Extracto
Objetivo
En este estudio, hemos explorado el uso de alta intensidad mecánica ultrasonidos focalizados (HIFU-M) como terapia neoadyuvante antes de la resección quirúrgica del tumor primario . También se investigó el papel de transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) en M-HIFU provocó respuesta inmune anti-tumor utilizando un modelo de tumor de trasplante de cáncer de próstata.
Métodos
RM- 9, una línea celular de cáncer de próstata de ratón con STAT3 constitutivamente activado, se inoculó por vía subcutánea en ratones C57BL /6J. Los ratones portadores de tumor (con un diámetro máximo de tumor 5~6 mm) fueron tratados por M-HIFU o exposición simulada dos días antes de la resección quirúrgica del tumor primario. Después de la recuperación, si no se observó recurrencia del tumor en 30 días, se realizó la reexposición tumor. Se evaluó el crecimiento de la respuesta inmune tumor puestos a prueba nuevamente, la tasa de supervivencia y anti-tumor de los animales.
Resultados
No recurrencia del tumor y la metástasis distante se observaron en ambos grupos de tratamiento que emplean M-HIFU + cirugía y cirugía sola. Sin embargo, en comparación con la cirugía sola, M-HIFU combinada con la cirugía se encontraron para inhibir significativamente el crecimiento de tumores reexponerse, regular a la baja actividad STAT3 intra-tumorales, aumentar las células T citotóxicas en el bazo y el drenaje del tumor ganglios linfáticos (TDLNs), y mejorar la supervivencia de acogida. Además, M-HIFU combinada con la cirugía fue encontrado para disminuir significativamente el nivel de inmunosupresión con forma concomitante aumento del número y actividad de las células dendríticas, en comparación con la cirugía sola.
Conclusión
Nuestros resultados demuestran que M -HIFU puede inhibir la actividad STAT3, y cuando se combina sinérgicamente con la cirugía, puede proporcionar una nueva y prometedora estrategia para el tratamiento de los cánceres de próstata
Visto:. Huang X, Yuan F, M Liang, lo HW, Shinohara ML , Robertson C, et al. (2012) M-HIFU inhibe el crecimiento tumoral, suprime la actividad STAT3 y mejora la inmunidad específica del tumor en un modelo de trasplante tumoral de cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (7): e41632. doi: 10.1371 /journal.pone.0041632
Editor: R. Mitsunobu Kano, Universidad de Tokio, Japón
Recibido: 24 Febrero, 2012; Aceptado: 22 Junio 2012; Publicado: 24 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud a través de subvención #: 5R21CA135221-02 (http://www.nih.gov/), por una beca SPORE pre-cáncer de próstata del Centro de cáncer de Duke integral, por una subvención del Departamento de Defensa ( PC100266), con una donación de la Fundación preocupación y por una beca de la Fundación Morris. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más común en hombres con cerca de 230.000 casos diagnosticados anualmente en los Estados Unidos [1]. Entre las diversas estrategias de tratamiento utilizadas clínicamente, prostatectomía sigue siendo la primera opción curativa para pacientes con cáncer de próstata [2], [3]. Sin embargo, la cirugía no es adecuado para el tratamiento de metástasis a distancia y por lo tanto a menudo se emplea en concierto con radiación y /o quimioterapia en pacientes con cáncer de próstata avanzado. Mientras que la radiación y la quimioterapia después de la cirugía suele ser útil, puede que no sean aplicables a todos los pacientes en función de la etapa del cáncer y la tolerancia del paciente. Además, la presencia de barrera sangre-próstata dificulta el suministro de agentes quimioterapéuticos a las células de cáncer de próstata [4]. Más importante aún, la baja especificidad de la radiación y la quimioterapia en la orientación de las células cancerosas a menudo conducen a efectos secundarios significativos. Por lo tanto, es altamente deseable combinar la cirugía con una terapia dirigida a nivel local, tales como la alta intensidad de ultrasonido enfocado (HIFU, también conocido como de alta intensidad de ultrasonido terapéutico, HITU) que es bien tolerado por los pacientes, para erradicar el tumor primario mientras que proporciona el beneficio adicional en la supresión de la recurrencia del tumor y metástasis a distancia.
en la última década, HIFU ha surgido como una modalidad de tratamiento no invasivo prometedor para tumores sólidos benignos y malignos localizados [5]. extensos estudios clínicos de los animales y han demostrado que HIFU es muy adecuado para la ablación térmica de tumores en fase inicial localizados y para terapia de rescate tras el fracaso del tratamiento previo de la radiación o la quimioterapia [6] - [8]. Por enfocar un haz de ultrasonido de alta intensidad en una región bien definida dentro de un paciente, la energía acústica de convergencia puede ser absorbida por el tejido tumoral objetivo, resultando en una elevación rápida de la temperatura por encima de 65 ° C en unos pocos segundos, lo que lleva a la necrosis coagulativa de células [9] - [11]. Por otra parte, cuando HIFU se utiliza en un modo pulsado con ciclo de trabajo bajo (& lt; 2%) a través de un proceso conocido como HIFU mecánico (M-HIFU), se puede producir no térmico, el daño mecánico del tejido tumoral a través de cavitación acústica [ ,,,0],12]. Estos atributos hacen HIFU una terapia inherentemente no invasivo, no ionizante que es generalmente bien tolerado por los pacientes. A diferencia de la radiación y la quimioterapia, el tratamiento con HIFU puede ser administrado repetidamente sin aumentar el riesgo de toxicidad sistémica [5].
Además de la ablación térmica de los tejidos tumorales, HIFU se ha demostrado para desencadenar una respuesta inmune anti-tumor tanto en ratones portadores de neuroblastoma [9] y en pacientes con tumores sólidos en etapa tardía [13]. Se ha sugerido que los desechos tumor ablación HIFU-y antígenos asociados a tumores residuales pueden estimular las células dendríticas (DC) y la activación de células T posterior, lo que lleva al desarrollo de respuestas inmunes anti-tumorales [14], [15]. Esta hipótesis está apoyada por varios estudios clínicos que muestran el aumento de la citotoxicidad de linfocitos, la mejora de la tasa de supervivencia, y la reducción de la recurrencia del tumor y metástasis a distancia [16].
En comparación con HIFU convencional que se basa principalmente en la ablación térmica, hemos demostrado previamente que M-HIFU puede inducir la liberación de más fuerte de las señales de peligro endógenos [17], mejorar los linfocitos T citotóxicos (CTL) actividades [12] con reducida metástasis a distancia [18] y DC. A pesar de estas observaciones alentadores, la respuesta inmune anti-tumor en general provocada por HIFU es todavía insuficiente, presumiblemente debido a la tolerancia inmune desarrollado durante la tumorigénesis [19], en el que el transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) se ha demostrado que desempeñan una papel crítico [20] - [22]. STAT3 es conocido por ser activado por citoquinas inmunosupresoras, tales como IL-10, que a su vez puede mejorar aún más la expresión de IL-10. Además, activado STAT3 (p-STAT3 /Y705) inhibe la expresión de citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-12 [23] e induce la expresión de Foxp3, un factor de transcripción esencial para las células T reguladoras (Treg) desarrollo [24] . A pesar de STAT3 se ha demostrado que desempeñan un papel fundamental en la tumorigénesis y en la tolerancia inmune, su papel en la M-HIFU suscitó respuestas anti-tumorales no se ha investigado.
En este estudio, hemos explorado la estrategia de usar M -HIFU como terapia neoadyuvante antes de la resección quirúrgica del tumor primario de próstata para evaluar los efectos de esta nueva terapia de combinación en el tumor recidiva local y metástasis a distancia. En particular, nos centramos en el papel de STAT3 en la modulación de las respuestas inmunitarias antitumorales inducidas por HIFU. Nuestros resultados muestran que, en comparación con la cirugía sola, la combinación de M-HIFU y la cirugía podría inhibir significativamente la recurrencia del tumor, suprimir el crecimiento de tumores reexponerse tiempo que mejora la tasa de supervivencia. Por otra parte, estas observaciones fueron corroborados por la actividad de p-STAT3 reducida con forma concomitante aumento de la respuesta anti-tumor. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la M-HIFU en combinación con la cirugía puede proporcionar una nueva opción terapéutica en el tratamiento del cáncer de próstata.
Resultados
M-HIFU se desintegra RM-9 tejidos tumorales, inhibe el crecimiento del tumor, y la mejora de la supervivencia anfitrión
la figura 1A muestra imágenes de ultrasonido en modo B representativas del tumor RM-9 durante el tratamiento con HIFU-M. El foco del transductor HIFU se destacó por un símbolo de la cruz. El tratamiento M-HIFU se inició en el centro y progresó con mm paso 1 hacia el límite del tumor. Se utilizó un margen de seguridad de al menos 1 mm durante el tratamiento con HIFU para evitar daños en la piel adyacente, músculo y hueso. Después de cada exposición, se pudo observar un punto brillante de hiperecogenicidad (indicado por flechas en los paneles superiores), correspondiente a la producción de burbujas de cavitación de inercia en el tejido del tumor [12]. Debido a HIFU pulsado con un ciclo de trabajo bajo de 2% se utilizó en M-HIFU, la temperatura resultante en el tejido del tumor fue de menos de 45 ° C después de un 20-s exposición. Por lo tanto, efecto térmico era insignificante. El examen de los tejidos tumorales extirpados desintegración de tejido tumoral y la formación de cavidades que son característicos de la lisis mecánica producida por las burbujas de inercia en la región tratada HIFU reveladas (panel inferior derecho de la Figura 1A).
A,
de imagen guiada por ultrasonido M-tratamiento HIFU. actividades de cavitación inducida por la M-HIFU en el tejido tumoral se muestran en regiones con hiperrefringencia, indicado por las flechas en las imágenes en modo B (panel superior) y en los tumores extirpados (panel inferior izquierdo:. la piel en la parte superior del tumor estaba intacto después del tratamiento con HIFU-M; media: tumor extirpado muestra la superficie exterior intacto después del tratamiento con HIFU-M; derecha:. dividido en dos tumores que presentan lesiones mecánicas en la región interior después del tratamiento con HIFU-M
B Opiniones, curva de crecimiento del tumor posterior reexposición . 2 × 10
4 RM-9 células fueron inyectadas por vía subcutánea en la extremidad posterior contralateral 30 días después del tratamiento M-HIFU cuando los ratones fueron totalmente recuperados de la resección quirúrgica del tumor primario. el volumen de los tumores puestos a prueba nuevamente se calculó basándose en mediciones del tamaño del tumor en intervalos de 3 días a partir del día 7 después de la reexposición del tumor pinza * p & lt;. 0,05, ** p & lt;.. 0,01
C, España curva de supervivencia acumulativa reexposición siguiente ratones portadores de tumores que alcanzaron el objetivo humana eran sacrificados. Hubo 10 ratones en el grupo de cirugía y 12 en el grupo de cirugía HIFU +. P-valor de 0,019 se determinó mediante la prueba de log-rank. Los datos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes.
Dos días después del tratamiento M-HIFU, los tumores primarios fueron resecados de los ratones en ambos grupos. Este retardo de tiempo se seleccionó en base a nuestra observación anterior de que M-HIFU 2 días antes de la resección quirúrgica del tumor primario se puede reducir significativamente el riesgo de metástasis a distancia en un modelo de melanoma murino [18]. Seguimiento de observación en los próximos 30 días no mostró recurrencia local del tumor, presumiblemente como resultado de la eliminación rigurosa y completa de los tejidos tumorales por medio de cirugía. En este momento, la reexposición tumor se realizó y el crecimiento de los tumores reexponerse fue seguido por otros 30 días. Como se muestra en la Figura 1B, hay una clara separación en las curvas de crecimiento con los tumores puestos a prueba nuevamente en el grupo de cirugía M-HIFU + significativamente más pequeños que los que están en el grupo de cirugía. Las diferencias significativas en el volumen tumoral entre los dos grupos se observó a partir del día 10 hasta el final del período de seguimiento.
Tras la reexposición, no hay animales murieron. Los ratones con tumores reexponerse solamente se sacrificaron cuando se alcanzaron los puntos finales para el crecimiento del tumor. Los tejidos pulmonares se recogieron y se examinan bajo un microscopio de disección, pero no se observó nódulo metastásico. Cuando se realizó la cirugía, se encontraron RM-9 nódulos tumorales estar bien rodeado por una cápsula de tejido conectivo, lo que indica una posible causa de la ausencia de metástasis a distancia. Se encontró que la supervivencia acumulada en el grupo de cirugía M-HIFU + para ser estadísticamente más alta que en el grupo de cirugía (Figura 1C), lo que indica un tumor potencial efecto de M-HIFU en combinación con la resección quirúrgica del tumor primario suprimir.
cáncer de próstata RM-9 células expresan constitutivamente p-STAT3, que puede reducirse mediante el tratamiento con HIFU M-
fosfo-STAT3 (Y705), la forma activada de STAT3, juega un papel clave en la obtención de la vigilancia inmune, desarrollo tumoral y la metástasis del tumor [20], [22], [25]. Por lo tanto, la inhibición o la demolición de STAT3 activa es de interés tanto para el tratamiento anti-tumor directa y la inmunoterapia específica del tumor. Antes de dilucidar el papel de M-HIFU en la activación de STAT3, se examinaron varias líneas de células tumorales para la actividad STAT3 y se encontró que un alto nivel de p-STAT3 se expresó en células RM-9. Como se muestra por IF tinción y microscopía de fluorescencia (Figura 2A), casi todas las células RM-9 se tiñeron positivamente para p-STAT3, como se indica por las señales combinadas de color rosa (flechas). Este
in vitro
observación se confirmó aún más
in vivo
. Como se muestra en la Figura 2B, se examinaron RM-9 tumores recogidos en tres momentos diferentes (10, 15, y 20 días después de la inoculación) para p-STAT3 usando IHC y los resultados indican la activación de STAT3 constitutiva en tumores RM-9 durante los 20 días de desarrollo del tumor. Estas observaciones también indican que la RM-9 células y los tumores son ideales para examinar los efectos de la M-HIFU en la actividad STAT3.
A, España Expresión de p-STAT3 en células RM-9. células RM-9 fueron sometidas a tinción SI para p-STAT3 y tinción DAPI de los núcleos. Bajo microscopía de fluorescencia, p-STAT3 fue marcado por fluorescencia de color rojo mientras que los núcleos se marcaron mediante señales azules. Los núcleos de p-STAT3-positivos fueron indicados por las señales de color rosa fusionadas. Las flechas continuas señalan a los núcleos de p-STAT3-positivas representación, mientras que la flecha de trazos marca un núcleo de p-STAT3-negativo.
B, Patrón de expresión Red de p-STAT3
in vivo. Hotels, RM-9 tumores fueron retirados en tres momentos diferentes, como se indica en desarrollo y sometido a la tinción IHC para p-STAT3. Después counterstained por hematoxilina, núcleos p-STAT3-positivos fueron indicados por las señales de color marrón oscuro (flechas), mientras que los núcleos de p-STAT3-negativos fueron en azul.
C, España disminución de los niveles de p-STAT3 en la RM-9 tumores después del tratamiento M-HIFU. Dos días después del tratamiento M-HIFU, RM-9 tumores se retiraron y se sometieron a tinción IHC para P-STAT3. Tres tumores en cada grupo se analizaron y se muestran las cifras representativas. La IHC se realizó de forma independiente por tres veces. Los datos se presentan como media ± desviación estándar.
t-test se realizó
del estudiante para determinar los valores de p. * P & lt; 0,05.
D, España expresión baja regulación de los tres genes diana aguas abajo STAT3 por el tratamiento M-HIFU. Dos días después del tratamiento M-HIFU, RM-9 tumores se retiraron y se aisló mRNA. a continuación, RT-PCR se realizó para detectar los niveles de ciclina D1, Bcl-xL, IL-10 y β-actina. señales de banda se cuantificaron utilizando el software ImageJ NIH. se muestran imágenes representativas de tres experimentos independientes.
A continuación, se evaluaron los efectos de la M-HIFU sobre la activación de STAT3 usando RM-9 ratones portadores de tumores. Dos días después del tratamiento M-HIFU, RM-9 tumores se retiraron de los ratones y se sometieron a p-STAT3 IHC (n = 3 por grupo). Como se demuestra en la Figura 2C, el nivel de p-STAT3 se redujo significativamente en 1,8 veces después de la M-HIFU, lo que indica que la administración de M-HIFU puede inhibir eficazmente la activación de STAT3 en la RM-9 tumores. Además, de acuerdo con la reducción observada de p-STAT3 por M-HIFU, los niveles de expresión de tres genes diana STAT3 se redujeron significativamente por M-HIFU, así, como se indica por los resultados de RT-PCR en la Figura 2D. En conjunto, estos resultados demuestran que la activación de STAT3 se puede detectar en 9 RM-células de cáncer de próstata
in vitro
y
in vivo, España y que M-HIFU reduce los niveles de activación de STAT3 y STAT3- determinados genes en los tumores RM-9.
M-HIFU aumenta la citotoxicidad-tumoral específica
Para investigar si la M-HIFU tratamiento da como resultado el aumento de las respuestas CTL [26], se analizaron alteración en la frecuencia de CD8
+ células T y su producción de IFN-γ, tanto en el grupo de cirugía M-HIFU + y en el grupo de sólo la cirugía. Se encontró que 2 días después de la cirugía el número de CD8
+ T de células se incrementó en el grupo de cirugía M-HIFU + (Figura 3A y B), en comparación con el grupo que tenía la cirugía sola. la producción de IFN-γ-Tumor específico en los anfitriones portadores de tumores se verificó adicionalmente por ensayo ELISPOT. Los esplenocitos se recogieron 12 días después de la cirugía de tres ratones por grupo, y las muestras se agruparon y se co-cultivaron con (células tumorales esplenocitos frente a relación de 10:01) células tumorales EL-4 irrelevantes RM-9 o, a continuación, se analizan para determinar la producción de IFN-γ. M-tratamiento HIFU aumentó significativamente la producción de IFN-γ CTL a 4 veces de la de control no HIFU (p & lt; 0,001) (Figura 3C, D). Esta respuesta elevada no se observó en las células EL-4, lo que indica que la producción de IFN-γ era RM-9 tumor específico por el huésped portador de tumor. Estos resultados sugieren que el tratamiento M-HIFU puede promover la generación de IFN-γ la producción de CTL, uno de los factores más críticos en la inmunidad anti-tumor.
A, página 2 días después del tratamiento, los bazos a partir de tres ratones tratados con o sin M-HIFU se recogieron y se agruparon. Proporción de esplénica CD8
+ células T se determinó mediante citometría de flujo. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran.
B, La significación estadística del aumento de la CD8
+ población celular mediante la combinación con la cirugía HIFU. * P & lt; 0,05
C
, Doce días después de la cirugía o M-HIFU más el tratamiento de la cirugía, tres ratones de cada grupo fueron sacrificados y se recogieron y agruparon sus bazos. ensayo de IFN-γ ELISPOT se realizó con los esplenocitos agrupados. se añadieron mitomicina C tratados RM-9 células como estimuladores en la proporción de 1:10 (RM9: esplenocitos). Células EL-4 se utilizaron como un control celular irrelevante. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran.
D
, Enumeración de células IFN-gamma-positivas y, y el análisis estadístico basado en los resultados del ensayo ELISPOT. *** P & lt;.
0,0001
Tratamiento M-HIFU Aumenta la población de CTL y los países en desarrollo en los bazos y TDLNs
DC son las únicas células profesionales presentadoras de antígeno que puede cebar ingenuo células T, y juega un papel crítico en la generación de CTL específicos de tumores. DCs se puede identificar con la expresión de CD11c como un marcador de superficie celular. Como p-STAT3 es un supresor fundamental de la activación de DC [27], [28], se evaluó la frecuencia de CD11c
+ población de células en el bazo y TDLNs 6 días después del tratamiento M-HIFU en ratones portadores de tumores RM-9 trasplantado . Como se muestra en la figura 4A a 4D, las proporciones de CD11c
+ células se incrementaron significativamente en los bazos y TDLNs a más de 3 veces y 1,2 veces la del grupo control sin tratamiento con HIFU, respectivamente (en ambos casos, p & lt; 0,001 ). También se evaluó la proporción de CD11c
+ células en el punto de tiempo de 2 días después del tratamiento con HIFU-M, pero parecía ser demasiado pronto para observar un aumento de la población CC (datos no mostrados). Además, el tratamiento M-HIFU aumentó la expresión de co-estimuladoras molécula, CD80 y CD86, en países en desarrollo (Figura 4E y 4F). En conjunto, el tratamiento de M-HIFU parece mejorar el reclutamiento y /o expansión de las DC, además de la maduración de DC.
tres ratones de cada grupo se sacrificaron seis días después de la cirugía o HIFU más el tratamiento de la cirugía. suspensión de células individuales se preparó a partir de los bazos agrupados o TDLNs; y CD11c
+ población de células se determinó por citometría de flujo. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran.
Un
,
C
, patrones de flujo representativos en la detección de CD11c
+ en las células del bazo (
Un
) y TDLNs (
C
).
B Opiniones,
D
, la significación estadística en el aumento de la población CC en el bazo (
B Opiniones) y TDLNs (
D
) basado en el resultados de
Un
y
C, España, respectivamente.
E
,
F
, Evaluación de la estimulación DC mediante la detección de CD80-positivo (
E
) y CD86-positivo (
F
) CD11c
+ células de bazo y TDLNs. * P & lt; 0,05, *** p & lt;.
0,0001
M-HIFU respuesta antitumoral mejorada es, en parte, causado por la represión de la célula Treg generación
STAT3 también juega un papel importante en la mejora del desarrollo de las células T reguladoras CD4
+ (Treg) [24]. Tregs inhiben las respuestas inmunitarias y se han implicado en la inducción de tolerancia en la inmunidad anti-tumor. Aquí, hemos tratado de determinar si el tratamiento con HIFU M-suprime la generación o expansión de células T reguladoras en los ratones trasplantados con tumores. Los esplenocitos y células TDLNs se recogieron 6 días después del tratamiento M-HIFU como se mencionó anteriormente para evaluar la frecuencia de células T reguladoras. El resultado se muestra en la Figura 5 reveló que el tratamiento con M-HIFU provocó una disminución sustancial de la población Treg en alrededor de 50% en el bazo (p & lt; 0,001), y aproximadamente 10% en TDLNs (p & lt; 0,001). Similar a la observación de las CD, los cambios en la población Treg no fueron significativamente 2 días después del tratamiento M-HIFU (datos no mostrados). Estos resultados indican que, además de la expansión de la población y el aumento de la maduración DC DC, el tratamiento M-HIFU reducido tamaño de la población de células T reguladoras, que son conocidos por regular negativamente el desarrollo de la inmunidad antitumoral.
Una sola célula suspensión se preparó a partir de los bazos o TDLNs agrupados. Población de CD4
+ Foxp3
+ células se determinó a partir de entonces como Treg mediante citometría de flujo. Las cifras muestran son los representantes de las tres manchas independiente y análisis de flujo subsiguiente.
Un
,
C
, patrones de flujo representativos en la detección de células T reguladoras en el bazo (
Un
) y TDLNs (
C
).
B Opiniones,
D
, Proporción de la población de Treg en el bazo (
B Opiniones) y TDLN (
D
) basado en los resultados que se muestran en
Una
y
C
, respectivamente. ** P & lt; 0,01, *** p & lt;.
0,0001
Discusión
Este estudio se llevó a cabo para obtener una mejor comprensión de los mecanismos por los cuales M-HIFU provoca anti- tumor efectos y para explorar estrategias para el aprovechamiento óptimo de M-HIFU en el tratamiento del cáncer de próstata. Nuestro objetivo a largo plazo es establecer razones para el uso de la terapia de combinación basada en M-HIFU como una modalidad de tratamiento mejorado para los pacientes con cáncer de próstata. En general, nuestros resultados sugieren que la M-HIFU puede inhibir la activación de STAT3, que conduce a una respuesta anti-tumor a través de dos mecanismos potenciales. En primer lugar, la reducción de p-STAT3 en los tumores inhibe directamente el crecimiento del tumor. En segundo lugar, una reducción de la actividad STAT3 conduce a un aumento del número de CTL específicos de tumores y DCS, así como un reducido número de Treg, y después de ello una mejora de la inmunidad anti-tumor.
La activación constitutiva de STAT3 se observa con frecuencia en muchos tumores humanos, incluyendo melanoma, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, glioma y cáncer de próstata [20], [22], [25]. Es bien sabido que persistentemente activa funciones de STAT3 como un regulador clave de eventos moleculares y biológicos que promueven la tumorigénesis [29]. actividad STAT3 aberrante juega un papel central en el crecimiento desregulado y la supervivencia de las células tumorales, así como en la promoción de la angiogénesis. Por otra parte, STAT3 aberrante promueve la invasión y metástasis, lo que contribuye a la progresión del tumor [20], [22], [30]. Durante el curso de la tumorigénesis, la actividad de STAT3 también es elevada en linfocitos asociados a tumores [31], [32]. La inhibición de STAT3 en células tumorales o células mieloides infiltrantes de tumor provoca la respuesta inmune Th1 anti-tumorales, concomitante con un mayor número de CTL y la disminución de células T reguladoras [33]. Por lo tanto, la supresión de la activación de STAT3 por medios físicos (
es decir, España HIFU) o enfoques farmacológicos es de gran interés tanto para el tratamiento antitumoral directa e inmunoterapia específica del tumor.
Sobre la base de la interpretación indicada sobre STAT3, hemos tratado de determinar el efecto de la M-HIFU en la activación de STAT3 en un
in vivo
modelo de trasplante en el cáncer de próstata. De hecho, el nivel de intratumoral p-STAT3 se redujo sustancialmente por el tratamiento de la M-HIFU. En un estudio previo del modelo de trasplante de melanoma B16, el nivel de p-STAT3 se encontró así mismo ser significativamente las reguladas por el tratamiento M-HIFU [34], lo que sugiere los efectos de la M-HIFU en la activación de STAT3 puede ser común en los diferentes tumores.
la baja regulación funcional de p-STAT3 fue verificado por la disminución en la expresión de sus genes diana aguas abajo. Ciclina D1, que es hasta reguladas por STAT3 se activa, es un regulador alostérico de quinasas dependientes de ciclina 4 y 6 (CDK4 /6) y promueve la transición G1 /S a través de la fosforilación mediada por 6 CDK4 /y la inactivación de la proteína retinoblastoma [ ,,,0],32], [35]. La inhibición de la expresión de ciclina D1 retardará el ciclo celular en la fase G1 de entrar en la fase S, y por lo tanto, disminuir significativamente la proliferación de células tumorales [36] - [40]. Bcl-xL, también un gen diana STAT3 importante, es una molécula anti-apoptótica de la familia Bcl-2 y mejora la progresión tumoral [32], [41], [42]. Bcl-xL sobreexpresión se encuentra con frecuencia en un amplio espectro de tipos de cáncer incluyendo el cáncer de próstata [43], [44]. El agotamiento de la expresión Bcl-xL predominante reduce significativamente la viabilidad de las células tumorales después de estímulos apoptóticos [45]. En este estudio, los resultados de la RT-PCR demostraron claramente que la baja regulación de p-STAT3 fue acompañada por la disminución de expresión de ciclina D1 y Bcl-XL en el tejido tumoral después del tratamiento M-HIFU. Estos resultados indicaron que M-HIFU es capaz de inhibir la actividad STAT3 aberrante y por lo tanto puede inducir la detención del crecimiento y la apoptosis de las células tumorales, así como la regresión de cáncer de próstata
in vivo
.
En Además de la intratumoral papel oncogénico, p-STAT3 está implicado en la supresión inmune a través de estimulación interferir DC mediante la inhibición de la expresión de citocinas proinflamatorias y quimiocinas que estimulan DC [28]. Alternativamente, p-STAT3 promueve las células tumorales para producir múltiples citoquinas oncogénicas, tales como IL-10, que a su vez activa la señalización STAT3 a través de un bucle de retroalimentación positiva e inhibe la estimulación DC funcional [28], [32], [33]. estimulación DC es esencial para la presentación de antígeno eficaz y el desarrollo de la respuesta inmune anti-tumor por células T. Nuestros estudios previos utilizando el modelo de tumor MC38 han demostrado que el daño mecánico generado HIFU-de las células tumorales puede conducir a la estimulación DC [17], y, posteriormente, el aumento de las actividades de CTL [12]. En este estudio, se verificó además que M-HIFU puede aumentar la función de las DC
in vivo
, como lo demuestra el aumento de la población significativa de las DC con la expresión concomitante upregulated de moléculas coestimuladoras tales como CD80 y CD86.
Otra función supresora inmune de p-STAT3 se relaciona con su papel en la mejora de la generación de células t reguladoras, que suprimen la respuesta inmune a auto-antígeno incluyendo antígeno asociado a tumor. STAT3 también juega un papel importante en la orquestación de múltiples aspectos críticos de la función de las células T en la inflamación y la homeostasis. En particular, la expresión de Foxp3, que es esencial para las funciones reguladoras de Treg, depende de la activación STAT3 [24]. La inhibición de la actividad STAT3 reduce la conversión de las células T Foxp3-negativos a Tregs asociado a tumor y aumenta CD8
+ infiltración de células T en el tumor - una estrategia que se ha utilizado para inhibir el crecimiento del tumor primario [46]. Del mismo modo, en nuestro estudio, se encontró que el tratamiento M-HIFU para disminuir significativamente la proporción de Treg tanto en bazo y TDLNs, de forma concomitante con la supresión de la actividad STAT3 en esos tejidos. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que M-HIFU puede reducir la tolerancia inmune provocada-Treg en el modelo RM-9.
En resumen, hemos puesto de manifiesto un mecanismo específico para M-HIFU inducida respuesta inmune anti-tumor, que está mediada por la inhibición de la activación de STAT3
in vivo
. Además, hemos encontrado que M-HIFU lleva a cabo en un momento apropiado (es decir, 2 días para RM-9 modelo) antes de la extirpación quirúrgica del tumor primario se puede mejorar la protección del huésped frente a la recurrencia del tumor, y por lo tanto puede aumentar la supervivencia de pacientes de la malignidad del cáncer de próstata. Aunque en este estudio nos hemos centrado en el mecanismo asociado con STAT3, la participación de otros mecanismos de M-HIFU inducido inmunidad anti-tumor también es posible, y se investigó en el futuro. En total, hemos demostrado que M-HIFU es una terapia neoadyuvante prometedor que se puede combinar de forma sinérgica con la cirugía para el tratamiento del cáncer de próstata.
Materiales y métodos
Modelo Animal
C57BL /6J, 6~8 semanas de edad, fueron adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.) y se alojaron en el Duke Vivarium antes y después del tratamiento y /o cirugía M-HIFU. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la política establecida cuidado de los animales y todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Universidad de Duke Institucional Animal Care & amp; Uso Comité.
línea celular y cultivo celular
murino línea celular de cáncer de próstata RM-9, establecida por el Dr. Thompson en el Colegio Baylor de Medicina, fue un regalo del doctor Mouraviev. EL4 línea de células de linfoma de ratón se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio de Eagle modificado completa de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), 2 mM L-glutamina, 50 UI /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ° C con 5% de CO
2.
Los anticuerpos, kits y reactivos químicos
La siguiente kit y anticuerpos fueron adquiridos de eBiosciences (San Diego, CA, EE.UU.): ratón células T reguladoras tinción Set (fjk-16 s), anticuerpos anti-ratón CD8 conjugado con PE, y anti-ratón-CD16 /32 de anticuerpos. APC-conjugado anticuerpo anti-ratón CD11c, conjugado con FITC anti-ratón CD80, y PE-conjugado anti-ratón CD86 eran de BD Bioscience (San Jose, CA, EE.UU.). -STAT3 fosfo anticuerpo (Y705) de conejo anti-ratón fue adquirido de Señalización Celular (Danvers, MA, EE.UU.). kit ELISPOT interferón gamma-ratón era de MABTECH Inc (Cincinnati, OH, EE.UU.). anticuerpo anti-conejo de cabra de Texas Red conjugado se adquirió de Vector Laboratories Inc (Burlingame, CA, EE.UU.). solución del medio con o sin DAPI, solución de bloqueo de montaje, Elite Vectastain ABC Kit (IgG de conejo) y el kit de AEC eran de Vector Lab. sistema de aislamiento de ARN total de SV fue adquirido de Promega (Madison, WI, EE.UU.). enzimas de síntesis de ADN fueron de Invitrogen menos que se indique lo contrario.
Modelo de tumor, el tratamiento con HIFU, la resección quirúrgica y post-operatorio de atención y Medidas
RM-9 modelo de tumor se estableció mediante inyección subcutánea de 8 × 10
4 RM-9 células en la extremidad posterior derecha de ratones C57BL /6J. Los tumores se dejaron crecer durante aproximadamente 7 días hasta que alcanzaron 5~6 mm de diámetro.