Extracto
Klotho se identificó por primera vez en 1997 y ha sido considerado como un gen de anti-envejecimiento. Nuevas pruebas demuestra que cloto tiene una estrecha relación con el cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, cáncer de mama, etc, mediante la inhibición de la proliferación y la promoción de la apoptosis de las células cancerosas. El cisplatino ha sido el fármaco más utilizado en la quimioterapia de primera línea. Sin embargo, el aumento en las células cancerosas resistentes al cisplatino se ha convertido en un obstáculo importante en el manejo clínico de los cánceres. En nuestro estudio, por primera vez demostrado que cloto podría atenuar la resistencia del cáncer de pulmón a la quimioterapia basada cisplatino y la apoptosis de las células resistentes con sobreexpresión cloto se incrementó notablemente. Sin embargo, las células Klotho desmontables mostraron resistencia a la quimioterapia mejoran. Un análisis posterior mostró que la inhibición de la vía PI3K /Akt con inhibidor específico (LY294002) atenuó los efectos PROMOTIVE sobre el crecimiento del cáncer después de interferir con cloto shRNA. Por otra parte, hemos demostrado que cloto modula la resistencia al cisplatino en un modelo de xenoinjerto de ratones desnudos. Estas observaciones sugirieron que cloto podría mejorar la resistencia de las células de cáncer de pulmón a la quimioterapia y puede servir como un objetivo potencial para la terapia génica de los cánceres de pulmón resistente a la quimioterapia basada en cisplatino
Visto:. Wang Y, Chen L, Huang G, D Él, Él J, Xu W, et al. (2013) Cell Line Klotho sensibiliza cáncer de pulmón humano a través de cisplatino PI3K /Akt. PLoS ONE 8 (2): e57391. doi: 10.1371 /journal.pone.0057391
Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2012; Aceptado: 24 Enero 2013; Publicado: 21 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30971320). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) representa el 75-85% de los casos de cáncer de pulmón y de la quimioterapia desempeña un papel importante en el tratamiento del cáncer de pulmón [1]. El cisplatino ha sido el fármaco más utilizado en la quimioterapia de primera línea. El cisplatino puede activar varias vías de señalización, incluyendo los que implican ATR, p53, p73, y MAPK, y activar la apoptosis [2], [3]. Su citotoxicidad se atribuye a la formación de aductos de ADN, que causan la reticulación inter e intra-hebra que inhibe la replicación del ADN. Sin embargo, la resistencia del cáncer de pulmón a la quimioterapia ha sido un factor importante que afecta a la eficacia terapéutica en el tratamiento de cáncer de pulmón. Por lo tanto, es imperativo desarrollar estrategias para mejorar la resistencia del cáncer de pulmón humano a la quimioterapia basada platin. El mecanismo subyacente a la resistencia de las células cancerosas a la quimioterapia es complicado e implica la activación de PI3K /Akt (también conocida como PI3K /PKB) vía, la pérdida de función de p53, la sobre-expresión de HER-2 /neu y anti-apoptótica bcl -2, y la activación de la caspasa comprometida [2], [3]. Por lo tanto, para investigar profundamente el mecanismo subyacente de la resistencia de las células cancerosas a la quimioterapia tiene una gran importancia clínica en el tratamiento de cánceres.
Klotho es un gen anti-envejecimiento recién descubierto y se identificó originalmente en cloto ratones mutantes homocigotos ( kl - /-), que mostró un síndrome relacionado con el envejecimiento similar a la humana y desarrollan múltiples trastornos tales como hipogonadismo, calcificación ectópica, osteoporosis, atrofia de la piel, y el enfisema pulmonar [4]. Sin embargo, los ratones con sobreexpresión cloto tienen una vida útil extendida que es un 30% más en los hombres y un 20% más en las mujeres [5]. gen Klotho codifica una sola pasada de tipo 1 o de transmembrana forma secretada de la proteína Klotho través de empalme de ARN alternativo [6]. Klotho fue demostrado que ejercen un efecto inhibidor sobre el factor de-1 (IGF-1) y la vía de crecimiento tipo insulina, tanto en células de cáncer bestia humanos y células de cáncer de páncreas [7], [8]. Nuestro estudio anterior también encontró este fenómeno en células de cáncer de pulmón humano (células A549) en el que cloto también confiere un efecto pro-apoptótico a través de la vía de bax /bcl-2 [9]. Vía PI3K /Akt es una de las importantes abajo corrientes de IGF 1-vía, y numerosos estudios han confirmado su papel en la apoptosis de las células del cáncer [10] - [12]., Y podría sensitisize estas células de cáncer a cisplatino
En este estudio, la hipótesis de la cloto podría inhibir la vía PI3K /Akt y aún más para aliviar la resistencia de las células del cáncer de pulmón a cisplatino y puede servir un potente candidato para la terapia génica del cáncer de pulmón.
materiales y Métodos
Ética declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Medicina de Nanjing (Número de Permiso: 2120474). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Cultivo de células y se obtuvo de la American Type Culture estadounidense transfección
línea celular de cáncer de pulmón humano (A549) Collection (ATCC). El H460 y células células resistentes a cisplatino A549 y H460 (H460DDP A549DDP y) fueron amablemente proporcionados por el Prof. Zhou en el Hospital Pulmonar de Shanghai. Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Life Technologies, Inc.), 100 U /ml de penicilina, 100 U /ml de estreptomicina, 2 mM glutamina en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2 a 37 ° C. Para mantener la resistencia a los fármacos, las células A549 /DDP y H460 /DDP se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 2 mg /ml DDP y luego en DDP libre de RPMI 1640 dos días antes de los experimentos. células A549DDP que alcanzan 80% de confluencia fueron transfectadas con pCMV6-MYC-KL y sus shRNAs específicas en presencia de lipofectamina 2000 (Invitrogen). El shRNAs fueron los siguientes:
sh-1: CCTAAGCTCTCACTGGATCAATCCTCGAA;
sh-2: CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT;
SH-3: GGTCACTCACTACCGCTTCTCCATCTCGT;
SH- 4:. GTTACAGCATCAGGCGTGGACTCTTCTAT;
Todos los plásmidos fueron adquiridos de la OriGene (Rockville, MD, EE.UU.)
Ensayo MTT
la mitad de la máxima concentración inhibitoria (IC50) de A549DDP y las células A549 se determinaron por el MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio) ensayo (Sigma). Las células cancerosas fueron sembradas en placas de 96 pocillos (1 x 10
4 células por pocillo), y se trató con cisplatino a diferentes concentraciones de 48 h. Después de la incubación, el medio se reemplazó con 50 l de reactivo MTT (2 mg /ml) seguido de una incubación adicional en una atmósfera con 5% de CO
2 a 37 ° C durante 2 h. Entonces, los medios se retiraron y dimetilsulfóxido (DMSO) (150 l) se añadió a cada pocillo. La densidad óptica (DO) de cada pocillo se midió usando un lector de microplacas a 560 nm.
morfológica examen
Veinticuatro horas después de la transfección, las células se trataron con 80 mM (IC50 para A549DDP) cisplatino durante 8 h, y 60 mM para H460DDP, y después se lavaron una vez en solución salina tampón fosfato (PBS), seguido de fijación en methonal frío: acetona (1: 1) durante 5 min. Después de lavar tres veces en PBS durante 5 min, estas células se trataron con 4 mg /ml de 4 ', 6-dihidrocloruro diamidina-2' fenilindol (DAPI) (Sigma) durante 10 min a temperatura ambiente. Las células fueron examinados por microscopía de fluorescencia. Las células fueron seleccionados al azar para su examen en un gran aumento (x400) y se fotografiaron. Tanto las células normales (grande nucleares, de dispersión y fluorescencia homogénea) y las células apoptóticas (contracción nuclear y núcleos hipercromáticos) se contaron en cada campo.
Citometría de flujo
Las células se recogieron y suavemente desglosados a una suspensión de células individuales. La tinción se hizo de acuerdo con el protocolo del fabricante. La tasa de apoptosis inducida por regímenes anticancerosos se analizó por citometría de flujo utilizando un kit /PI anexina V-FITC (BD Biosciences, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Real-time RT-PCR
ARN total se extrajo de las células con el reactivo Trizol (Invitrogen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante, y se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. expresiones de genes se detectaron por cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR) utilizando el kit SYBR Green RT-PCR estándar (Takara, Dalian, China) según las instrucciones del fabricante. El cDNA se sintetizó usando el kit RevertAid First-Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Vilnius, Lituania) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores se diseñaron con Origene Technologies, Inc. Los cebadores utilizados fueron los siguientes:
cloto
sentido: 5'-GCTCTCAAAGCCCACATACTG -3 ';
antisentido: 5' -GCAGCATAACGATAGAGGCC -3 ';
β-actina
sentido: 5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3';
antisentido: 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ';
condiciones de la PCR consistieron en pre-desnaturalización a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, hibridación a 60 ° C durante 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 30 seg y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.
ensayo Western blot
24 hy 48 h después de la transfección, las células se lavaron dos veces en helado de PBS y las proteínas se extrajeron de las células por lisis en tampón RIPA (NaCl 150 mM, 1% [v /v] NP-40, 0,5% [w /v] de desoxicolato de sodio, 0,1% [w /v] de dodecil sulfato de sodio (SDS), 50 mM Tris HCl [ ,,,0],pH 8], EDTA 10 mM, y PMSF 1 mM [Sigma]) durante 30 min a 4 ° C y la subsiguiente centrifugación durante 15 min a 12.000 g. La concentración de proteína se determinó con un kit BCA (Pierce) según las instrucciones del fabricante. A continuación, 60 g de proteína se cargó en una 10% (w /v) en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis, y se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore Corporation de Billerica, MA 01821) que luego se bloqueó durante 2 h a temperatura ambiente con el bloqueo (tampón TBS que contiene 0,1% [v /v] Tween 20 [Sigma] y el 5% [w /v] leche en polvo). Los anticuerpos primarios (aplicados durante 1 hora a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C) fueron: anti-fosfo-Akt, anti-Akt, (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), anti-Bax, anti-cloto y anti-GAPDH (Santa Cruz). Los anticuerpos se diluyeron a 1: 1000, excepto para el anticuerpo anti-GAPDH (1: 500). A partir de entonces, las membranas se incubaron durante 2 h con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) (caballo anti-ratón o de cabra anti-conejo, 1: 20000). La visualización se realiza mediante el uso de un kit ECL, y las señales se cuantificaron por densitometría de barrido.
La transducción de lentivirus
Los vectores lentivirales que expresan ARN corto horquilla (shRNAs) se construyeron con éxito por OriGene (Rockville , MD, EE.UU.) como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de oligonucleótidos cloto-shRNA efectivamente construidos fueron los siguientes, el sentido: 5′-
CGCGTCCCC
CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT
TCAAGAGAGGTCAATCCAGGAAAGCAGTTGCCTCAGTTTTTGGAAAT
-3′.
The secuencias se insertan en el
mul
I y
cla
I enzima sitios de pLVTHM vector, respectivamente. Para la reacción de recombinación usando vectores pCMV-VSV-G pCMV-dR8.74 y (
Addgene
, Cambridge, MA), los ADN de vector lentiviral y vectores de empaquetamiento fueron transfectadas en células 293T. Después de 48 h de transfección, se recogieron los sobrenadantes que contienen los lentivirus, se centrifugó a 1800 g durante 10 min, y se filtraron a través de un 0,45 micras de poli (difluoruro de vinilideno) de membrana Durapore (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) para eliminar cualquier célula de embalaje no adherentes. línea celular de cáncer de pulmón resistentes (A549DDP) estaba infectado con el lentivirus. Entonces, las células infectadas se seleccionaron por puromicina (0,4 mg /ml) durante 14 días. A549DDP células infectadas con lentivirus shRNA mediada por la orientación cloto (sh-cloto) o lentivirus mediada por shRNA (codificación) que fueron nombrados A549DDP-lenti-sh-2 o A549DDP-lenti-scramble, respectivamente.
Experimentos in vivo en
Para los experimentos in vivo, se utilizaron ratones desnudos
ratones desnudos atímicos macho (BALB /c nu /nu, cuatro semanas de edad). Ellos fueron inyectados por vía subcutánea con células A549DDP-sh-scramble A549DDP-lenti-sh-2 o. Cuando los tumores miden un volumen medio de 100 mm3, los ratones (6 por grupo) fueron tratados con cisplatino (3,5 mg /kg, 2 veces a la semana) o PBS durante 21 días. Los tumores se midieron con calibradores. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm3) = 0,5 * Longitud (mm) * Ancho (mm) * Ancho (mm)
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como. media ± desviación estándar (SD). Los experimentos se realizaron al menos por triplicado. Las comparaciones se realizaron con la prueba t de Student de dos colas o ANOVA. Un valor de
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Klotho expresión se redujo reguladas en las células cisplatino-resitant
Para confirmar la resistencia de las células A549DDP y H460DDP, ensayo de MTT se realizó para medir la IC50 de células A549 y células A549DDP. Los resultados mostraron la IC50 fue de 17,7 ± 1,93 M en células A549 y 86,6 ± 13,2 M en las células A549DDP, mientras H460DDP y su línea de célula madre fueron 63,5 ± 3,8 y 27,7 ± 2,0, respectivamente (Figura 1A). La expresión de Klotho se determinó mediante PCR en tiempo real y el ensayo de transferencia Western. El nivel de mRNA relativa de cloto en células A549DDP era aproximadamente 35% menor que en las células A549 (Fig 1B). ensayo de transferencia Western mostró la misma tendencia en la expresión de la proteína de cloto en ambas líneas celulares (Fig 1C). Por otra parte, hemos identificado la expresión de Klotho y IC50 en otras líneas celulares, incluyendo H1299, PC-9, H1650 y MCF-7 (figura 1C), y hemos encontrado que las expresiones Klotho endógenos se relacionaron negativamente con la sensibilidad cisplatino (figura 1C) , y el análisis estadístico demostró una relación inversa entre expresiones Klotho y IC50. Por lo tanto, se especuló que no había relación entre la expresión cloto y la resistencia al cisplatino y la expresión cloto podría contribuir a la resistencia
A:. Dos líneas de células tratadas con cisplatino mostraron diferencia en la IC50. B: Quantitative RT-PCR para la detección de la expresión de Klotho en células A549 y células A549DDP. C: análisis de transferencia de Western de la expresión cloto en un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón entre ellos dos variantes resistentes a cisplatino y una línea celular de cáncer de mama (MCF-7). expresión Klotho es mayor en H460 parental, y las líneas celulares A549, en comparación con las variantes resistentes a cisplatino. mayor expresión Klotho también se detectó en H1299, PC-9, H1650 y MCF-7 líneas celulares. GAPDH sirvió como referencia interna. La detección se realizó por triplicado y los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05) guía empresas
La sobreexpresión de la cloto podría inhibir la vía de señalización Akt e inducir la apoptosis de las células A549 /DDP
Para determinar el papel de la cloto en el cisplatino-resistencia de las células resistentes al cisplatino, se detectó por primera vez la expresión de p-AKT en el A549, H460 y sus células resistentes a cisplatino. Los resultados demostraron que la expresión de Akt fosforilada se redujo significativamente en las células A549 y H460 (Fig 2A). A continuación, se prepararon las células cancerosas con cloto sobre-expresión. Como se muestra en la Figura 2C, las expresiones de proteínas de cloto en ambas líneas celulares se incrementaron notablemente después de la transfección. El efecto de la cloto sobre-expresión de la resistencia de las células A549 /DDP y H460 /DDP al cisplatino se determinó mediante el ensayo de MTT. Los datos se muestran en la Figura 2B. La proliferación de las células transfectadas con cloto se suprimió significativamente en comparación con el grupo control. Los IC50 medias fueron inferiores en células transfectadas Klotho lo que implica que estas células fueron más sensibles a cisplatino. Por otra parte, la expresión de Akt fosforilada se relacionó negativamente con la expresión cloto, las células con sobreexpresión cloto mostraron una disminución en la expresión de Akt fosforilada en comparación con el grupo control (Figura 2C). A continuación, se detectó la apoptosis de las células sometidas a transfección cloto. DAPI tinción es un método para detectar la apoptosis. En apoptosis morfológicamente presentarán las características de la apoptosis siguientes DAPI: condensación nuclear brillante y cuerpos apoptóticos perinuclear. La citometría de flujo es una técnica para el recuento, el examen y la clasificación de partículas microscópicas suspendidas en una corriente de fluido. Se permite el análisis multiparamétrico simultáneo de las características físicas o químicas de las células individuales que fluyen a través de un aparato electrónico de detección, y se utiliza comúnmente para la detección de apoptosis. ensayo de transferencia Western reveló que la expresión de Bax y Bcl-2 tenía las mismas tendencias a las de citometría de flujo y tinción DAPI (Fig 2D). La tinción DAPI mostró que el número de células apoptóticas con cloto sobre-expresión se aumentó de manera espectacular en comparación con los sometidos a transfección con el plásmido blanco, pero la apoptosis de las células tratadas con el plásmido blanco era comparable a la del control (Fig 2E). Citometría de flujo El análisis mostró la apoptosis de las células transfectadas con A549DDP cloto era 47%, mientras que H460DDP era 19,8%, lo que significa que eran más sensibles a cisplatino en comparación con los controles negativos (Fig 2F). Estos resultados sugirieron que cloto podría aumentar la sensibilidad de las células resistentes a cisplatino al cisplatino mediante la elevación de la apoptosis de una manera dependiente de Akt
A, B:. Ensayo de transferencia Western mostró la expresión de P-Akt fue significativamente mayor en las células resistentes a cisplatino. C: ensayo de MTT mostró una gran disminución de la IC50 de células transfectadas Klotho. D: ensayo de transferencia Western mostró la elevada expresión de Klotho en células resistentes a cisplatino. la expresión de P-Akt se había reducido regulado en las células resistentes a cisplatino después de la transfección cloto. GAPDH sirvió como referencia interna. El experimento se realizó por triplicado y los datos se presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05) guía empresas
Además, se determinó el fenotipo de las células resistentes a los medicamentos y las células madre, y se encontró que ERCC1 se había reducido regulado en las células transfectadas Klotho, mientras que el P-gp, un gen relacionado con el flujo de salida de drogas, y contribuyó a la resistencia más cisplatino, no se vio afectada por la cloto (figura 2C). Estos resultados implicaban que cloto puede afectar a la reparación de las células a través de ERCC1 para alterar la resistencia de las células del cáncer en lugar de aumentar el eflujo dependiente de energía del fármaco hidrófobo.
Klotho desmontables inhibido apoptosis y aumento de la resistencia al cisplatino en A549 /células DDP
Para investigar más a fondo el papel de Klotho en la resistencia de las células a la quimioterapia, desmontables cloto se llevó a cabo en las células A549DDP y H460DDP con shRNAs específica. Cuatro shRNAs fueron diseñados y se transfectaron en células A549DDP o H460DDP como se describe en nuestro estudio previo en el que los resultados demostraron que el SH-2 mostró la mejor eficiencia de la interferencia [9]. En este estudio, se empleó sh-2 en los siguientes experimentos. Como se muestra en la Figura 3B, ensayo de transferencia Western demostró la expresión de Klotho fue significativamente las reguladas por alrededor del 50% en comparación con el grupo de control negativo en ambas líneas celulares. posteriormente Exploramos el efecto de la caída cloto de la sensibilidad de las células resistentes al cisplatino en el que se empleó el ensayo de MTT para examinar la IC50 de células A549DDP y H460DDP (Fig 3A). Los resultados mostraron la IC50 de células transfectadas shRNA tenía un aumento pronunciado en la IC50 en comparación con el grupo de control negativo. Especialmente en las células A549DDP, la IC50 medio de células transfectadas shRNA fue 452.5 ± 20.69 M (figura 3A)
A:. El ERCC1 y los niveles de la proteína P-gp en células resistentes a cisplatino fueron identificados por western blot. B: A549DDP y H460DDP células fueron transfectadas con cloto shRNA específico o revueltos ARN como un control negativo. ensayo de MTT mostró un aumento de IC50 de células transfectadas con shRNA. C: ensayo de Western blot confirmó la expresión cloto se había reducido regulado en las células después de la transfección con shRNA. D: El p-Akt también se detectó mediante un ensayo de western blot. Los resultados mostraron la expresión de p-Akt fue significativamente hasta reguladas siguiente shRNA transfección. GAPDH sirvió como referencia interna. El experimento se realizó por triplicado y los datos wer presentan como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05) guía empresas
Además, la expresión de Akt-total, fosfo-Akt (p-Akt), Bax y Bcl. -2 se examinaron en las células transfectadas cloto shRNA. ensayo de transferencia Western mostró que la caída cloto condujo al aumento significativo en la expresión de fosfo-Akt (Fig 3C) y bcl-2, pero la disminución pronunciada en la expresión de Bax (una proteína pro-apoptótica) (Fig 2D). DAPI tinción reveló la apoptosis de las células sometidas a transfección se shRNA marcadamente reducida demostrado por microscopía en comparación con las células que reciben la transfección con scramble shRNA (Fig 2E). La citometría de flujo mostró la apoptosis de las células fue de 0,2% en A549DDP y 0,1% en H460DDP comparación con las células transfectadas con scramble (Fig 2F). Estos resultados demostraron que la cloto baja regulación disminuye la apoptosis a través que conduce al desequilibrio en la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis (Bax y Bcl-2).
Aumento de la resistencia después de la cloto baja regulación fue atenuada por la inhibición de Akt con LY294002
para explorar más a fondo si cloto podría mejorar la resistencia de las células resistentes a cisplatino a cispaltin través de la regulación de la expresión de p-Akt, las células transfectadas con shRNA cloto específica fueron tratados con 10 mM y 40 mM LY294002, un phosphoinositide- 3 inhibidor de la quinasa, para dilucidar el papel de Akt en el aumento de la resistencia a la quimioterapia siguiente knockdown cloto. LY294002 inhibió significativamente la expresión de p-Akt en las células transfectadas shRNA, especialmente después del tratamiento con 40 M LY294002 (Fig 4A), en comparación con el grupo de control negativo. Después, se usó un ensayo MTT para determinar la sensibilidad de estas células a cisplatino. Como se muestra en la figura 4B, el IC50 de las células A549DDP tratados con LY294002 a 10 mM y 40 mM era 92.97 ± 10.04 mu M y 50,52 ± 5,63 mM, respectivamente, que eran marcadamente menor que en el grupo control (452,5 ± 20,69 M; P & lt; 0,01), y los mismos cambios se observaron en las células H460DDP. Por lo tanto, 40 M LY294002 se utilizó en los siguientes experimentos. Como se muestra en la figura 2D, Bax, una proteína pro-apoptótica, fue significativamente hasta reguladas en las células sometidas a tratamiento LY294002 en comparación con las células sin tratamiento con el inhibidor de PI3K /Akt. Por el contrario, la expresión de bcl-2 fue significativamente reguladas por LY294002 después del tratamiento. Por otra parte, tinción con DAPI y citometría de flujo (Fig 2E, F) mostraron los mismos resultados. Estos resultados sugirieron que cloto podría aliviar la resistencia de las células cancerosas a agentes quimioterapéuticos mediante la regulación de la apoptosis de una manera PI3K /Akt vía de señalización dependiente
A:. A549DDP y las células transfectadas con H460DDP shRNA fueron tratados con LY294002 (10 y 40 M). Western blot demostró que LY294002 podría reducir significativamente la expresión de p-Akt, especialmente después del tratamiento con 40 mM LY294002. B: Las células transfectadas con shRNA se trataron con LY294002 a diferentes concentraciones, y el ensayo de MTT se realizó para medir la IC50. C: proteínas relacionadas con la apoptosis, Bax y Bcl-2, fueron detectados. Los resultados mostraron cloto sobreexpresión podría aumentar la relación Bax /Bcl-2, mientras que la caída cloto disminuyó ella. LY294002 podría revertir la disminución en la proporción siguiente shRNA transfección. GAPDH sirvió como referencia interna. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos presentados como media ± desviación estándar (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) guía empresas
Klotho caída
in vivo
aumentó significativamente la resistencia de la. las células de cáncer de pulmón a cisplatino
con base en la
in vitro
experimento de Klotho en el cisplatino resistencia de los cánceres de pulmón, hemos examinado aún más si la expresión cloto afecta a la sensibilidad cispaltin
in vivo
, se inyectaron células A549DDP-lenti-SH-2 y A549DDP-lenti-scramble por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. El cisplatino podría inhibir significativamente el crecimiento del tumor en ratones inyectados con células A549DDP-lenti-scramble en comparación con el control de tampón fosfato, sin embargo, los ratones inyectados con células A549DDP-lenti-SH-2 no mostraron significativamente la inhibición en comparación con el grupo de control (Fig 5A) . Western blot indicó, además, que la expresión de Klotho en A549DDP-lenti-SH-2 tumores sólidos era débil, mientras que fue positiva en el tumor sólido control de mezcla aleatoria. resultados similares con los
in vitro
estudios en fueron identificados en la expresión de p-Akt (Figura 5B). Estos hallazgos sugieren que la cloto contribuye a la resistencia a cisplatino en células de cáncer de pulmón en modelos de xenoinjertos de tumores, y PI3K /Akt participó en el procedimiento
A:. La apoptosis de las células analizadas por citometría de flujo. B: La apoptosis de las células se realizó por tinción con DAPI. cromatina condensada fue examinado por un microscopio de fluorescencia. C:
En vivo
ensayo de la quimio-resistencia de las células Klotho desmontables. se muestran los volúmenes tumorales de xenoinjerto en ratones tratados con cisplatino o solución salina fisiológica. El volumen del tumor se presenta como la media ± desviación estándar. D:. La expresión de Klotho y p-Akt en el tejido tumoral de los ratones
Discusión
La resistencia de las células cancerosas a la quimioterapia ha sido uno de los mayores desafíos en el tratamiento clínico de los cánceres. En nuestro estudio anterior, los resultados demostraron que la nueva anti-envejecimiento cloto gen fue crucial para la proliferación y la apoptosis de las células de cáncer de pulmón (células A549), principalmente a través de la inhibición de la vía de IGF-1 /R [9]. Akt, una serina /treonina quinasa, juega un papel importante en la oncogénesis [13] - [15], y la expresión alterada de Akt se ha observado en diversos cánceres humanos [16] - [18]. Akt es también una proteína de aguas abajo clave de IGF-1 vía /R. aumento de la evidencia apoya que Akt está implicado en la resistencia de las células cancerosas a la quimioterapia y la radioterapia [18], [19]. Recientemente, varios estudios han identificado que la inhibición de la activación de Akt puede reducir la supervivencia de las células y mejorar la resistencia a cisplatino [20], [21]. Se ha informado de que Akt está involucrado en cisplatino resistente en varios tipos de cáncer [22] - [24]. Una vez activado PKB /Akt es fosforila y activos se dirigen a las proteínas que participan en muchas funciones celulares diferentes, que abarcan la progresión del ciclo celular, la supervivencia celular, la biogénesis de ribosomas, la traducción de proteínas y la motilidad celular 25-27. Klotho se encontró por primera vez en 1997 como un gen supresor de envejecimiento-putativa en ratones que extenderse la expectativa de vida cuando se sobreexpresa e indujo un síndrome de envejecimiento prematuro cuando falla [5]. Desde el cloto puede inhibir el IGF-1 vía /R señalización en nuestro estudio anterior, y la autofosforilación de IGF-1R induce la activación de Akt por fosforilación, la hipótesis de que la cloto podría aliviar la resistencia de las células de cáncer de pulmón (A549DDP y células H460DDP) a agentes quimioterapéuticos en el que Akt juega un papel importante.
en el presente estudio, se emplearon las células NSCLC resistentes a cisplatino (A549DDP y células H460DDP) y sus células madre (células A549 y H460) para los experimentos. En primer lugar, la expresión cloto se midió en ambas líneas celulares, y los resultados mostraron la expresión cloto tanto en los niveles de proteína en las células resistentes a ARNm y se redujo significativamente en comparación con las células parentales (P & lt; 0,05). Sin embargo, la expresión de p-Akt en las células resistentes a cisplatino era significativamente mayor que en las células de los padres. Además, los altos IC50 se redujeron significativamente en A549DDP y células H460DDP después cloto regulación. Sin embargo, cloto baja regulación por transfección con shRNA específica aumentó la resistencia a cisplatino, acompañado por un aumento en la expresión de P-Akt. Estudios previos han identificado Akt como una proteína importante en el IGF-1 de la supervivencia celular mediada por [28]. Constitutivamente, la activación de Akt impide la apoptosis inducida por la matriz extracelular [29]. Hay 2 principales mecanismos de resistencia a los fármacos en las células: en primer lugar, diferentes cambios en las células que afectan a la capacidad de los fármacos citotóxicos para matar las células, incluyendo las alteraciones en el ciclo celular, la actividad de reparación del ADN mejorada, vía de la apoptosis defectuoso, el metabolismo alterado de fármacos, etc; segundo, el aumento de flujo de salida dependiente de la energía de fármacos hidrófobos, representados por la sobreexpresión de una familia de transportadores dependientes de la energía, conocidos como de unión a ATP transportadores de casete, como la P-glicoproteína (P-gp) [30]. ERCC1 (grupo de reparación por escisión de complementación cruzada 1) es un factor limitante en la reparación por escisión de nucleótidos, elimina aductos de ADN y reparación de ADN de doble filamento se rompe [31], [32]. Los altos niveles de ERCC1 se correlacionan con la resistencia a la quimioterapia basada en cisplatino en pacientes con NSCLC [33], [34]. P-gp fue el primer transportador ABC humano descubierto, y fue codificada por el gen MDR1 [35]. P-gp es uno de los transportadores transmembrana más clínicamente importantes y juega un papel importante en la resistencia a los medicamentos. Para identificar el mecanismo subyacente de la resistencia de nuestras células, hemos explorado aún más las proteínas ERCC1 y P-gp en las células transfectadas, y se encontró que ERCC1 se redujo significativamente en las células Klotho transfectadas en comparación con los controles negativos, sin embargo, no significativa se observaron diferencias en la expresión de P-gp. Estos resultados demostraron que la cloto influyó en la resistencia de las células de cáncer de pulmón a cisplatino, que se relaciona con la vía de señalización de PI3K /Akt. Además, cloto podría modular la actividad de reparación del ADN mediante la regulación de ERCC1, a continuación, cambiar la resistencia de las células cancerosas. En el presente estudio, para investigar profundamente la función de Akt en la resistencia de las células, se encontró que la inhibición de Akt por su inhibidor específico (LY294002) redujo la elevada IC50 siguiente cloto shRNA transfección acompañado de una reducción de la expresión de p-Akt. Para identificar los resultados
in vitro
, se realizó un
in vivo
experimento en ratones desnudos. Se encontró que la disminución de la eficacia antitumoral
in vivo
se asoció con la inhibición de la expresión de Klotho y la vía PI3K /Akt activado. Estos resultados confirmaron que la cloto, un gen anti-envejecimiento, podría aliviar la resistencia de A549DDP y H460DDP al cisplatino mediante la inhibición de la vía de señalización Akt.
La regulación de la apoptosis es complicado y una serie de genes que están involucrados en este proceso, incluyendo Bax /Bcl-2, proteínas de células de regulación, etc [36]. Nuestro estudio mostró que la relación de Bax /Bcl-2 se incrementó dramáticamente después de la cloto sobre-expresión en células resistentes a cisplatino, mientras que la caída cloto esta relación disminuyó acompañada por la inhibición de la vía de señalización Akt. Esto fue consistente con la tendencia de la expresión de p-Akt y IC50.