Extracto
dependiente del endotelio angiogénesis se cree que es un paso crucial en la progresión del cáncer. Hemos informado anteriormente de que la metástasis asociada en el cáncer de colon-1 (MACC1) contribuyó a la mímica de origen vascular en el cáncer gástrico (CG), pero aún se desconoce si MACC1 promueve la angiogénesis dependiente del endotelio de GC y si TWIST1 está involucrado en este proceso. En el presente estudio, se detectó la expresión MACC1 y la densidad microvascular (MVD) por inmunohistoquímica en 159 pacientes con estadio I-III GC, y se investigó el papel de TWIST1 y factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF-A) en el endotelio inducida por MACC1 angiogénesis dependiente usando ratones desnudos con xenoinjertos de GC, y las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) que eran co-cultivadas con medio acondicionado a partir de células de sobreexpresión MACC1 GC y de interferencia. Se encontró que la expresión MACC1 se correlacionó positivamente con un aumento de MVD y la recurrencia del tumor en pacientes GC. En modelos de xenoinjerto de GC, MACC1 elevada MVD y upregulated la expresión de VEGF-A, así como el crecimiento del tumor acelerado. Además, MACC1 obviamente aumentó la expresión de TWIST1 y la formación de tubo inducida de HUVECs, mientras que la atenuación de TWIST1 suprimió la expresión de la proteína de VEGF-A y derogar el efecto de MACC1 en la formación del tubo. Nuestros hallazgos arrojan luz sobre la función de MACC1 en la angiogénesis dependiente del endotelio de GC y sugieren un potencial valor pronóstico y terapéutico
Visto:. Wang L, R Zhou, Zhao Y, Dong S, Zhang J, Luo Y, et al. (2016) MACC-1 promueve la angiogénesis dependiente del endotelio en el cáncer gástrico mediante la activación de TWIST1 /VEGF-A vía de señalización. PLoS ONE 11 (6): e0157137. doi: 10.1371 /journal.pone.0157137
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Centro Médico de Niños de Cincinnati, Estados Unidos |
Recibido: 8 Febrero de 2016; Aceptado: 25-may de 2016; Publicado: 9 Junio 2016
Derechos de Autor © 2016 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de jóvenes científicos de China (No.81302155), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31271564), el presidente de la Fundación del hospital Nanfang (No.2015B007), y el Programa de Disciplina clave clínica Especialidad Construcción de China (en el Departamento de Oncología, hospital Nanfang)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
es necesario
Introducción
suministro de sangre continuo para el rápido crecimiento de los tumores [1]. Además de la angiogénesis dependiente del endotelio bien estudiado, estudios recientes han revelado varios patrones nuevos incluyendo mimetismo y mosaico vasos vasculogénicos [2, 3]. Hemos informado anteriormente de que la metástasis en el cáncer asociado-1-coma (MACC1) contribuyó a la formación mímica origen vascular (VM) en el cáncer gástrico humano (GC) [4]. Sin embargo, aún se desconoce si MACC1 está involucrado en el verdadero angiogénesis dependiente del endotelio de GC.
MACC1, como un regulador clave del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) /c-Met /activadas por mitógenos proteína quinasas (MAPK ) vía [5-7] señalización, promueve la proliferación, la migración y la invasión de las células de GC [8], además de afectar a la glycometabolism tumoral [9] y el microambiente [4, 10, 11], en la última predicción de los pobres resultados clínicos para los pacientes de GC [8]. Estudios previos indicaron que múltiples reguladores de VM [12, 13] participaron en la angiogénesis [14, 15]. Por lo tanto, altamente especular que MACC1 juega un papel importante en la angiogénesis dependiente del endotelio de GC.
Se ha informado de que la angiogénesis está estrechamente relacionada con la recurrencia del tumor después de la cirugía [16]. Pero no está claro si la combinación de MACC1 y alta densidad de microvasos (MVD) supervivencia libre de enfermedad más influencia (DFS) de los pacientes GC, ni el mecanismo molecular de la angiogénesis inducida por MACC1. En nuestro estudio preliminar, se demostró que TWIST1 era necesario para VM MACC1 inducida por GC [4], mientras que la expresión TWIST1 promueve la vascularización del carcinoma de mama [17, 18] y apoyó el desarrollo vascular mediante la regulación al alza del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) - A [19], que es la primera forma de identificado el factor pro-angiogénico [20, 21]. Estos resultados sugieren fuertemente que TWIST1 /VEGF-A eje angiogénico tiene un papel central en la angiogénesis dependiente del endotelio de los tumores. Es importante destacar que los informes anteriores sobre el análisis de los publicados microarrays de datos mostraron que los niveles de ARNm de MACC1 se correlacionaron significativamente con VEGF-A expresión en tejidos GC (TCGA; n = 387, r = 0,224, P & lt; 0,001) (Fig S1). Por encima de todo, que postula que MACC1 promueve la angiogénesis dependiente del endotelio a través de la activación de eje /VEGF-A de señalización TWIST1 en GC.
En este estudio, hemos examinado si MACC1 se asoció positivamente con la angiogénesis dependiente del endotelio. Detectamos si la expresión MACC1-positiva y alta MVD predijeron DFS cortas en pacientes con GC después de la resección radical. A continuación, se investigó el papel de MACC1 en la angiogénesis in vivo e in vitro. Finalmente, determinamos si TWIST1 /VEGF-A angiogénico eje representado el mecanismo subyacente de la angiogénesis dependiente del endotelio inducida por MACC1.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejido tumoral
muestras patológicas en parafina fueron obtenidos de 159 pacientes con estadio I-III GC que fueron sometidos a resección quirúrgica radical en el hospital de la Universidad médica de Nanfang Sur (Guangzhou, Guangdong, china) entre 2005 y 2010. Todos los pacientes fueron diagnosticados de acuerdo a la 7 ª edición propuesto por American Joint Committee on Manual del cáncer (AJCC) 2010 sistema de estadificación de GC. Se confirmó que todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices pertinentes y el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos. Los protocolos de estudio fueron aprobados por los Comités de Ética del Hospital Nanfang y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente.
Modelos Animales
Se obtuvieron ratones desnudos NOD-SCID macho de 5 semanas de edad de Sun Yat-Sen Universidad (Guangzhou, china). estable sobreexpresión del gen MACC1 (oxMACC1) y de control de vectores células o silenciamiento de MACC1 (shMACC1) y células GC-control de mezcla aleatoria (1 × 10
7 células /ratón, n = 6) se inyectaron por vía subcutánea en la izquierda y la derecha lados de la parte posterior como se describe anteriormente [8]. nódulos tumorales fueron controlados cada 3 días por mediciones de calibre de la longitud y anchura de los tumores. Los volúmenes tumorales se calcularon según la fórmula: Volumen = anchura x longitud x (anchura + longitud) /2. Todos los animales fueron alojados en una instalación libre de patógenos específicos en jaulas microisolator con acceso libre a comida y agua en autoclave acidificadas complementado con trimetoprim-sulfametoxazol. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Administración de Animales de Laboratorio del Hospital Nanfang (Número de Permiso: NFYY-2015-10) y de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos. Los tumores se dejaron crecer hasta 0,5-1 cm de tamaño en la dimensión más grande y se recogieron el día 18, porque enorme volumen del tumor era propenso a necrosis central de los tumores que afectan a los resultados en los siguientes experimentos [8]. A continuación, se iniciaron los procedimientos de recogida de tejidos después de los animales se sacrificaron por dislocación cervical. Los ratones fueron retirados de sus jaulas y suavemente restringidos mientras descansa sobre la mesa de trabajo. La dislocación cervical se realizó manualmente y dio lugar a la eutanasia dentro de aproximadamente 10 segundos. Los tumores subcutáneos se utilizaron para la tinción inmunohistoquímica (IHC).
Human Vascular Endotelial la formación del tubo de la célula de ensayo
ensayo de formación de tubo HUVEC se realizó pipeteando 200 l de Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ , EE.UU.) en cada pocillo de placas de 24 pocillos, que después se polimeriza durante 1 hora a 37 ° C. HUVECs (1 × 10
5) con 200 l de medio condicionado se añadieron en cada pocillo y se incubaron durante 12 h. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio de campo brillante con un aumento de 100 x. Los tubos capilares se cuantificaron contando el número promedio de estructuras tubulares terminados en tres campos seleccionados al azar.
Líneas celulares y cultivos celulares
OxMACC1 y líneas celulares de adenocarcinoma gástrico shMACC1 se llevaron a cabo como se describe en nuestro estudio anterior [8]. Las células se mantuvieron con medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), y 0,5 mg /ml de puromicina [8]. Las líneas celulares fueron autenticadas por repetición en tándem corto y genotipo al volver a expansiones, y los experimentos se llevaron a cabo con cultivos de paso de bajos de estas poblaciones. HUVECs se obtuvieron de Yiyuan Biotecnología Company (Guangzhou, China), y se cultivaron en medio de crecimiento de células endoteliales (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 0,1 mg /ml de heparina y 20% de FBS (Hyclone) de acuerdo con las sugerencias del proveedor. Para los experimentos, se utilizaron células entre 2 y 5 pasajes.
Plásmidos y transfección de células
TWIST1 humano se amplificó por PCR y se clonó en el vector pcDNA3.1 (Las secuencias de cebador en la Tabla S1) ( Invitrogen), y el plásmido recombinante pcDNA3.1 /TWIST1 se construyó. La eficiencia de silenciamiento de tres pares TWIST1-siRNA (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) en la región ORF fue examinado por cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR, secuencias de cebador en la Tabla S2). células de GC fueron transfectadas con pcDNA3.1 TWIST1 y TWIST1-siRNA /utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Inmunohistoquímica La tinción
IHC tinción se realizó de acuerdo con el protocolo estándar [8]. Las secciones se incubaron con una serie de anticuerpos primaria y secundaria (S3 tabla). las puntuaciones de tinción fueron evaluados por tres revisores independientes, y se determinó el sistema de puntuación media-cuantitativa como informado en otras partes [8]. En resumen, para la intensidad de tinción MACC1, las secciones se puntuaron como 0 (negativo), 1 (débil), 2 (medio) o 3 (intensa). Si bien el alcance de tinción se puntuó de acuerdo a los porcentajes de área: 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), o 4 (76% -100%). Los productos de las puntuaciones de intensidad y extensión de tinción fueron las puntuaciones de tinción finales (0-12) para la expresión MACC1. Los tumores de tinción final de puntuación ≥ 3 fueron considerados como expresión positiva ya que el 95% de los tejidos gástricos normales expresadas bajo nivel de MACC1 con una puntuación de IHC & lt; 3 en nuestro estudio preliminar [8]. Hemos definido más 3 ~ 7 como baja expresión y 8 ~ 12 como alta expresión con el fin de realizar el análisis cualitativo.
densidad de los microvasos
MVD se determinó como se describe por Weidner et al. [22] . MVD se evaluó de acuerdo con plaquetas adhesión de células endoteliales molécula-1 (CD31) IHC tinción de los vasos del tumor. Las secciones fueron escaneados inicialmente a su objetivo de baja potencia (magnificación × 100) para seleccionar los (puntos calientes) zonas más vascularizados. Los microvasos en los puntos calientes se contaron con un aumento de 200 ×, y el recuento medio de buque en seis puntos calientes se calculó como la MVD. Todos los recuentos fueron revisados de forma independiente por tres observadores que fueron cegados a los datos clínico-patológicas correspondientes. El MVD fue clasificado como alto (≥ 36,8) o baja (& lt; 36,8); 36.8 fue el valor de la mediana de MVD.
inmunoabsorción ligado a enzimas Ensayo
La concentración de TWIST1 y VEGF-A se cuantificó usando un TWIST1 disponible en el mercado (Sandwich, vida útil Biosciences, CA, EE.UU.) y VEGF-a (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados que se presentan los valores medios de tres experimentos separados.
Análisis de Western Blot
Las proteínas totales se extrajeron y se sometieron a transferencia de Western como se describe anteriormente [8]. Los anticuerpos primarios de conejo policlonal contra MACC1 (Abcam, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.), TWIST1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), los anticuerpos VEGF-A (Proteintech, Chicago, IL, EE.UU.), y el macho cabrío de fluorescencia secundaria anticuerpo anti-conejo (LI-COR, Lincoln, NE, EE.UU.) se utilizaron en este experimento. Las transferencias fueron escaneados utilizando sistema de imágenes Odyssey (LI-COR).
cuantitativa en tiempo real PCR
La secuencia del cebador para TWIST1 se resume en la Tabla S4. El ARN total se extrajo utilizando Trizol Kit (Invitrogen) y se transcribió inversamente usando el kit de M-MLV RT (Promega, Madison, WI, EE.UU.). QRT-PCR se realizó con SYBR tinte verde (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL , ESTADOS UNIDOS). La relación entre las variables clínico-MVD y se examinó mediante la prueba de Chi-cuadrado. DFS se define como el intervalo de la fecha de la operación a la fecha de la primera recurrencia. La tasa de SSE se estimó mediante el método de Kaplan-Meier, y se compararon las diferencias de supervivencia mediante la prueba de log-rank. Un análisis multivariante se realizó mediante el modelo de regresión de Cox. Los cocientes de riesgo se presentaron con sus intervalos de confianza del 95%. El correlationship entre MACC1 y MVD se determinó mediante la prueba de rangos de Spearman. La comparación estadística de los diferentes grupos experimentales in vivo e in vitro se realizó mediante la prueba t de Student. El valor de P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Elevación de MVD y VEGF-A están relacionadas con la recurrencia del tumor en pacientes GC
Para evaluar el índice de neovascularización, MVD fue determinado por tinción IHC de CD31 en 159 tejidos de los pacientes con estadio I-III GC. Los ejemplos representativos de la tinción con aumentos de alta y baja se indicó en la figura 1A. El valor de la mediana de MVD, definido como valor de corte, fue del 36,8. Se definieron los valores más altos de corte tan alta MVD, de lo contrario tan bajo MVD. Entre los 159 pacientes con cáncer gástrico, 106 (66,7%) fueron divididos en grupo MVD-alto y 53 (33,3%) se agruparon en MVD-grupo bajo (figura 1A). La asociación entre MVD y los diversos parámetros clínico se enumeran en la Tabla S5. Se encontró que el MVD-alta fue más frecuente en los pacientes con recurrencia de GC (p = 0,001, figura 1C y 1D). No hubo asociación significativa se refiere a sexo, edad, grado de diferenciación histológica, profundidad de la invasión (estadio T), metástasis linfática (N etapas), y las etapas generales de TNM entre los dos grupos. Sin embargo, nuestro análisis adicional reveló que MVD fue mayor en la Etapa III que en tanto la etapa II (P = 0,009) y la etapa I (P = 0,007) (Fig 1F), mientras que este no fue el caso teniendo en cuenta T individuo o de la etapa N.
(a) Representante de inmunotinción CD31 en tejidos GC. (B) Representante imágenes de VEGF-A en los tejidos teñidos GC humanos. (C-E) fotomicrografías representativas (C) y el gráfico de barras que muestra MVD (D) y la expresión de VEGF-A (E) fueron mayores en los pacientes con cáncer gástrico recurrencia que en los pacientes GC no repetición. Barra de escala = 50 micras.
#P & lt; 0,01, n = 65 yn = 94 para los pacientes no repetición y recurrencia, respectivamente. (F & amp; G) En pacientes en estadio I, MVD fue menor (F) y las puntuaciones medias de VEGF-A tiende a ser menor (G) que en la fase II y fase III.
#P & lt; 0,01 frente al grupo de control correspondiente, N. S., Sin significado; n = 26, n = 50 yn = 83 para la fase I, II, y III, respectivamente.
Se ha documentado que el VEGF juega un papel fundamental en la estimulación de la formación de vasos sanguíneos del tumor y los correlatos biológicamente con MVD [20, 23]. VEGF-A fue el más estudiado de la familia VEGF [20, 21]. Teniendo en cuenta el importante papel de VEGF-A en la angiogénesis tumoral, se realizó la inmunotinción de tejidos 159 GC (Figura 1B). Según los resultados de la tinción de VEGF-A, los pacientes fueron divididos en grupos de negativa (puntuación 0-2), baja (puntuación 3-7) y expresiones de alto (puntuación 8-12). Había 108 VEGF-A los pacientes positivos, lo que llevó a la mayoría (67,9% frente a aspectos positivos negativos de 32,1%). Entre ellos, 47 (29,6%) pacientes se definieron como una expresión baja, y 61 (38,4%) eran tan alta expresión. La relación entre la expresión de VEGF-A y la recurrencia se evaluó adicionalmente en GC. Como resultado, se encontró que VEGF-A que se correlaciona positivamente con la recurrencia del tumor de los pacientes GC (P & lt; 0,001, Fig 1C y 1E). Por otra parte, aunque no había estadísticamente significativa (P & gt; 0,05), el VEGF-A expresión tendió a ser mayor en estadio II-III que en la fase I a juzgar por el diagrama de caja (figura 1G), lo que sugiere un papel regulador positivo de VEGF-a en MVD en la progresión del GC.
MACC1 se correlaciona positivamente con MVD y VEGF-a en GC humana
para aclarar aún más el papel de MACC1 en el neovascularización de GC, nos propusimos determinar si MACC1 se correlacionó con MVD y el factor angiogénico VEGF-A. Entonces, la tinción IHC se realizó para detectar la expresión MACC1 en secciones de tejido GC (Fig 2A). Como se indica en la figura 2B, MACC1 mostró una expresión más alta en los pacientes con GC recurrencia que los que no. Notablemente, MACC1 se correlacionó positivamente con MVD (r = 0,258, P = 0,001, Figura 2C) y el aumento de A VEGF-nivel de expresión en tejidos GC (p = 0,008, figura 2D). En este documento, estos resultados indican que MACC1 correlacionada con MVD y VEGF-A en GC humana.
(A) MACC1 Representante imágenes teñidas en los tejidos GC. Barra de escala = 50 micras. (B) La frecuencia de expresión MACC1 negativo, baja y alta en los pacientes clasificados por GC recurrencia. (C) MACC1 expresión puntuaciones se correlacionaron positivamente con el Ministerio del Interior (r = 0,258, P = 0,001 y n = 159). (D) VEGF-A fue mayor en los tumores MACC1 positividad.
#P & lt; 0,01, n = 23 y n = 136 para los tumores MACC1-negativas y MACC1-positivo, respectivamente. MACC1 expresión positiva incluido MACC1-baja y expresión -alta.
MACC1 y MVD Indicar DFS corto para GC pacientes
De acuerdo con el análisis multivariado mediante el modelo de Cox, MVD (P = 0,043, HR = 1,737) y estadios TNM generales (P & lt; 0,001, HR = 2.559) fueron los parámetros pronósticos independientes que predicen el riesgo de recurrencia después de la resección radical en pacientes en estadio I-III (S6 Tabla). curva de supervivencia de Kaplan-Meier se trazó utilizando factores pronósticos antes mencionados. Entre los 159 pacientes, 94 (59,1%) recayeron y la mediana del tiempo hasta la recurrencia fue de 27,0 meses. El tiempo de DFS fue significativamente menor en los pacientes con estadio TNM avanzada (P & lt; 0,001, Figura 3A). Además, no sólo MACC1-positivo o MVD-alta solo afectada DFS, la combinación de ambos también podían predecir el corto DFS en pacientes GC (Fig 3B-3D). Sorprendentemente, la tasa de SSE de 3 años para la combinación de los pacientes MACC1-positivo y MVD-altos fue sólo del 34,5%, mientras que fue de 55,3% para los pacientes con tumores que eran MVD-baja y negativa para MACC1 (figura 3D).
(a) El análisis de Kaplan-Meier de los pacientes GC DFS vez en subgrupos de Fase I-III. plot (BD) de Kaplan-Meier que muestra MACC1 expresión positiva y elevada MVD indicado corto DFS de los pacientes GC clasificados por la expresión MACC1 (B), el nivel de MVD (C) y por una combinación de positividad MACC1 y MVD-alta (D).
MACC1 promueve la angiogénesis GC dependiente del endotelio en vivo e in vitro
p> La angiogénesis
.
(A) Imágenes representativas de la sobreexpresión implantado subcutánea de MACC1 (oxMACC1) y el silenciamiento de MACC1 (shMACC1), los tumores de xenoinjertos de GC. (B) Las curvas de volumen de los tumores de xenoinjertos de GC a los 18 días después de la inoculación. * P & lt; 0,05;
#P & lt; 0,01, n = 6. (C-E) inmunotinción Representante de MACC1, VEGF-A, CD31 (C) y cuantificación (D & amp; E) de xenoinjertos de GC con oxMACC1, shMACC1 y sus controles correspondientes. Barra de escala = 50 micras. * P & lt; 0,05;
#P & lt; 0,01, n = 6 frente al grupo de control correspondiente. (F) Imágenes representativas de la formación del tubo en cultivo tridimensional (panel izquierdo) y cuantificación (panel derecho) de HUVECs tratadas con medio condicionado de BGC-823 o MKN-28 células GC para 12 h. WT, de tipo salvaje. V, vector. Buey, oxMACC1. S, scramble. Sh, shMACC1. Barra de escala = 50 micras. * P & lt; 0,05;
#P & lt; 0,01, n = 3.
Con el fin de confirmar el papel de MACC1 en la angiogénesis in vitro, se utilizó una (3D) modelo de cultivo bien establecida en tres dimensiones en el sistema de co-cultivo indirecta. Como se muestra en la figura 4F, la densidad de las estructuras similares a tubos vasculares fue aumentado dramáticamente en HUVECs co-cultivadas con medio acondicionado a partir de células MKN28 (P = 0,05 y P = 0,003) oxMACC1 BGC-823 y, mientras que se redujo significativamente desde shMACC1 células BGC-823 y MKN28, en comparación con las células por vectores y control de scramble correspondientes a las 12 h (P = 0,006 y P = 0,02). Tomados en conjunto, estos resultados revelaron que MACC1 aceleró el crecimiento del tumor y la angiogénesis inducida dependiente del endotelio de GC.
MACC1 promueve la angiogénesis mediante la regulación positiva de la expresión TWIST1
ya se ha informado de que TWIST1 era un factor esencial en MACC1 VM inducida de las células de GC. MACC1 transcripcionalmente podía aumentar la TWIST1 [4]. Esto nos llevó a investigar si TWIST1 dedica a la angiogénesis dependiente del endotelio inducida por MACC1 de GC. Los resultados mostraron en la figura 5A y 5B sugirieron que la expresión de TWIST1 fue obviamente upregulated en líneas celulares oxMACC1 GC (P & lt; 0,001 y P = 0,024), pero fue significativamente downregulated en líneas celulares shMACC1 GC en comparación con las células de control correspondientes (P = 0,002 y P & lt; 0,001). Conclusiones similares se han alcanzado en el ensayo ELISA (Fig S2). A continuación, se detectó la expresión de la proteína de VEGF-A en dos líneas celulares GC (Figura 5A y 5B), VEGF-A se incrementó en gran medida por la regulación positiva MACC1 (P & lt; 0,001 y P = 0,008), pero se redujo en shMACC1 (P = 0,039 y P = 0,041). Se obtuvieron resultados similares mediante el ensayo ELISA (Fig 5C y 5D). Además, IHC tinción en los tumores subcutáneos con xenoinjertos GC mostró que TWIST1 y VEGF-A fueron significativamente mayores para las células oxMACC1 frente vector-controles, y se redujo notablemente para las células shMACC1 frente scramble-controles (P = 0,003 y P = 0,026, higos 4C y 5E)
(a & amp;. B) análisis de transferencia de Western (panel superior) y cuantificación (panel inferior) de MACC1, TWIST1, y VEGF-a expresión en respuesta a la sobreexpresión o el silenciamiento de MACC1 (oxMACC1 y shMACC1) en MKN-28 células GC-823 y BGC. * P & lt; 0,05;
#P & lt; 0,01, n = 3. WT, de tipo salvaje. GAPDH se utilizó como control de carga. (C & amp; D) Análisis ELISA de VEGF-A los niveles de proteínas secretadas en los sobrenadantes de las células o oxMACC1 shMACC1 GC. (E) Imágenes representativas (panel izquierdo) y cuantificación (panel derecho) de TWIST1 inmunotinción en los tejidos de xenoinjerto GC. WT, de tipo salvaje. V, vector. Buey, oxMACC1. S, scramble. Sh, shMACC1. Barra de escala = 50 micras. * P & lt; 0,05;
#P & lt; 0,01, n = 3.
Hasta ahora, parece que TWIST1 está implicado en la angiogénesis dependiente del endotelio inducida por MACC1, por lo que no viene otra posibilidad: es necesario TWIST1 en la angiogénesis inducida por MACC1
TWIST1 es necesario para la angiogénesis inducida por MACC1 en células GC
para determinar si TWIST1 es importante para la angiogénesis inducida por MACC1 en GC, que sobreexpresa el gen TWIST1 ectópico (oxTWIST1) en las células y shMACC1 derribado el TWIST1 endógena (siTWIST1) en las células oxMACC1. Tres construcciones independientes siRNA contra TWIST1 en la región ORF se utilizaron (S2 Tabla). En los niveles de mRNA, todos los tres siTWIST1 suprimido con éxito TWIST1 expresión y el más eficiente se utilizó para transfectar células GC (S3 FIG). La eficiencia de la sobreexpresión o el silenciamiento se verificó mediante qRT-PCR y Western blot.
A continuación, se detecta el nivel de expresión de la proteína VEGF-A por Western blot en líneas celulares de GC. En ambas líneas celulares, cambios en la expresión de VEGF-A de proteínas fue, obviamente, se incrementaron en oxTWIST1 (P = 0,015 y P = 0,02, la figura 6A), pero que se redujo significativamente por siTWIST1 (P = 0,022 y P = 0,01, la figura 6B). En el ensayo de formación de tubo, la densidad de la formación del tubo fue promovida por oxTWIST1 (P = 0,007 y P & lt; 0,001) y fue inhibida por siTWIST1 (P & lt; 0,001 y P & lt; 0,001, figura 6C). En conjunto, los resultados de estos conjuntos complementarios de sobreexpresión y desmontables experimentos demostraron que TWIST1 era necesaria y suficiente para participar en la angiogénesis dependiente del endotelio MACC1 inducida, lo que significa que MACC1 la angiogénesis inducida por la activación de la /VEGF-A eje angiogénico TWIST1 en GC.
(a & amp; B) Western blot (panel superior) y cuantificación (panel inferior) de VEGF-a expresión en silenciamiento de MACC1 (shMACC1) las células de GC que sobreexpresan TWIST1 (oxTWIST1) y la sobreexpresión de MACC1 (oxMACC1 GC) las células que silenciados TWIST1 (siTWIST1). * P & lt; 0,05;
#P & lt; 0,01, n = 3. (C) micrografías representativas de la formación de tubos similares a vascular en cultivos tridimensionales de HUVECs tratadas con los sobrenadantes de shMACC1 /oxTWIST1 o oxMACC1 /siTWIST1, y con los controles correspondientes a las 12 h. Barra de escala = 50 micras. * P & lt; 0,05;
#P & lt; 0,01, n = 3 en cada grupo.
Discusión
La angiogénesis se cree que es un paso crucial en la progresión del cáncer, y varios estudios han demostrado sus papeles en tumores malignos agresivos [24] . A pesar de que los estudios anteriores han encontrado múltiples factores reguladores eficaces que promueven la angiogénesis dependiente del endotelio [14, 15, 18, 25], el papel potencial de MACC1 en la angiogénesis GC sigue siendo desconocido. En este estudio, se investigó principalmente la función de MACC1 en la angiogénesis dependiente del endotelio de GC. Los resultados mostraron que la regulación positiva de MACC1 tuvo correlación significativa con una mayor MVD y VEGF-A expresión en GC. La combinación de positividad y de alta MACC1 MVD predijo DFS cortas en pacientes con cáncer gástrico. Además, hemos encontrado que MACC1 aumentó la expresión de TWIST1 en líneas celulares de GC y facilitó la formación de tubos de HUVEC. MACC1 no sólo eleva el VEGF-A nivel in vitro, sino también aceleró el crecimiento del tumor y indujo la formación de microvasos in vivo. Por lo tanto, los datos actuales de nuestros estudios indican que MACC1 es un promotor de oncogénico para la angiogénesis dependiente del endotelio y la progresión tumoral en GC.
ya se ha informado de que MACC1 se veía afectada por el estrés metabólico a través de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK ) de activación, e implicado en el metabolismo energético tumoral al aumentar el efecto Warburg [9]. MACC1 promovió la proliferación celular y la invasión GC mediante la inducción de la transición epitelial-mesenquimal (EMT) a través de la activación de HGF /c-Met vía de señalización [8], y la formación de VM inducida de GC por HGF /c-Met-TWIST1 /2-VE- eje de señalización cadherina /VEGFR2 [4]. Además, se ha informado de que MACC1 participa en diversas redes de señalización, incluyendo Akt /β-catenina [26] y Ras /ERK [27], de los cuales también se informó de la activación para mejorar la expresión TWIST1 [28-30]. En líneas celulares de cáncer de páncreas, el HGF /c-Met se ha demostrado para transmitir la señal intracelular a través de la vía MAPK [31], y es esencial para fosforilar y estabilizar TWIST1 en cáncer de mama [28]. Nuestro estudio anterior proporcionó la primera evidencia de que MACC1 transcriptionally upregulated TWIST1. Mientras tanto, hemos demostrado que el HGF facilitó la translocación nuclear de MACC1 y la regulación positiva de TWIST1 promover VM en GC, mientras que un inhibidor de c-Met antagoniza este proceso [4]. Sin embargo, [5], su relación con TWIST1 en la angiogénesis dependiente del endotelio de GC aún no ha sido encontrado MACC1 como el factor regulador clave de la vía de HGF c-Met señalización //MAPK. En el presente estudio, nuestros resultados demostraron que la expresión regulada positivamente MACC1 TWIST1 e indujo la formación de tubo vascular en HUVEC. Por lo tanto, MACC1 como un factor transcripcional podría modular transcripcionalmente la angiogénesis dependiente del endotelio y mediar TWIST1 regulación al alza, que es responsable de la angiogénesis tumoral y la progresión de la GC
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Hasta la fecha, se cree que el papel predominante de TWIST1 en la progresión tumoral para ser la inducción de EMT [32]. Muy pocos estudios revelaron que TWIST1 promovió la angiogénesis dependiente del endotelio en cáncer de mama [33] y en el carcinoma hepatocelular [34] mediante el reclutamiento de macrófagos, la alteración de la metaloproteinasa 9 expresión y activación de VEGF-A de señalización [19]. Para investigar más si TWIST1 es también como un mediador crítico en la angiogénesis dependiente de endotelio inducida por MACC1 en GC, hemos identificado que la expresión de TWIST1 se incrementó significativamente en presencia de MACC1. Por otra parte, silenciando TWIST1 suprime en gran medida la formación de tubos MACC1 mediada de HUVECs, lo que sugiere que TWIST1 se requiere para la angiogénesis mediada por MACC1 de GC.
Los mecanismos subyacentes a la angiogénesis inducida por VEGF-A de células de cáncer en tanto básica como estudios de investigación clínica se han investigado intensamente [35-37]. Se ha sugerido que VEGF-A actúa como un interruptor para promover la angiogénesis [38]. En concordancia con el papel crítico de VEGF-A en la angiogénesis, el presente estudio validó que la expresión de VEGF-A y MVD, así como el crecimiento del tumor se incrementó significativamente en células de sobreexpresión de GC MACC1. En general, estos resultados indican que la vía de señalización de VEGF-A está implicada en MACC1 /inducida por TWIST1 angiogénesis dependiente del endotelio de GC.
Conclusiones
En conclusión, nuestro estudio proporcionó las pruebas clínicas y experimentales para la función de MACC1 en la angiogénesis dependiente del endotelio de GC. La expresión ectópica de MACC1 promovió la proliferación de tumores, la expresión TWIST1 significativamente upregulated in vivo, y la formación de tubo vascular inducida in vitro. Estos hallazgos indican que MACC1 promueve la angiogénesis dependiente del endotelio en GC por la vía de señalización que se muestra en la figura 7. La comprensión de cómo MACC1 está implicada en la patogénesis de GC será útil para el desarrollo de posibles objetivos terapéuticos en la gestión de GC.
Resumiendo diagrama de este estudio, la sobreexpresión MACC1 en el cáncer gástrico (GC) activa el eje angiogenetic TWIST1, lo que conduce a la regulación positiva de VEGF-a, y facilita la angiogénesis. A continuación, la angiogénesis promueve el crecimiento celular GC. * P & lt;