número de tumores sólidos. CD31, también conocido como la adhesión celular endotelial de plaquetas molécula-1 (PECAM-1) es un marcador pan-endotelial para ambos vasos pequeños y grandes [2]. Entre sus muchas funciones CD31 también se ha relacionado con el crecimiento y la diseminación metastásica de los tumores, estar involucrado en los procesos de la angiogénesis y la permeabilidad vascular [3].
Sin embargo, el uso de inmunohistoquímica y MVD para estimar la angiogénesis en el contexto de los ensayos clínicos se ha planteado algunas preocupaciones éticas y prácticas relacionadas con la recolección repetida de biopsias de pacientes [4]. Imagen funcional de la vascularización del tumor es una alternativa prometedora, pero la mayor parte de las técnicas de imagen disponibles clínicamente no tienen la resolución microscópica requerida para aplicaciones clínicas [5]. Recientemente, endomicroscopía láser confocal (CLE) fue desarrollado para el tiempo real
in vivo
análisis histológico de la mucosa del intestino. secciones ópticas de alta resolución en el plano horizontal de la pantalla de tejido diana detalles celulares y subcelulares durante la endoscopia en curso [6]. Una variedad de aplicaciones clínicas de la técnica ya se han descrito en las lesiones tanto del tracto superior e inferior gastrointestinal, con especial interés en la neoplasia, donde CLE genera en tiempo real el diagnóstico histológico y dirigidos biopsias de áreas relevantes para un mayor rendimiento diagnóstico que al azar biopsias [7], [8], [9], [10], [11], [12]. En las lesiones colorrectales, CLE ha mostrado una alta precisión en la detección de la neoplasia intraepitelial basado en el patrón de la red y la cripta arquitectura vascular [7].
agentes de contraste actualmente aprobados para exámenes clínicos Endomicroscopía incluyen colorantes con propiedades de tinción inespecíficos como fluoresceína, acriflavina o violeta de cresilo [13]. Sin embargo, estudios recientes se han realizado en modelos animales y en muestras de tejido humano usando anticuerpos marcados con fluorescencia que permitieron imágenes endomicroscopic específico del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [14], [15], [16] . Mediante el uso de anticuerpos marcado con isotiocianato de fluoresceína, CLE fue capaz de diferenciar los niveles de expresión de EGFR en tumores de xenoinjertos de murina y distinción permitido de neoplásica humana y tejido colorrectal no neoplásico en base a sus patrones de expresión de EGFR [14]. El mismo grupo demostró que la imagen molecular de VEGF es factible en diferentes modelos de roedores de cánceres gastrointestinales. Las diferencias entre la fuerza de la señal fluorescente VEGF de muestras de tejido humano normales y malignas también se demostraron [15]. La imagen molecular de EGFR y survivina, una proteína inhibidora de la apoptosis, también se logró con el sistema de evaluación a nivel institucional basada en la sonda esofágica y en la mucosa gástrica de modelos porcinos [16].
El objetivo del presente estudio fue evaluar la viabilidad del sistema CLE para obtener imágenes de la red vascular de las muestras de tejidos humanos colorrectales tanto de mucosa normal y maligno utilizando anticuerpos anti-CD31 marcados fluorescentemente. Dado que actualmente no hay entradas CD-31 marcadores aprobados para uso humano, se ha utilizado la técnica de imagen CLE en muestras de biopsias humanas no fijos frescas teñidas con anticuerpos anti-CD31 para poner a prueba la hipótesis de que el sistema CLE ofrece una resolución adecuada para la obtención de imágenes del tumor parámetros vasculares vasculatura y acopio similares a las técnicas de histopatología actualmente aceptadas.
Materiales y Métodos
los pacientes
El presente estudio de viabilidad se realizó en biopsias endoscópicas obtenidas de cuatro pacientes con avanzada adenocarcinomas colorrectales, que fueron diagnosticados durante los procedimientos de colonoscopia de rutina. Los pacientes se sometieron a muestreo pinzas de biopsia convencional de áreas pareadas de la mucosa colónica normal (tomado por lo menos 10 cm desde el tumor) y de la masa colorrectal. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina y Farmacia de Craiova. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito después de recibir un formulario estándar para la toma de biopsias mediante colonoscopia que se afirma que las muestras de biopsia se analizaron adicionalmente mediante técnicas de inmunohistoquímica y se utilizan con fines de investigación. Las biopsias fueron analizadas de acuerdo con un protocolo de tinción común (abajo) para examen histopatológico convencional y por los exámenes CLE después de la tinción con anticuerpos específicos.
Protocolo de inmunotinción CLE
Uno de muestras pareadas de biopsias humanas frescas de alrededor 2-3 mm de diámetro se recogió durante los procedimientos endoscópicos inferiores de mucosa colorrectal normal y neoplásica de cada paciente y se sumergió en solución salina fisiológica. Las biopsias frescas se incubaron en la oscuridad con un anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1, clon MEM-05, dilución 1:10) dirigidos contra CD31 humano /PECAM-1 (Exbio, Praga, República Checa) y etiquetados con Alexa Fluor-488 de 1 hora a 37 ° C, y se enjuagó con solución salina fisiológica para eliminar cualquier reactivo no unido. Las muestras se colocaron en portaobjetos de vidrio e inmediatamente reflejado por el CLE para estructuras vasculares. Para la optimización de la técnica, diferentes diluciones de anticuerpos en el 1% de albúmina de suero bovino en PBS (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.), que van 1:05-01:30, fueron probados previamente en fresco, no fijo muestras de tejido y la imagen con un microscopio de fluorescencia automatizado (Nikon 90i, Tokyo, Japón). También se estableció un marco de tiempo de aproximadamente 60 minutos que permite la unión de los anticuerpos a su objetivo y la imagen muestra sin la degradación del tejido.
CLE Imaging
En este estudio, se utilizó el sistema de evaluación a nivel institucional la cual integra un microscopio confocal en miniatura dentro de la punta distal de un endoscopio flexible convencional (CE-3870 CIFK, Pentax, Tokio, Japón). La lente confocal en la punta distal se avanza ligeramente fuera del endoscopio, lo que permite la exploración selectiva de las estructuras. Durante la exploración, el láser proporciona una longitud de onda de excitación de 488 nm con una potencia máxima de salida de láser de ≤1 mW en la superficie del tejido que está controlada por el usuario durante el examen de contraste de formación de imágenes óptima. La profundidad máxima de las imágenes es de 250 micras de la superficie de la mucosa. Las secciones ópticas resultantes tienen una resolución lateral de 0,7 micras para un 7 micras rebanada de grosor (eje z) y un campo de visión de 475 x 475 micras
.
El endomicroscope se montó en un bastidor fijo y las biopsias se colocaron en portaobjetos de vidrio histología, en contacto directo y suave con la punta distal del endomicroscope láser confocal. Las imágenes fueron capturadas por la presión del pedal del interruptor de pie y se almacenaron en formato digital en el disco duro del sistema como imágenes en escala de grises (150-250 para cada muestra de biopsia) para su descarga y posterior procesamiento.
Las mediciones de red vascular
Se analizaron las imágenes CLE mediante el uso de la imagen J (Institutos nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE.UU.). Cinco imágenes con la señal fluorescente fuerte y una buena visualización de la red vascular fueron elegidos de cada muestra de tejido para el análisis de las estructuras vasculares. Para una distinción más clara de los vasos, se añadió una superposición de color para que coincida con el agente de contraste fluorescente (Figura 1). La herramienta de línea recta se utilizó para medir manualmente el diámetro de cada segmento vascular, bien sea entre dos puntos de ramificación o un punto de ramificación y un cabo suelto. Cada segmento vascular se marcó y se contó para la densidad vascular. Los resultados fueron exportados en un archivo de Excel y se presenta como la media ± error estándar (SE) para cada imagen elegida y caso individual. Las mediciones de diámetro y la densidad vascular se llevaron a cabo de forma independiente por dos operadores diferentes que fueron cegados a los resultados de los demás y con el informe de patología. Los resultados se informaron como la media de las dos mediciones
En la mucosa normal, los vasos se organizan en una red hexagonal (A).; el área correspondiente en el tumor muestra los vasos más dilatados, de forma irregular, con diámetros variables a lo largo de su longitud (B); las mismas secciones ópticas se muestran con superposición de color añadido (C, D). * La barra de escala es de 50 micras.
Convencional tinción inmunohistoquímica
Corresponsal muestras de biopsia de tumores colorrectales se colocaron en formalina al 4% tamponado neutro para la fijación y la inclusión en parafina. diagnóstico de la patología convencional se basa en H & amp; E tinción, mientras que la tinción inmunohistoquímica de secciones para CD31 se realizó de acuerdo a las indicaciones del fabricante (Dako, Glostrup, Dinamarca). En pocas palabras, después de la recuperación de antígeno mediada por tampón citrato, las secciones se enfriaron a temperatura ambiente y se incubaron durante 30 minutos en peróxido de hidrógeno al 1%. Las secciones se lavaron en PBS próximo, seguida de una etapa de bloqueo de 30 minutos en la leche desnatada 1%. (IgG1 clon JC70A, ratón anti-humano, Dako, Glostrup, Dinamarca) se añadió el anticuerpo primario anti-CD31 diluido como se 1:100, y los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron, la señal se amplificó utilizando un sistema de detección secundario a base de polímeros con peroxidasa EnVision específico de la especie (Dako, Glostrup, Dinamarca), y luego detecta con 3,3'-diaminobencidina (DAB, Dako, Glostrup , Dinamarca). Todos los pasos de lavado se realizaron en 0,1 M PBS, pH 7,2, y el anticuerpo primario se diluyó en PBS con 1% de BSA. Todos los tiempos de incubación se mantuvieron constantes para todas las diapositivas incluidas en el presente estudio. Por último, los portaobjetos se coversliped después de la tinción con hematoxilina.
densidad de los microvasos (MVD) Medición
Todos los análisis imagen microscópica se realizó con un microscopio Nikon Eclipse 55i acoplada a una cámara a color CCD 5 Mp ( Nikon, Tokio, Japón) y una estación de análisis de imágenes basado en el software Image ProPlus AMS7 (Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, EE.UU.). Con el fin de evaluar los MVDS en el CD-31 manchado tumor y secciones de tejidos no tumorales correspondientes, se utilizó el método de punto de acceso como se describe anteriormente [17]. En el tejido tumoral, el operador utiliza los 10x y 20x objetivos para identificar los "puntos calientes", es decir, las zonas con la densidad vascular más alta. En estas zonas de tres a cuatro imágenes al azar fueron capturados en el marco del objetivo de 40x. En el tejido normal de tres a cuatro imágenes al azar fueron capturados en el marco del objetivo de 40x, con exclusión de las zonas que abundan en las células no mucosos /inflamatorias.
Las áreas de tinción CD31 causa vascular (región de interés, ROI) fueron marcados directamente en las imágenes de dos operadores independientes y barcos incluidos con un lumen identificables, así como único o grupos de células endoteliales no luminal. Se excluyeron las células inflamatorias que toman la mancha (es decir, plasmocitos) y las células rojas de la sangre sin manchas alrededor de ellos. Un comando de macro en la imagen ProPlus fue desarrollado para contar el número y medir las áreas de ROI en cada imagen, y los datos se informó en un archivo de Excel como MVD y el área vascular, respectivamente. Para la comparación con otros datos publicados, tanto la densidad de los vasos CLE y el MVD determinado a partir de inmunohistoquímica se normalizaron a un mm
2 Sup.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó en Microsoft Office Excel® (Microsoft, Redmond, Washington, EE.UU.). Los resultados se expresaron como medias ± SE de la media. Para la evaluación morfométrica, se hizo la comparación entre vasculatura normal y tumor. Para determinar la significación de las diferencias entre las mediciones vasculares, se realizó una prueba t de dos colas con significación estadística logrado a un valor de p. & Lt; 0,05
Resultados
Patrones microvascular CLE
Una señal fluorescente específica fue identificada con el alcance CLE en todas las biopsias de muestras de tejidos normales y neoplásicos. Los vasos en las biopsias normales forman un patrón hexagonal con distribución homogénea de los diámetros característicos de una mucosa normal como se indica por la tinción con CD31 selectivo (Figura 1A y 1C). En muestras de tumores de los vasos parecían dilatados y de forma irregular en comparación con la mucosa normal, con diámetros variables a lo largo de su longitud (Figura 1B y 1D).
Análisis morfométrico de microvasos
buques se contaron y se sus diámetros medidos entre dos intersecciones vasculares, para todo el campo de visión (Figura 2). El diámetro medio de recipiente en muestras tumorales fue 13,5 ± 0,7 micras, significativamente mayor que el diámetro de los vasos en la mucosa colorrectal normal (8,5 ± 0,9 micras, p = 0,0049). La densidad vascular fue 242,4 ± 16,1 vasos /mm
2 en muestras de tejido tumoral y 188,7 ± 24,9 vasos /mm
2 en el tejido normal (p = 0,1201).
Un recipiente y se contó su diámetro se midió para cada segmento vascular entre dos puntos de ramificación o un punto de ramificación y un cabo suelto. Se informó de la densidad vascular por mm
2. Tanto el diámetro del vaso y la densidad vascular se incrementaron en el tejido del tumor (B) en comparación con la mucosa normal (A). * La barra de escala es de 50 micras.
La inmunohistoquímica
Los correspondientes biopsias de tejido adyacente al biopsias CLE se prepararon para el estudio inmunohistoquímico con un anticuerpo anti-CD31 en ambas muestras normales y de cáncer colorrectal . En la mucosa normal, el MVD fue 211,2 ± 42,9 mientras que en el tejido maligno fue 351,3 ± 39,6 /mm
2 (p = 0,0637). La zona vascular, calculado como el porcentaje de ROI sobre toda el área de la imagen, fue mayor en las muestras de tumor (8,5 ± 2,1%) en comparación con el tejido normal de colon (2,9 ± 0,5%), p = 0,0735 (Figura 3). El resumen de los parámetros medidos vasculares en el cáncer colorrectal primario y la mucosa normal correspondiente, a partir de muestras de inmunohistoquímica y CLE, se presenta en la Tabla 1.
imágenes de campo brillante del fijado en formol y embebidos en parafina de biopsias normal y cáncer primario de colon teñidas para CD31, mostrando: vasos sanguíneos distribuidos regularmente entre las glándulas intestinales en la mucosa colónica normal (a); múltiples vasos irregulares en el estroma intratumoral, en muestras malignas (B); las mismas imágenes con áreas vasculares marcadas para el recuento automatizado (C, D). * La barra de escala es de 50 micras.
Discusión
Dado que la hipótesis inicial de la función de la angiogénesis en la progresión tumoral formulado por Judah Folkman hace cuatro décadas [18], nuestra comprensión fundamental de este proceso ha avanzado y varios fármacos anti-angiogénicos son o actualmente en uso clínico o bajo investigación clínica [4]. No obstante, todavía hay muchas preocupaciones relacionadas con la selección de la dosis óptima y el calendario, la predicción y seguimiento de la respuesta de los pacientes que limitan el uso de la terapia anti-angiogénico para los pacientes oncológicos. En el presente estudio, hemos utilizado un endoscopio CLE a la imagen del patrón vascular a partir de biopsias frescas de tejido colorrectal normal y maligno y compararon los resultados con las técnicas tradicionales histopatológicos.
Para nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre formación de imágenes histológico de los vasos obtiene con CLE mediante la aplicación de anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra un marcador endotelial (CD31). Este método genera resultados similares como la inmunohistoquímica tradicional, pero en el tejido no fijo fresco. Por lo tanto, cualquier artefacto de procesamiento de las biopsias se evita y formación de imágenes del tejido se lleva a cabo en su estado natural dentro de un corto período de tiempo después de la recogida de biopsia que acelera considerablemente el proceso de diagnóstico. Elegimos como una diana molecular un marcador pan-endotelial para el etiquetado de los dos vasos sanguíneos normales y tumorales con el fin de obtener una evaluación diferencial morfométrico. Por examen visual, las secciones ópticas confocales mostraron diferencias entre los patrones vasculares de tejido normal y tumoral. Los vasos sanguíneos malignos parecían más dilatados y tortuosos en comparación con el aspecto habitual de los vasos normales. Es un hecho conocido que los vasos sanguíneos del tumor son anormales en su estructura y función. Esto también se demostró por las clasificaciones anteriores de CLE neoplasia después de la administración intravenosa de fluoresceína [7], [19]. Sin embargo, este agente de contraste no específica tiende a difundirse excesivamente en el espacio intersticial debido al aumento de permeabilidad de los vasos patológicos. Como resultado fronteras vasculares están cerradas y sus evaluaciones cuantitativas se convierte en un desafío. En el presente enfoque, la tinción selectiva de los vasos con un marcador endotelial ha superado este inconveniente.
Con la tinción inmunohistoquímica tradicional protocolos del tejido típicamente se seccionaron en 4 micras rodajas gruesas que captan sólo crossections de los vasos sanguíneos en diferentes ángulos. El método de imagen CLE propuesto permite la visualización de los segmentos vasculares enteras en la misma imagen. por tanto, hemos sido capaces de realizar un análisis morfométrico de las secciones ópticas confocales que vinieron para validar las diferencias cualitativas ya observadas entre los dos lechos vasculares. Hemos encontrado que los vasos sanguíneos del tumor tienen un diámetro promedio significativamente mayor que los vasos normales (13,5 micras
vs.
8,5 micras, p = 0,0049). En muestras de tejido de las regiones de cáncer colorrectal, hubo un aumento de 28,5% en la densidad vascular en comparación con la mucosa normal (242,4
vs
. 188,7 vasos /mm
2). Sólo un parámetro (el diámetro del vaso) alcanzó significación estadística en nuestro estudio. Esto podría explicarse por el pequeño número de muestras incluidas en nuestro análisis. Se necesitan más estudios sobre una muestra de pacientes más amplio para confirmar los hallazgos más allá del presente estudio de prueba de concepto.
Los parámetros vasculares obtenidos con CLE son comparables con los métodos tradicionales y la literatura publicada [20], [21] , [22]. Los resultados CLE se validaron mediante una técnica inmunohistoquímica clásica que reveló una señal positiva para CD31 tanto en el control y las muestras malignas. Hubo una tendencia similar para el aumento de MVD y el área vascular en las muestras de cáncer colorrectal primario en comparación con la mucosa normal. Anteriormente informaron resultados sobre la morfometría vascular colorrectal humano varían entre los diferentes estudios debido a las diferencias en la metodología y técnicas de procesamiento [20], [21] pero en general están de acuerdo con nuestros resultados. En un estudio de la microcirculación colónica normal sobre la corrosión de fundición un diámetro de 10 micras se informó para arteriolas precapilares en el plexo mucosa [22]. Por tinción inmunohistoquímica para CD34, también un marcador pan-endotelial, el diámetro vascular media de la mucosa colónica normal fue de 7,6 ± 1,5 m [21].
Nuestra prueba de concepto hallazgos demuestran la viabilidad de la técnica y podría sentar las bases para futuras investigaciones. Si bien este estudio se utilizó un marcador pan-endotelial, futuros estudios similares podrían dirigirse a otros marcadores de proliferación del endotelio, tales como VEGFR2, que son relevantes para la angiogénesis inducida por el tumor. El corto período de tiempo (una hora entre la recogida de la biopsia y obtención de imágenes del CD31 marcado tejido con CLE) y el uso de un protocolo de tinción estándar para las muestras de biopsias frescas hace que la técnica CLE objetivo compatible con el entorno clínico a condición de que el equipo está disponible.
Nuestros resultados actuales y los informes previos sobre enfoques similares sugieren que la CLE tiene el potencial para la neovascularización de imágenes
In situ
durante los procedimientos en vivo. Puesto que las drogas anti-angiogénicos tienden a normalizar la vasculatura del tumor para un corto período de tiempo de varios días a unas pocas semanas, es deseable encontrar una manera de controlar la remodelación de la red vascular durante esta ventana de oportunidad, cuando el tumor también se vuelve más sensible a las la quimioterapia y /o radioterapia [23]. CLE, solo o en combinación con otros biomarcadores moleculares y celulares, podría ser utilizado para este propósito particular, a la espera en el descubrimiento de nuevos agentes de contraste dirigidos. Como se ha mencionado, los informes recientes muestran buenos datos preliminares con anticuerpos marcados con fluorescencia orientación EGFR o VEGF, lo que sugiere la viabilidad de estos enfoques immunoendoscopy. Sin embargo, el desarrollo del uso humano dirigido marcadores pan-endoteliales tales anticuerpos anti-CD31 como marcados con fluorescencia pueden representar una alternativa válida en tiempo real para el análisis MVD convencional de muestras de biopsia fijos.
En conclusión, hemos demostrado que selectiva formación de imágenes de los vasos sanguíneos es posible con CLE mediante el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos un marcador endotelial específico en biopsias frescas. Desconectado análisis morfométrico de las imágenes confocales con el software de procesamiento adicional demostró patrones significativamente diferentes entre las redes vasculares normales y malignas. En el futuro este enfoque podría ser utilizado para una mejor selección de pacientes para ensayos clínicos y una vigilancia más sensible de los efectos vasculares de los agentes anti-angiogénicos en terapias adaptadas individualmente.