Extracto
Antecedentes
El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Radioresistance de cáncer de pulmón de células da como resultado tasa inaceptable de fallo locorregional. Aunque la radiación se sabe que inducen apoptosis, nuestro estudio reciente mostró que desmontables de las proteínas pro-apoptóticas Bak y Bax resultó en un aumento en la muerte celular autofágica y radiosensibilidad cáncer de pulmón
in vitro
. Para explorar más a fondo el potencial de inhibición de la apoptosis como una forma de sensibilizar a cáncer de pulmón para la terapia, hemos probado M867, un producto químico nuevo y reversible inhibidor de la caspasa-3, en combinación con radiación ionizante
in vivo
y
In
vitro.
métodos y las conclusiones
M867 redujo la supervivencia clonogénico en células de cáncer de pulmón H460 (DER = 1,27, p = 0,007) en comparación con las células tratadas tratados con vehículo. Hemos encontrado que la administración de M867 con radiación ionizante en un
in vivo
posterior del ratón modelo de cáncer de pulmón extremidad fue bien tolerado y produjo un retraso en el crecimiento tumoral significativa en comparación con la radioterapia sola. Una disminución dramática en la vasculatura del tumor se observó con M867 y la radiación utilizando factor de von Willebrand tinción. Además, el índice de Ki67 mostró & gt; reducción de 5 veces de la proliferación de tumores en el grupo de terapia de combinación, a pesar de los niveles reducidos de apoptosis observados con desoxinucleotidil transferasa terminal mediada dUTP nick tinción fin de etiquetado. Radiosensibilizador efecto de M867 a través de las caspasas que inhiben fue validado
usando la caspasa-3 /-7-doble knockout (DKO) modelo de ratón de células fibroblastos embrionarios (MEF). De acuerdo con nuestro estudio anterior, la autofagia contribuyó al mecanismo de aumento de la muerte celular, después de la inhibición de la apoptosis. Además, el ensayo de Matrigel mostró una disminución en
in vitro
formación de túbulos endoteliales durante el tratamiento de combinación M867 /radiación.
Conclusiones
M867 aumenta los efectos citotóxicos de la radiación en los pulmones cáncer y su vasculatura tanto
in vitro
y
in vivo
. M867 tiene el potencial de prolongar retraso del crecimiento tumoral mediante la inhibición de la proliferación tumoral. Se necesitan ensayos clínicos para determinar el potencial de esta terapia de combinación en pacientes con cáncer de pulmón localmente avanzado
Visto:. Kim KW, Moretti L, B Lu (2008) M867, un nuevo inhibidor selectivo de la caspasa-3 Mejora La muerte de la célula y se extiende retraso del crecimiento tumoral en modelos de cáncer de pulmón irradiado. PLoS ONE 3 (5): e2275. doi: 10.1371 /journal.pone.0002275
Editor: Mark R. Cookson, National Institutes of Health, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de febrero de 2008; Aceptado: April 17, 2008; Publicado: 28 de mayo de 2008
Derechos de Autor © 2008 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por el Instituto Nacional del cáncer de Estados Unidos (NCI) de Grant 1R01 CA125842-01A1. Los donantes no tuvo ningún papel en el diseño y realización del estudio, en la recogida de datos, análisis e interpretación, y la decisión de publicar, revisión, aprobación, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
cáncer
pulmón es el cáncer más frecuente en todo el mundo, y la principal causa de la mortalidad relacionada con el cáncer a pesar del tratamiento de múltiples modalidades, dando como resultado 160.390 muertes estimadas en los Estados Unidos sólo en el año 2007 [1]. Desde límites de resistencia tumor eficacia de los tratamientos actuales [2], [3], [4], tales como la radioterapia, la identificación de nuevas estrategias terapéuticas es crítica para mejorar el resultado. De los diferentes procesos de muerte celular que participan en el tratamiento del cáncer, la apoptosis ha sido el más bien estudiado [5]. Durante la apoptosis, los principales mediadores de la destrucción celular son efectores caspasa-3 y -7, los miembros de la aspartato cisteína proteasas de la familia, que escinden proteínas después de un residuo de aspartato [6]. Aunque la radiación se sabe que inducen apoptosis, sin embargo, representa una parte menor de muerte celular en tumores sólidos irradiados [7], y nuestro estudio reciente mostró que desmontables de las proteínas pro-apoptóticas Bak y Bax se tradujo en un aumento de la radiosensibilidad cáncer de pulmón
in vitro
[8]. La autofagia, un no-apoptótica tipo de muerte celular, se mostró que contribuir al mecanismo de aumento de muerte celular.
autofagia es un proceso conservado evolutivamente y un mecanismo de supervivencia que permite el reciclaje de los orgánulos y proteínas de larga vida [ ,,,0],9], [10]. La autofagia también sirve como vía de suicidio con total auto-digestión en condiciones de estrés excesivo [11], [12], que se clasifica como muerte celular programada Tipo 2 [9], [10]. Durante la autofagia, la degradación del organelo ocurre a través de la formación de vacuolas de doble membrana citoplasmática, llamados autofagosomas con núcleos intactos [13]. regulación autofagia ha sido de interés creciente, debido a su implicación en la tumorigénesis. Además, la autofagia prolongada puede conducir a la muerte de las células cancerosas, lo que lleva a la hipótesis de que la autofagia puede ser explotado como un objetivo de la terapia del cáncer [14], [15], [16], [17].
Para más explorar el potencial de inhibición de la apoptosis como una forma de sensibilizar a cáncer de pulmón para la terapia, hemos probado M867, una novela química y reversible de la caspasa-3 inhibidor de [18], en combinación con radiación ionizante
in vivo
y
in vitro.
Materiales y Métodos
cultivo de células
fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs primaria) fueron derivados de tipo salvaje (WT) y Caspase3
- /- /7
- /- doble knockout (DKO) ratones y inmortalizada por transfección con un plásmido que contiene SV40 T-antígeno (proporcionado por el Dr. Richard Flavell, Universidad de Yale, New Haven, CT). MEFs se cultivaron en DMEM (Invitrogen Corporation) suplementado con 10% de bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina y 0,5 mol /L 2-mercaptoetanol. células de cáncer de pulmón H460 se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, NY) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C y humidificado 5% de CO2. HUVECs se obtuvieron de Clonetics y se mantuvieron en EBM-2 suplementado con EGM-2 MV alícuotas individuales (BioWhittaker). M867 se obtuvo de Merck & amp; Co., Inc.
Ensayo clonogénico
H460 células de cáncer de pulmón fueron tratados con DMSO o M867 (1.4Nm, 5 nM, 10 nM y por 24 horas); WT células MEFs y caspasa 3/7 células DKO MEFs fueron tratados con DMSO o M867 (5 nM y 10 nM durante 24 horas); y las células MEFs fueron tratados con siRNAs contra la caspasa-3 y 7, siRNAs contra Beclin-1 y ATG5, o control. Las células fueron irradiadas con 0-6 Gy como se indica en una tasa de dosis de 1,8 Gy /min, mediante el uso de un
137 Cs irradiador (J. L. Shepherd y Asssociates, Glendale, CA). Después de la irradiación, las células se incubaron a 37 ° C durante 8-10 días. Las células se fijaron durante 15 min con 3: 1 de metanol: ácido acético y se tiñeron durante 15 min con violeta cristal 0,5% (Sigma) en metanol. Después de la tinción, las colonias se contaron usando un punto de corte de 50 células viables. fracción superviviente se calculó como (media de los recuentos de colonias) /(células inoculadas) × (planchas de eficiencia (PE)), donde se definió como PE (media de los recuentos de colonias) /(células inoculadas para los controles no irradiados). DER se calculó como la dosis (Gy) para la radiación sola, dividido por la dosis (Gy) para la radiación más M867 (normalizado para la toxicidad M867) necesario para una fracción de supervivencia de 0,25. Los experimentos se realizaron por triplicado y la media, SD, y se calcularon los valores de p.
inmunotransferencia
Las células (0,5 × 10
6) fueron tratados con varios Gy y las drogas. Ellos fueron recogidos en varios puntos de tiempo, y luego se lavaron con PBS enfriado en hielo dos veces antes de la adición de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% de NP40, 50 mM NaF, 1 mM de Na3VO4, 1 mM de NaMO4 y cóctel inhibidor (Sigma, 5 ul /ml). la concentración de proteína se cuantificó por el método de Bio-Rad. cantidades iguales de proteína se cargaron en cada pocillo y se separaron por 12,5% de gel de SDS-PAGE, seguido de transferencia sobre membranas de PVDF ( . BIO-RAD) Las membranas se bloquearon mediante el uso 5% de leche en polvo sin grasa en PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente Las transferencias se incubaron después con la caspasa-3 (señalización celular);. caspasa-7 (de señalización de la célula); LC-3 (Médico & amp; Biological Laboratories Co. LTD); anticuerpos y actina durante 1 hora a 4; Akt, fosfo-Akt (Ser-473), la proteína ribosomal S6, y la proteína ribosomal fosfo-S6 (Ser-240/244) (Cell Signaling) . ° C de cabra anti-IgG de conejo secundario (1: 5.000, Santa Cruse Biotecnologías).. se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente inmunotransferencias se desarrollaron usando el sistema de detección de quimioluminiscencia (PerkinElmer) según el protocolo y autorradiografía de la fabricación
Medición de la apoptosis
p>
5) se chapada en 10 mm platos para cada punto de datos. Después de 24 h de incubación a 37ºC, H460 células fueron tratadas con M867 (100 nM durante 2 horas) e inmediatamente irradiaron con 5Gy, 10 Gy o 20 Gy, y WT y Caspase3
- /- /7
- /- DKO las células se irradiaron con 10 Gy o 5Gy. Después de 24 h, las células se trataron con 1 ml de Accutase (manteniendo todas las células flotantes) para 4min y luego contados para cada muestra. Las células se centrifugaron y se re-suspendieron en 1 × tampón de unión a una concentración de ~ 1 × 10
6 células /ml. 100 l de la solución (aproximadamente 1 × 10
5 células) se transfirieron en tubos FACS de 5 ml, se añadió 1,2 l de anexina V FITC y 1,2 l de PI. Después de incubación durante 30 min a TA en la oscuridad, 400 l de 1 × tampón de unión se añadieron a cada tubo. La tasa de apoptosis se midió usando el kit de isotiocianato de fluoresceína V-Anexina detección de apoptosis I (Pharmingen) con citometría de flujo.
autofagia Ensayo
MEFs células se transfectaron con 2,5 g de la expresión de GFP-LC3 plásmido (donación del Dr. Norboru Mizushima) [19] utilizando el reactivo lipofectamina (Invitrogen Life Technologies). Después de 24 h, las células se trataron con 5Gy de la radiación, con o sin dosis M867. Después de 24 h y 48 h, se observó la fluorescencia de GFP-LC3 usando fluoroscopia confocal.
siRNA transfección
siRNAs contra la caspasa-3-ratón y 7, beclin, y siRNA de control se compraron desde Santa Cruz biotecnologías. siRNA ATG5 (ratón) se sintetizó mediante Dharmacon Investigación. Las cadenas con sentido y antisentido de ATG5 se iniciaron en el nucleótido, 5'-AACUUGCUUUACUCUCUCAUCAUU-3 '(sentido) y 3'-UUUUGAACGAAAUGAGAGAUAGU-5'. (Antisentido) Las células fueron transfectadas con 25 nM de siRNAs utilizando Lipofectamine 2000. Las células transfectadas se utilizaron para experimentos 24h más tarde
ensayo de células endoteliales Morphorgenesis:. La formación de túbulos
HUVEC cultivadas a ~ 70% de confluencia fueron tratados con 5 nM M867, 3Gy, o la terapia de combinación. Las células fueron tripsinizadas y contadas. Ellos se sembraron a 48.000 por pocillo en placas de 24 pocillos recubiertas con 300 l de Matrigel (BD Biosciences). Estas células experimentan diferenciación en estructuras tubulares de tipo capilar observadas periódicamente por microscopía. 24h más tarde, las células se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y se tomaron fotografías a través de microscopio. El número medio de los túbulos se calculó a partir examen de tres campos separados microscópicos (100 ×) y fotografías representativas fueron tomadas.
Se utilizaron
evaluación El volumen del tumor
células de cáncer humano de pulmón H460 en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos atímicos hembra (nu /nu), 5-6 semanas de edad [Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN]). Una suspensión de 1 × 10
6 células en un volumen de 50 l se inyectaron subcutáneamente en el flanco posterior izquierdo de ratones utilizando una aguja de calibre 27½. Los tumores se dejaron crecer durante 6-8d hasta que el volumen promedio del tumor alcanzó 0,25 cm
3. Los grupos de tratamiento consistieron en el control del vehículo (en DMSO), M867, vehículo más la radiación, y M867 más radiación. Cada grupo de tratamiento contenía 5 ratones. DMSO o M867 se administró diariamente por inyección intraperitoneal (i.p.) en dosis de 2 mg /kg durante 7 días consecutivos. En el caso de tratamiento de combinación, fármaco o vehículo se dan para 2d antes de la primera dosis de irradiación. Los ratones en grupos de radiación se irradiaron 1h después del tratamiento fármaco o vehículo con fracciones diarias 2Gy dadas más de 5 días consecutivos. Los tumores en los flancos de los ratones se irradiaron usando un irradiador de rayos X (Therapax, Agfa NDT, Inc., Ciudad de Lewis, PA). El no tumoral partes de los ratones portadores estaban protegidos por bloques de plomo. Los tumores se midieron 2-3 veces a la semana en 3 dimensiones perpendiculares utilizando un calibrador Vernier y el volumen se calculó usando la fórmula modificada elipse volumen (volumen = (altura x anchura x profundidad) /2). Retraso en el crecimiento se calculó para los grupos de tratamiento en relación con el control de tumores.
secciones histológicas, vWF, Ki67 y la tinción de TUNEL
Los ratones fueron implantados con células H460 y se trataron como se ha descrito anteriormente en los estudios de volumen del tumor. Después de 7d de tratamientos diarios, los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron parafina fijos. Diapositivas de cada grupo de tratamiento fueron teñidas para factor von Willebrand (vWF) usando anti-vWF policlonal (Chemicon). Los vasos sanguíneos se cuantificaron por selección aleatoria de 400 × campos y contando el número de vasos sanguíneos por campo. Esto se hizo por triplicado y se calculó la media de los tres aspectos. Ki67 y desoxinucleotidil terminal de etiquetado dUTP nick fin de transferasa mediada por tinción (TUNEL) se realizaron en el laboratorio central de la patología de la Universidad de Vanderbilt utilizando protocolos estándar. Número de células positivas por campo se marcó y grafica el promedio de tres determinaciones repetidas.
El análisis estadístico
El análisis de los resultados del estudio se centró en las pruebas de las diferencias de volumen medio del tumor entre los grupos de tratamiento y tiempo diferente puntos. El análisis de los datos se completó utilizando el máximo modelo de efectos mixtos basados en la verosimilitud restringida /residual para ajustar el efecto intracorrelation de los ratones que tenían múltiples mediciones. El modelo se informa en el documento fue seleccionado sobre la base del criterio bayesiano de Schwarz. Todas las pruebas de significación fueron 2 caras, y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p era inferior a 0,05. Un paquete estadístico SAS v8.2, se utilizó para todos los análisis.
Resultados
M867 inhibe la apoptosis, pero mejorada sensibilidad a la radiación en células de cáncer de pulmón H460
Para probar el efecto de la inhibición de la caspasa-3 en la sensibilidad del cáncer de pulmón a la radiación, H460 células fueron tratadas con nuevo inhibidor reversible M867 en combinación con radiación ionizante. Las colonias supervivientes se contaron 8 días más tarde. ensayo de supervivencia clonogénico, que se muestra en la Figura 1A, demostró una disminución de la supervivencia en varios grupos de dosis, con 10 nM de M867 que resulta en la mayor mejora en la radiosensibilidad, en comparación con el control (DER = 1,27, p = 0,007). El nivel de apoptosis en las células H460 se midió después del tratamiento M867 (100 nM durante 2 h) y la irradiación con 20 Gy a 5Gy, usando el ensayo de Anexina-V. Se ha demostrado previamente que la unión de Anexina V fue bloqueado por M867 con una CI
50 de 80 nM [20]. Como se muestra en la Figura 1B, el nivel de apoptosis se elevó progresivamente con el aumento de dosis de radiación. 20% de las células H460 irradiadas fueron apoptóticas en 20 Gy. Cuando M867 se le dio antes de la radiación, las células apoptóticas se redujeron a la mitad en los dos niveles bajo y alto de dosis de radiación. Estos resultados demuestran que la sensibilización de las células de cáncer de pulmón H460 a la radiación ionizante se asoció con una disminución de la apoptosis.
células (A) H460 NSCLC fueron tratados con el control de DMSO, M867 (intervalo de dosis desde 1,4 hasta 10 nM, durante 24 horas) con la radiación. Después de 8 d, las colonias se tiñeron y se graficaron las colonias anotados. Las curvas de supervivencia para células H460 ± tratamiento M867. Puntos, significan; bares, SD (
P
= 0,007). Que se muestran son la media +/- la desviación estándar de tres experimentos repetidos separados. (B) ensayo de Anexina-V que muestra el nivel de la apoptosis en células H460 tratadas por cualquiera de control, 100 nM de M867 durante 2 h, la radiación (5, 10 o 20 Gy), y ambos modalidad. Esto se hizo por triplicado y se calculó la media de los tres aspectos. Columnas, la media; bares, Dakota del Sur.
Tratamiento combinado M867 /radiación prolonga retraso del crecimiento tumoral y es bien tolerado en el modelo de xenoinjerto de pulmón
Una vez establecida la eficacia
in vitro para
radiosensibilización M867 inducida por las células del cáncer de pulmón, un modelo de xenoinjerto de extremidad posterior del ratón se generó para explorar la respuesta de la radiación por la M867
in vivo
. células de cáncer de pulmón H460 se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos, y los tumores se les permitió crecer durante aproximadamente 7 días para producir un volumen medio de los tumores de 0,25 cm
3 antes de la terapia. Los grupos de tratamiento consistían en un control del vehículo, M867, vehículo más la radiación, y la combinación de M867 más radiación. M867 se administró diariamente por inyección intraperitoneal de 2 mg /kg durante 7 días consecutivos. xenoinjertos tumorales Hind extremidad H460 en ratones fueron tratados como se describe en la sección Materiales y Métodos. Retraso en el crecimiento se calculó como el número de días requeridos para alcanzar un volumen de tumor de 2 cm
3 para los grupos de tratamiento en relación con el control de tumores. Como se muestra en la Figura 2A, un retraso del crecimiento tumoral significativa se observó con la terapia de combinación de M867 y la radiación en comparación con la irradiación sola (26 vs 20 días, p & lt; 0,005), y M867 sola también afectó significativamente el crecimiento del tumor en comparación con el control (~ 4 días de retraso, p = 0,003). Esto sugiere que M867 podría aumentar la respuesta del tumor en combinación con radioterapia. Además, los cambios de peso corporal también fueron rastreados en los ratones para evaluar si el tratamiento con M867, radiación o tratamiento de combinación produjo toxicidad sistémica (Figura 2B). Sólo una mínima pérdida de peso se observó a los 10 días después del tratamiento combinado de irradiación y M867. Los cambios en el peso corporal después de este período de tiempo reflejan el crecimiento del tumor. Como era de esperar, el grupo de tratamiento de combinación, que tenía el retraso del crecimiento del tumor más prolongado, tuvo el menor aumento en el peso corporal
.
H460 células de cáncer de pulmón eran subcutánea xenoinjerto en ratones sin timo. Después de 6-8 días, los ratones se trataron diariamente durante 7 días, con el control del vehículo, M867 (2 mg /kg), y luego se trataron 1 hora después del tratamiento farmacológico con 2 Gy de radiación, diariamente más de 5 días consecutivos. Tumor se escindió cuando alcanzado el tamaño de aproximadamente 2,5 a 3,0 cm
3 y el crecimiento tumoral de retardo tal como se define por el número de días requeridos para alcanzar un volumen de tumor de 2 cm
3 se midió. Los tumores (A) se midieron con regularidad y retraso en el crecimiento se calculó para los grupos de tratamiento en relación con el control de los tumores. La terapia bi-modalidad combinada induce un retraso marcado crecimiento tumoral en comparación con la radioterapia sola (26 vs 20 días, p & lt; 0,005). Se midieron (B) Los pesos corporales cada relación de 5 días y el peso corporal se calculó con relación a la medición de línea de base.
M867 reduce el índice de proliferación del tumor a pesar marcada disminución de la apoptosis en H460 irradiado xenoinjerto de ratón
para determinar el mecanismo que contribuye al retraso en el crecimiento tumoral después de la terapia de combinación, se examinó Ki67 índice de proliferación usando secciones de tumor H460 fijos en todos los grupos de tratamiento. Como se muestra en la Figura 3A, M867 más la combinación de la radiación de tratamiento resultó en un 6 veces (15% vs 92%, p & lt; 0,001) y 2 veces (15% vs 33%, p & lt; 0,001) la reducción en la proliferación de las células en comparación con el control y grupos solos de radiación, respectivamente. A continuación evaluó los niveles de apoptosis en secciones de tumores H460 fijos utilizando la tinción de TUNEL. Como se muestra en la figura 3B mediante la tinción de TUNEL, combinado M867 y tratamiento de radiación resultó en dos tercios de la reducción en la apoptosis (4,5% vs 15%, p & lt; 0,008)., En comparación con la radioterapia sola
Las secciones histológicas se obtuvieron de los tumores de los ratones en cada grupo de tratamiento del estudio el volumen del tumor. Número de células positivas se anotó y se representan por un promedio de tres determinaciones repetidas. índice de proliferación (A) Medida de Ki67 de cada grupo de tratamiento se determinó por el porcentaje de células Ki67 positivas por campo microscópico. Esto se repitió tres veces. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. tinción (B) TUNEL también se realizó en secciones de tumor, y el índice de apoptosis se calculó de manera similar por ciento de células positivas TUNEL manchadas por campo microscópico. Columna, significa; bares, Dakota del Sur.
M867 reduce la densidad vascular en el modelo de tumor de pulmón irradiado y sensibiliza a la radiación HUVECs
Desde la vasculatura del tumor es un objetivo para el tratamiento del cáncer, los ratones fueron tratados de manera similar a los de el estudio retraso del crecimiento del tumor y secciones de tumor de pulmón fijos se utilizaron para determinar los efectos de la M867 y la radiación en la vasculatura del tumor
in vivo
. Diapositivas de cada grupo de tratamiento se analizaron después de factor von Willebrand (vWF) tinción para estudio de la densidad vascular, como se muestra en la Figura 4A. Después se determinó el número de vasos por campo microscópico para cada grupo de tratamiento. La terapia de combinación de M867 y la radiación (1.3; SD = 0,57) dio como resultado una dramática reducción de 5 veces en el número medio de vasos por campo microscópico en comparación con el control (6; SD = 1; p & lt; 0,002) y un ~2- una reducción doble en relación con la radioterapia sola (2,3; SD = 0,57; p & lt; 0,007). (Figura 4A)
(a) las secciones histológicas se obtuvieron de los tumores de los ratones en cada grupo de tratamiento de la
in vivo de tumores
estudio del volumen, y teñidas de los vasos sanguíneos utilizando un anticuerpo para el vWF. Los vasos sanguíneos se cuantificaron por selección aleatoria de 400 × campos y contando el número de vasos sanguíneos por campo. Esto se hizo por triplicado y se calculó la media de los tres aspectos. Columnas, la media; bares, Dakota del Sur. (B) las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se trataron con 5 nM M867 y luego irradiadas inmediatamente con 0 o 3 Gy. Seis horas después, las células se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en placas de 24 pocillos recubiertas con Matrigel. Después de 24 h, las células fueron fijadas y teñidas con H & amp; E. Las diapositivas fueron examinadas por microscopía (× 100), y se muestran los campos representativos. (C) túbulos teñidas fueron contados en tres campos separados, seleccionados al azar. Columnas, significan número de túbulos contadas por campo microscópico; bares, Dakota del Sur.
Para investigar más a fondo los efectos de la radiación sobre M867 y formación de vasos sanguíneos, se utilizaron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) para examinar la formación de túbulos para la función angiogénica
in vitro
. El ensayo de la morfogénesis de las células endoteliales se llevó a cabo para examinar la capacidad de HUVECs tratadas para producir estructuras tubulares similares a capilares. Una imagen representativa y el número medio de tubos contados en tres campos separados (x100) se muestran en la Figura 4B y C, respectivamente. El tratamiento con M867 combinado a la radiación disminuyó significativamente la formación de túbulos en comparación con la radiación sola (5,7 vs 1,7, p & lt; 0,001). Control sin tratamiento tuvo 13 túbulos (SD = 1,0) por campo microscópico y M867 solo tenían 9 túbulos (SD = 1.0), lo que sugiere un efecto anti-angiogénico de M867, además de la radio-sensibilización.
caspasa 3 /7 deficiencia promueve sensibilidad a la radiación por inducción autofagia, en ausencia de apoptosis
para validar si la inhibición de las caspasas contribuyó a mejorar la terapia de radiación, se utilizaron la caspasa-3/7 deficiente (DKO) células MEF. Estas células son incapaces de someterse a la apoptosis, ya que carecen de las caspasas 3/7, mientras que WT MEFs lata (Figura 5A y 5B). Como se muestra en la Figura 5C, MEFs WT tratados con M867 eran más sensibles a la radiación en comparación con los MEFs WT tratados con DMSO (DER = 1,2 para 5 nM M867, p = 0,017, y DER = 1,62 para 10NM M867, p = 0,001). No hubo diferencia significativa en la supervivencia entre los caspasa MEFs DKO tratados con cualquier dosis de M867 en comparación con DMSO. Además, las células WT MEFs transfectadas con la caspasa-3/7 siRNAs también presentó aumento significativo en la sensibilidad a la radiación, lo que sugiere que estos resultados no son debido a la variación clonal de estas células (datos no presentados). Sobre la base de nuestro estudio anterior, la hipótesis de que el aumento de sensibilidad a la radiación en las células caspasa DKO puede ser debido a la muerte celular programada alternativa como la autofagia [8]. Para probar esta hipótesis, WT y la caspasa 3/7 células DKO se transfectaron con el plásmido GFP-LC3. Las células con la señalización punteada GFP se contaron como células autofágicas debido a la característica de localización lisosomal de proteína LC3 durante la autofagia [19]. Después de las células WT y la caspasa DKO fueron expuestos a 5Gy de la radiación, el porcentaje de células con punctates GFP se aumentó aproximadamente 3 veces en las células DKO caspasa irradiado, en comparación con células irradiadas WT (30% vs 10%, respectivamente) (Figura 6A ). A las 48 h post-radiación, el porcentaje de células autofágicas aumentó a ~55% en las células DKO caspasa en comparación con 15% en el control WT. Estos resultados también se confirmaron mediante la evaluación del nivel de proteína LC3 procesado, en el que las células de caspasa DKO mostraron niveles de proteínas LC3-I y II-después de la irradiación se incrementaron, en comparación con las células WT (Figura 6B). Debido a que la vía mTOR se sabe que regulan la iniciación de la autofagia, se analizó la señalización /Akt mTOR mediante la determinación de los niveles de fosfo-Akt y fosfo-S6 en las células MEF DKO WT y caspasa irradiados. Como se muestra en la figura 6C, las fosfoproteínas se incrementaron en las células WT irradiados, mientras que se redujeron en la caspasa irradiado células DKO MEF. Estos datos sugieren que la señalización pro-autofagia es hasta reguladas en las células DKO caspasa irradiado.
(A) WT y la caspasa 3/7 DKO MEFs fueron incubadas con isotiocianato de Anexina V-fluoresceína y yoduro de propidio 24 h después irradiación y se analizaron mediante FACScan. Los datos se muestran como la media de tres experimentos S.D. escisión (B) de la caspasa se determinó por inmunotransferencia de la caspasa-3 escinde después de las células MEF DKO WT o caspasa 3/7 fueron tratados con 0, 2,5, 5, 7,5, y 10 Gy. Las células se recogieron después de 24. (C) Radiosensibilización de WT o caspasa 3/7 DKO MEFs. Las células se irradiaron con las dosis indicadas de la radiación y se trataron con control de DMSO o M867 (intervalo de dosis desde 5 hasta 10 nM, durante 24 horas). Después de 10 días, las colonias se tiñeron y se anotó. Los valores reportados son la media ± S.D.. de tres experimentos repetidos separados.
transfectadas con GFP-LC3 células MEF DKO WT o caspasa 3/7 (A) fueron tratados con y sin 5 Gy y luego examinadas por microscopía de fluorescencia después de 24 h. El porcentaje de células con fluorescencia punteada GFP-LC3 se calculó con relación a todas las células positivas para GFP. Las barras de error se muestran como media S.D. (B) LC-I y -II expresión se determinó mediante Western blot utilizando lisados de WT y caspasa 3/7 células MEF DKO tratados con 0 o 5 Gy a las 24, 48 h. Actina se sondó para demostrar igualdad de carga. (C) También se muestran inmunotransferencias de fosfo-Akt y p-S6 utilizando los lisados de WT y caspasa 3/7 células MEF DKO tratados con 0 o 5 Gy después de 30 minutos. (D) células MEF DKO WT y la caspasa 3/7 fueron transfectadas ya sea con el control de siRNA o 25 nM siRNAs dirigidos contra ATG5 y Beclin-1 o (E) transfectadas con el vector o ATG5 y Beclin-1 de ADNc que contienen plásmidos. Luego fueron irradiadas con 0-6 Gy. Después de 8 días, las colonias se tiñeron y se anotó. Los valores mostrados son la media ± S.D.. de tres experimentos repetidos separados.
La autofagia altera sensibilidad a la radiación de la caspasa 3/7 células deficientes
Para determinar si la autofagia es el mecanismo responsable de la mayor radiosensibilidad observado en caspasa DKO células, la expresión de ATG-5 y Beclin-1, dos proteínas esenciales autofagia [21], [22], [23], fueron derribados en el tipo salvaje y la caspasa células DKO. Estudios anteriores demostraron que siRNA contra Beclin-1 y ATG-5 downregulated específicamente la expresión de la proteína endógena [8]. Como se muestra en la figura 6D, el tratamiento de células DKO caspasa con siRNAs dirigidos contra ATG-5 y Beclin-1 abolió el efecto sensibilizante resultante de la eliminación de la caspasa-3/7 y causó un aumento significativo en la supervivencia de células clonogénicas en comparación con el tratamiento control siRNA de la caspasa células DKO (DER = 1,34, p = 0,008). Por el contrario, la sobreexpresión de Beclin-1 y ATG-5 en células DKO caspasa causó un aumento significativo en la muerte de células clonogénicas en virtud de la dosis de radiación creciente en comparación con Beclin-1 y ATG-5 sobreexpresión en las células WT (DER = 1,32, p = 0,008) ( Figura 6E). En conjunto, estos resultados demuestran que el aumento de la radiosensibilidad de las células DKO caspasa depende de moléculas clave autofagia.
Discusión
En el presente informe, lo primero que demostró que el tratamiento M867 resultó en la radiosensibilización efectiva de pulmón las células cancerosas
in vitro
. Los posibles efectos terapéuticos de M867 luego se demostraron en un
in vivo
posterior del ratón modelo de tumor en las extremidades. Además, en experimentos in vitro mostraron que las células MEF /7-nulos 3 caspasa-, eran más sensibles a los efectos citotóxicos de la radiación, debido principalmente a un aumento de la autofagia. Este estudio también sugiere que los efectos sobre la vasculatura M867 pueden contribuir al aumento observado en el pulmón retraso del crecimiento del tumor en respuesta a la radiación.
quimiorradioterapia concurrente es un elemento fundamental en el tratamiento del cáncer de pulmón avanzado, pero el pronóstico para los pacientes sigue siendo globalmente pobre. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias para mejorar la eficacia del tratamiento actual por la orientación de la muerte de células no apoptóticas ya que la apoptosis está limitada después de la terapia convencional. Recientemente, ha habido un gran énfasis en la autofagia como un objetivo la terapia del cáncer, en parte impulsados por las observaciones de que los tratamientos contra el cáncer inducen la autofagia, tales como en células de cáncer irradiados [17], [24]. Hemos demostrado recientemente que la autofagia puede ser provocada por la inhibición de la diana de mamífero o rapamicina (mTOR) vía [17] o mediante la inhibición de las proteínas pro-apoptóticas Bak /Bax para mejorar los efectos de la radiación
in vitro
[8]. Un objetivo muy atractivo en la vía apoptótica es la caspasa-3, que tiene un papel central en la apoptosis como la caspasa efectora dominante implicada en la escisión proteolítica de sustratos de proteína, incluyendo proteínas del citoesqueleto, quinasas y enzimas de reparación del ADN. En este estudio, se analizaron los efectos potenciales de la inhibición de la caspasa-3 en respuesta a la radiación del cáncer de pulmón con el nuevo inhibidor de la M867. Hemos demostrado que la administración de M867 en combinación con radiación ionizante se redujo drásticamente la supervivencia de células de cáncer de pulmón H460 (Figura 1), de una manera dependiente de la dosis. Es de destacar que se observó un aumento de la citotoxicidad a concentraciones superiores a 10 nM en nuestro ensayo clonogénico. Sin embargo, se ha demostrado que M867 es un potente y reversible inhibidor de la caspasa-3 (IC
50 de 0,0001 M), y una menos potente inhibidor de la caspasa-7 (IC
50 de 0.036 M) [18]. Además, se encontró que el efecto radiosensibilizador de M867 es dependiente de caspasa-3 y -7, como se demuestra por la ausencia de su impacto sobre la caspasa 3/7 células DKO.