se espera
Extracto
Antecedentes
Proteómica para jugar un papel clave en el descubrimiento de biomarcadores del cáncer. Aunque se ha vuelto factible analizar rápidamente proteínas a partir de extractos de células en bruto usando espectrometría de masas, la composición muestra compleja dificulta este tipo de medición. Por lo tanto, para el análisis de proteoma eficaz, se hace crítico para enriquecer las muestras para los analitos de interés. A pesar de que un tercio de las proteínas en las células eucariotas se cree que están fosforilados en algún momento de su ciclo de vida, sólo un bajo porcentaje de las proteínas intracelulares es fosforilada en un momento dado.
Metodología /Principales conclusiones
En este trabajo, se han aplicado técnicas cromatográficas fosfopéptido de enriquecimiento para reducir la complejidad de las muestras clínicas humanas. Un nuevo método para alto rendimiento péptido de perfiles de muestras de tumores humanos, utilizando IMAC paralelo y MALDI-TOF MS, se describe. Hemos aplicado esta metodología para analizar las muestras pulmonares normales y cancerosas humanas en la búsqueda de nuevos biomarcadores. El uso de un algoritmo de procesamiento espectral altamente reproducible para producir perfiles de masas de péptidos con una variabilidad mínima través de las muestras, se generaron modelos de clasificación basados en los árboles lineales basados en discriminantes y de decisión. Estos modelos pueden distinguir normal a partir de muestras de tumores, así como diferenciar los diferentes subtipos histológicos de células de cáncer de pulmón no microcítico.
Conclusiones /Importancia
Un novedoso y optimizado método de preparación de muestras y datos de una cuidadosa estrategia de adquisición se describe para alto rendimiento péptido de perfiles de pequeñas cantidades de muestras de pulmón y cáncer de pulmón normales humanos. Se demuestra que la combinación apropiada de valores de expresión de péptido es capaz de discriminar pulmonar normal de no pequeñas muestras de cáncer de pulmón de células y entre diferentes subtipos histológicos. Nuestro estudio hace hincapié en el gran potencial de la proteómica en la caracterización molecular del cáncer
Visto:. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, M Nistal, Calvo E, R Madero, Díaz E, et al. (2009) MALDI perfiles de cáncer de pulmón humano subtipos. PLoS ONE 4 (11): e7731. doi: 10.1371 /journal.pone.0007731
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 3 Julio, 2009; Aceptado: 8 Octubre 2009; Publicado: 5 Noviembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Gámez-Pozo et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Conceder una ayuda : FIS CP05 /00248, FIS PI050668 y Red Tematica de Investigación Cooperativa en cáncer (RTICC, RD06-0020-1022) del Fondo de Investigación Sanitaria (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovacion, España). Grant financiado por la Fundación Mutua Madrileña. A. Gamez-Pozo es el beneficiario de una beca por el Ministerio de Educación, España. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En los países occidentales, el cáncer de pulmón representa la causa principal de muerte relacionada con el cáncer [1]. La tasa de supervivencia global a los 5 años es del 15% y no ha mejorado a lo largo de muchas décadas. Esto es principalmente debido a que aproximadamente dos tercios de los cánceres de pulmón se descubren en etapas avanzadas. Por otra parte, incluso entre pacientes en estadio temprano que son tratados principalmente por medio de cirugía con intención curativa, 30-55% desarrollará y morir de recurrencia de metástasis [2].
Hoy en día, el cáncer de pulmón se clasifica de acuerdo con criterios histológicos. Los cuatro subtipos principales son: cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), carcinoma de células escamosas (SC), adenocarcinoma (AC), y carcinoma de células grandes (LC). Clínicamente, los tres últimos son considerados como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que representa alrededor del 85% de todos los cánceres de pulmón [3]. diagnóstico preciso y clasificación de los cánceres son críticos para la selección de terapias apropiadas. El advenimiento de las terapias dirigidas eficaces para el cáncer de pulmón, tales como el factor de crecimiento epidérmico inhibidores del receptor de erlotinib y gefitinib, y la posibilidad de desarrollar terapias específicas adicionales, ha hecho hincapié en la importancia de un diagnóstico exacto [4].
La proteómica es espera que juegue un papel clave en el descubrimiento de biomarcadores del cáncer. Aunque se ha vuelto factible analizar rápidamente proteínas a partir de extractos de células en bruto usando espectrometría de masas, la complejidad de la muestra complica estos estudios [5], [6]. Por lo tanto, para el análisis de proteoma eficaz, es esencial para enriquecer las muestras para los analitos de interés [7]. A pesar de que se cree un tercio de las proteínas en células eucariotas ser fosforilados en algún momento de su ciclo de vida, sólo un bajo porcentaje de las proteínas intracelulares se fosforila en un momento dado [8], [9]. Por lo tanto, una purificación o enriquecimiento paso que aísla las especies fosforiladas se reduciría la complejidad y aumentar la sensibilidad [10].
perfiles MALDI es una de las técnicas más prometedoras para reducir la brecha entre la proteómica de alto rendimiento y clínica [7] , [11]. MALDI MS puede ser utilizado como un método de alto rendimiento con una sensibilidad excepcional [6], permitiendo estudios comprometedoras grandes series de pacientes, y tiene el potencial de revolucionar el diagnóstico precoz de muchas enfermedades [12]. Esta capacidad se ha ejemplificado por MALDI perfiles de proteínas en muestras de tumores, lo que permitió la identificación de marcadores que podrían ser correlacionada con los resultados de evaluación y de pacientes histológicos a través de análisis estadístico [13], [14]. En este trabajo, hemos aplicado técnicas de enriquecimiento de fosfopéptidos a pequeñas muestras clínicas humanas basadas en metálico inmovilizado cromatografía de afinidad (IMAC) para reducir la complejidad de la muestra. Para detectar nuevos biomarcadores, hemos definido un flujo de trabajo de análisis de datos aplicando los métodos de clasificación basados en los árboles lineales basados en discriminantes y de toma de analizar los perfiles de péptidos a partir de muestras pulmonares normales y cancerosas humanas mediante espectrometría de masas.
Métodos
Ética declaración
en el momento del diagnóstico inicial, todos los pacientes había dado su consentimiento en el sentido de que sus muestras de tumor se podrían utilizar para los propósitos de investigación. Se obtuvo la aprobación institucional de nuestro comité de ética para el desarrollo del estudio (Comité Ético de Investigación Clínica, Hospital Universitario La Paz). Los datos fueron analizados de forma anónima. Los pacientes dieron su consentimiento por escrito para que sus muestras y datos clínicos podrían ser utilizados con fines de investigación
Muestra la selección
Las muestras congeladas de los pacientes diagnosticados de cáncer de pulmón:. (15 adenocarcinoma (AC), 15 escamosas el carcinoma de células (SC) y 14 carcinoma de células grandes (LC) muestras) y 15 muestras de pulmón normales (NL) fueron recuperados de la Departamento de Patología del hospital Universitario la Paz (Madrid, España). Las características histopatológicas de cada muestra fueron examinadas por un patólogo experimentado pulmonar para confirmar el diagnóstico y el contenido del tumor. muestras elegibles tenían que incluir al menos el 50% de las células tumorales.
extracción de proteínas totales, solubilización, y la digestión
Las muestras se cortaron en un criostato Leica CM3050S, obteniendo 10 secciones de 10 micras de espesor de cada. El tejido se procesa con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carsbald, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los sedimentos se resuspendieron en clorhidrato de guanidina 6 M y 10 minutos se calentó a 95 ° C con agitación. Posteriormente, se añadieron 950 l de bicarbonato de amonio 50 mM (pH 7-9) por muestra. concentración de la muestra de proteína se midió por MicroBCA kit de ensayo de proteínas (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Se añadió tripsina MS Grado Oro (Promega, Madison, WI, EE.UU.) a cada muestra a una relación 1:50. La digestión se llevó a cabo durante la noche a 37 ° C. La muestra digerida se dividió en dos alícuotas.
IMAC paralelo (PIMAC)
IMAC-Fe (III) sobre la base se llevó a cabo en una alícuota de la proteína digerida con PHOS-Select hierro Affinity Gel (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Ga basado en IMAC (III) se llevó a cabo en la otra alícuota de proteína digerida con el Kit de Aislamiento fosfopéptidos (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se almacenaron a -20 ° C hasta su posterior análisis.
análisis por espectrometría de masas fosfopéptidos
mezclas de péptidos se secaron al vacío y se disolvieron en una solución que contiene acetonitrilo (30%) y TFA (0,1% ). Después de baño-sonicación (3 min), los péptidos fueron 1:01 mezclado con ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) o ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) utilizados como matrices. Un volumen de 0,5 l se depositó sobre la placa de MALDI y se mantuvo a temperatura ambiente hasta que se seca. MALDI-MS espectros (dos repeticiones) se midieron en un espectrómetro de masas Bruker Ultraflex TOF /TOF MALDI (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, EE.UU.) [15] en el modo de ion positivo reflector. Para la identificación de proteínas, los iones de péptidos de interés fueron objeto de análisis MALDI-MS /MS en el modo TOF /TOF, y el correspondiente MS /MS espectros fueron transferidos a través del programa MS BioTools (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, EE.UU.) como entradas para buscar la base de datos utilizando el software NCBInr MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido) [16].
diferencial de selección m /z picos
ClinProTools (CPT) de software 2.1 (Bruker-Daltonics , Billerica, MA, EE.UU.) se utilizó para seleccionar diferenciales picos m /z entre las muestras subtipos (NL, AC, SC y LC). Los espectros se procesa de la siguiente manera:
La normalización de todos los espectros a su Ion de cuentas totales, España
La recalibración de los espectros de sí utilizando los más prominentes picos m /z, España
Línea de Base resta y la detección de pico m /z.
Una vez normalizado y ajustado, CPT selecciona rangos de masa que fueron consideradas como m /z picos, y calcula las áreas de pico para cada espectro [17]. Los espectros se divide en dos sets (Set 1 y Set 2), que incluyen una medición puntual diferentes por muestra. Cada conjunto se dividió en cuatro grupos dependiendo de los espectros de las combinaciones entre la matriz MALDI y IMAC metálico (Mx-Mt) utilizado para obtenerlos (DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe-Ga y CHCA). Cada uno de estos grupos espectros se dividieron posteriormente en subgrupos histológicos (NL, AC, SC y LC) y se analizaron por separado por CPT. CPT ajustes fueron S /N & gt; 3 y Savitzky-Golay suavizado (1 ciclo, m /z gama = 5) [18]. La combinación de estas listas da una lista pico de m /z Mx-Mt combinado. A continuación, incluimos todos los espectros de una combinación Mx-Mt en CPT para medir todos los picos m /z en el corresponsal combinado Mx-Mt lista pico de m /z. Con picos de Kruskal-Wallis p-valor & gt; 0,1 fueron descartados. Se seleccionaron picos Común m /z entre dos conjuntos. Por último, la prueba de Pearson entre los valores de área de cada pico m /z logrado en Set 1 y Set 2 para todas las muestras se realizaron y los picos m /z con r & lt; 0,4 fueron excluidos. De este modo, se obtuvieron cuatro listas definitivas Mx-Mt de m /z picos: DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe y enumera CHCA-Ga. Seleccionados picos de m /z se consideraron picos consistentes.
Análisis discriminante y la generación de modelos
Análisis discriminante de cada uno de las listas de pico m /z Mx-Mt final se realizó en SPSS 9.0. m /z picos incluyen en cada modelo discriminante fueron incluidos en un segundo análisis discriminante por pasos, lo que permitió la creación de un modelo de discriminación global, incluyendo m /z picos de todas las combinaciones Mx-Mt.
supervisadas agrupación jerárquica
en pocas palabras, un vector se asigna a cada elemento de pseudo-y este vector se utiliza para calcular las distancias entre este punto de pseudo-y todos los elementos restantes o pseudo-elementos utilizando la misma métrica de similitud que se utilizó para calcular la matriz de similitud inicial. Los análisis se realizaron en BRB-ArrayTools v3.6.1 desarrollado por el Dr. Richard Simon y Amy Lang Peng.
conjunto algoritmo de árbol de decisión
Con el objetivo de seleccionar los picos que podrían diferenciar entre subtipos histológicos de las muestras de cáncer de pulmón, construimos un clasificador multi-pico utilizando AdaBoost decisión basado en árboles clasificador conjunto [19], [20]. Se realizaron tres análisis independientes: CA vs. (SC + LC), LC vs (CA + SC) y SC vs (AC + LC) utilizando la lista de pico m /z DHB-Ga final. m /z valores de intensidad de pico normalizadas de set1 se utilizaron como conjunto de entrenamiento. m /z valores de intensidad de pico normalizadas de conjunto2 se utilizaron como prueba de conjunto. 200 iteraciones se realizaron en todos los casos. El área bajo la ROC (Recibir Operating Characteristic) curva (AUC) es igual a la probabilidad de clasificar correctamente un par de muestras, cada una para una clase separada, y se utiliza como una medida de rendimiento del clasificador (20). Los análisis estadísticos se realizaron en I versión 2.4 con la versión de paquete de software Boost 1.0-0 y SPSS 9.0.
Los análisis estadísticos para los picos identificados
Después de la identificación de proteínas por MS /MS, ANOVA (cuando sea posible se llevaron a cabo) y Kruskall-Wallis análisis para evaluar las diferencias en la expresión de tales proteínas en los diferentes subtipos histológicos. U de Mann-Whitney se aplicó para estudiar las diferencias entre los dos subgrupos después de los análisis de Kruskall-Wallis. Los análisis estadísticos se realizaron en SPSS 9.0.
La inmunohistoquímica
fijados con formalina, bloques de tejido incluido en parafina, representante de diagnóstico de NSCLC, se recuperaron después de una evaluación histopatológica de rutina. Las secciones se procesaron utilizando un sistema de tinción universal de Dako Autostainer (Dako, Glostrup, Dinamarca). Para este estudio, las secciones de 3,5 micras se immunostained con CK8 anticuerpo monoclonal (1:100 dilución; Novacastra, Newcastle upon Tyne, Reino Unido). Se evaluaron dos secciones de tejido de cada muestra.
Resultados
El objetivo principal del presente estudio fue determinar si los perfiles de péptidos trípticos, obtenidos a partir de muestras pulmonares normales y tumorales humanas utilizando PIMAC y MALDI técnicas TOF MS, podían discriminar pulmón normal (NL) por cáncer de pulmón, así como entre los subtipos histológicos de cáncer de pulmón más común: adenocarcinoma (AC), carcinoma de células grandes (LC) y el carcinoma de células escamosas (SC). Sólo se seleccionaron 49 de 59 muestras para el siguiente análisis ya que las muestras sin un contenido mínimo de 50% las células tumorales fueron descartados. Por lo tanto, 15 NL, 14 AC, 9 LC y 11 muestras SC se analizaron posteriormente. El espectro de masas generado para cada muestra contenía típicamente varios cientos de picos con S /N & gt;. 3 [5]
intensidades de señal de masa de péptidos trípticos derivados de mezclas de proteínas complejas están mediadas por varios factores, a saber, la concentración de proteína relativa , variando la eficiencia digestión enzimática, y las eficiencias de desorción /ionización dependientes de la secuencia. Se realizó un procedimiento de procesamiento de espectros altamente reproducible para obtener perfiles de picos con un alto grado de concordancia en la serie de muestras. picos m /z consistentes fueron seleccionados siguiendo estos criterios: picos de masa tenía que estar presente en las dos posiciones de la muestra y de correlación de Pearson entre las intensidades de cada pico alcanzado en Set 1 y Set 2 para todas las muestras tuvieron que ser & gt; 0,4. coeficiente de correlación de Pearson media fue de 0,8 para los picos de DHB y 0,65 para los picos de CHCA. Un requisito adicional (Kruskal-Wallis p-valor de & lt; 0,1) se aplicó con el fin de incluir a los picos con el poder discriminatorio entre los subtipos de muestra. Estos criterios proporcionan una metodología consistente y reproducible, como se muestra mediante el coeficiente de correlación de Pearson media de picos de masa seleccionados.
Hemos investigado la superposición entre los picos seleccionados por cada una de las combinaciones Mx-MT (Figura S1). En general, 97 picos de masa consistentes fueron identificados a través de las cuatro combinaciones Mx-Mt. Con respecto a matrices MALDI, 81 picos se midieron en DHB y 41 en CHCA análisis. En contraste, 80 picos se midieron en IMAC basados en Ga y 42 en IMAC a base de Fe análisis. En ambos casos, se encontraron 25 picos superpuestos. Sólo cuatro picos fueron siempre presente a través de todas las combinaciones Mx-Mt
.
Una vez seleccionados los picos consistentes, un análisis discriminante paso a paso se llevó a cabo en cada lista final de pico Mx-Mt. Por lo tanto, cuatro modelos discriminantes se construyeron y las señales de masas que participan en cada modelo se enumeran en la Tabla S1. Todos estos modelos discriminantes fueron capaces de clasificar las muestras en cuatro grupos, que corresponden a NL, AC, SC y LC. Los porcentajes de muestras correctamente clasificadas por cada modelo y dejar uno fuera porcentajes de validación cruzada de las muestras clasificadas correctamente se muestran en la Tabla S1. Un segundo análisis discriminante paso a paso se realizó con picos incluidos en los cuatro modelos Mx-Mt discriminantes (22 picos) para evitar la inclusión de señales ruidosas de masas en el análisis. El Modelo Global incluyó 9 picos de m /z y clasificó correctamente el 98,0% de las muestras (48 de 49) en el LOOCV.
Se realizó un Supervisado jerárquica Centroide Vinculación La agrupación utilizando los 9 picos incluidos en el modelo global. Como se muestra en la Figura 1, hay dos grupos principales, separando muestras de pulmón normales de la mayoría de las muestras tumorales. Sin embargo, no es perfecta separación entre los subtipos histológicos. Con el fin de seleccionar las señales de masas que podrían caracterizar muestras de un subtipo histológico cuando se compara con los otros subtipos de muestras de NSCLC, se realizó conjunto clasificador basado en árbol AdaBoost decisión. Se realizaron tres análisis independientes: CA vs. (SC + LC), LC vs (CA + SC) y SC vs (AC + LC), a partir de datos de juego 1 como conjunto de entrenamiento y datos en el Grupo 2 como prueba de fijar de la lista definitiva de pico DHB-Ga. El área bajo la curva (AUC) de la República de China se calculó para cada comparación, tanto en la formación y el equipo de prueba. Se obtuvo la influencia relativa de cada pico en la generación de modelos. El área bajo la curva ROC y superior picos para cada comparación se muestran en la Tabla 1.
mapa de calor de la Supervisado jerárquica Centroide Varillaje de agrupación de áreas de los picos m /z normalizados, en dos dimensiones, para las 49 muestras y los 9 m /z picos incluidos en el modelo discriminante mundial.
identificación MS /MS de algunos picos m /z seleccionados por discriminante y el análisis se realizó AdaBoost por MALDI-TOF /TOF ( S2 Tabla). Con el fin de evaluar las diferencias en las señales de péptido identificado entre los subtipos histológicos, ANOVA y Kruskal-Wallis se realizaron análisis. ß-globina señales de masas mostró una significativa disminución de la intensidad en las muestras tumorales en comparación con los de pulmón normal, mientras que GAPDH y picos beta-actina mostraron una mayor intensidad en las muestras tumorales. intensidad máxima CK8 disminuyó en carcinomas de células grandes, en comparación con adenocarcinoma y muestras de carcinoma de células escamosas.
Se analizó el patrón de expresión mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) de algunos de estos marcadores. La proteína humana Atlas (http://www.proteinatlas.org/) [21] muestra la expresión y localización de las proteínas en una gran variedad de tejidos normales y de cáncer humano, así como líneas de células con la ayuda de IHC. los perfiles de expresión IHC para β-actina y GAPDH fueron evaluados en esta base de datos útil. Hay un aumento de la expresión de β-actina en algunas muestras de cáncer de pulmón en comparación con los normales. Sin embargo, la expresión de GAPDH en el cáncer de pulmón es muy variable. Además, se realizó un análisis IHC de expresión CK8 en cinco muestras de CA, LC y SC. No se encontraron células positivas para CK8 inmunotinción en todas las muestras de LC y AC. En contraste, sólo tres de las cinco muestras de SC mostraron tinción positiva. Positivamente las muestras teñidas mostraron un promedio de 20-70% de células teñidas (Figura 2).
CK8 inmunotinción (aumento x 40). Las flechas apuntan a las células tumorales. (A) El carcinoma de células escamosas del pulmón que muestra células tumorales teñidas negativas. Pulmón epitelio muestra la tinción positiva. (B) el carcinoma de células escamosas del pulmón teñidas positivamente. (C, D) el carcinoma de células grandes de pulmón mostrando diferentes grados de tinción positiva. (E, F) adenocarcinoma de pulmón que muestra diferentes grados de tinción positiva.
Discusión
perfiles de expresión génica global ha mejorado nuestra comprensión de la heterogeneidad histológica de células no pequeñas cáncer de pulmón y ha identificado biomarcadores potenciales y firmas de genes para la clasificación de pacientes con significativamente diferentes resultados de supervivencia [22]. Una amplia comprensión de los mecanismos detrás de la carcinogénesis, la progresión tumoral y la metástasis requerirá un análisis en profundidad de no sólo el genoma, sino también el proteoma [23]. Los análisis a nivel de genes no pueden detectar las sutilezas biológicos introducidos a través de modificaciones post-traduccionales de las proteínas y por lo tanto requiere un enfoque proteómico [5], [24].
La reproducibilidad se ha demostrado que comprometer perfiles de proteínas en todas las etapas, de métodos de aislamiento de péptido a la muestra de adquisición y procesamiento de los espectros de [5], [11], [25], [26]. En este estudio, hemos aplicado técnicas cromatográficas fosfopéptido de enriquecimiento para reducir la complejidad de las muestras de cáncer de pulmón humano aislado y analizado péptidos por MALDI-TOF MS. Se describe un método de selección de pico de masa que se obtiene un perfil peptídico reproducible a partir de experimentos MALDI MS utilizando ClinProTools. Groseclose et al. describe una limitación de la utilización de CPT es que los picos que pueden ser importantes entre un pequeño subconjunto de los espectros en un grupo, podrían llegar a ser insignificante cuando se promedia con la otra espectros en ese grupo [5]. Con el fin de evaluar la mayor cantidad posible de picos, se realizó una etapa previa en la selección de pico utilizando CPT. En cada análisis Mx-Mt, se introdujeron todos los espectros de un solo subtipo de la muestra en la CPT, la obtención de una lista pico característico subtipo. Una vez que se obtuvieron todas las listas de subtipo, una nueva lista fue generado por combinación, incluyendo todos los picos presentes en estas listas subtipo. Posteriormente, los espectros de todos los subtipos de la muestra se incluyeron en CPT, y se midieron todos los picos en esta lista combinada. Se confirmó que algunos picos discriminantes fueron excluidos cuando los espectros de todos los subtipos de la muestra se incluye directamente en CPT y se lleva a cabo análisis estándar.
Es de destacar que cuando se utiliza DHB como una matriz MALDI proporcionado un mayor número de picos de masa como en comparación con CHCA. Del mismo modo, el enfoque basado en IMAC Ga produce señales más masa en comparación con el ensayo basado en Fe. Además, las listas de pico derivadas de los espectros de DHB mostraron una mayor correlación media entre los conjuntos de datos. Estos resultados sugieren que MALDI análisis utilizando IMAC basados en Ga y DHB como MALDI matriz son más reproducible y proporcionar un mayor número de señales de masas. Los picos identificados derivados de proteínas altamente expresadas y las restantes péptidos que discriminan no pudieron ser identificados por MALDI MS. estrategias de identificación de alternativas deben ser probados con el fin de aumentar la identificación de señales de baja intensidad en los estudios MALDI MS
.
Los análisis discriminante nos permitió separar las muestras de pulmón y de NSCLC normales y para identificar los péptidos que mejor discriminaron entre normal y enfermo tejidos, como se muestra por análisis de agrupamiento (Figura 1). Sin embargo, esta tarea no es generalmente problemática debido a las importantes diferencias entre los tejidos normales y cancerosas. Lo que prueba es más difícil encontrar diferencias entre los subtipos histológicos distintos. Como se muestra en la Figura 1, hay dos grupos principales de las muestras de cáncer de pulmón, incluyendo adenocarcinomas y carcinomas de células grandes por separado, pero las muestras de carcinoma de células escamosas de todas formas dividido entre estos grupos.
Se ha descrito que los clasificadores del conjunto superan sola árboles de decisión clasificador por tener mayores precisiones y los errores de predicción más pequeños cuando se aplica a la proteómica conjuntos de datos [27]. Por lo tanto, hemos probado si AdaBoost análisis podrían clasificar las diferentes muestras de NSCLC correctamente. Nuestros resultados sugieren que AdaBoost puede discriminar muestras de subtipo histológico un cáncer de pulmón de los otros dos. El uso de repeticiones técnica como prueba de conjunto nos ha permitido evaluar la robustez de la metodología empleada.
Nuestros datos sugieren que tanto GAPDH y β-actina tienen un riesgo significativamente expresión en muestras de cáncer de pulmón. La sobreexpresión de GAPDH en los cánceres de pulmón humano fue descrita previamente por Tokunaga et al [28] y hay muchas publicaciones que muestran aumento de la expresión de GAPDH en mama [29], de páncreas [30] y de cuello uterino [31] [32], los cánceres humanos. Por otra parte, varios estudios indican que β-actina se expresa de forma diferente en el cáncer humano (revisado en 28). Ambas proteínas mostraron niveles de hepatoma de rata [33] aumentaron. Por otra parte, los perfiles de expresión IHC para β-actina y GAPDH, evaluada a la proteína humana Atlas, fueron muy variables en las muestras de cáncer de pulmón. Estos resultados cuestionan el uso de estas proteínas como productos de limpieza en los análisis proteómicos de muestras de cáncer.
citoqueratina 8 (CK8) es una proteína de filamentos intermedios II tipo que se expresa persistente en la mayoría de los tumores malignos epiteliales [34], incluidas todas subtipos de NSCLC [35]. Los niveles elevados de CK8 en el suero se han asociado con la progresión tumoral y la disminución de la supervivencia en pacientes con NSCLC [36]. En contraste con estos informes, no se observó aumento de la expresión de CK8 en muestras tumorales mediante análisis MALDI-MS. Sin embargo, nos dimos cuenta de que los niveles están disminuidos en Ck8 grandes muestras de carcinoma de células en comparación con el normal de los pulmones.
Para evaluar la utilidad de expresión CK8 como un biomarcador de carcinomas de células grandes, se realizó un análisis IHC de expresión en CK8 15 muestras de cáncer de pulmón (cinco CA, cinco y cinco LC SC). En nuestra opinión, no se pudieron establecer conclusiones sobre la relación entre IHC y la expresión del péptido de perfiles de nuestros datos. Esta diferencia entre las técnicas podría ser debido a fosfopéptido enriquecimiento previo análisis de la muestra o podría implicar que los enfoques MS son más sensibles que IHC. El péptido identificado por MALDI MS /MS (DVDEAYMNKVELES) contiene un sitio de fosforilación potencial en Tyr204, relacionada con la fosforilación por quinasas oncogénicas [37]. Estudios previos que evaluaron la utilidad de CK8 como un biomarcador de cáncer de pulmón no incluían ningún carcinoma de células grandes [35], [36].
El estudio tiene algunas limitaciones. Por lo tanto, hay una capacidad limitada para identificar picos de masa de menor importancia basados en el análisis MS /MS de mezclas de péptidos relativamente complejos. Sin embargo, MALDI MS tiene algunas ventajas para el descubrimiento de biomarcadores: expresión de la proteína y los datos cuantificación relativa pueden ser generados para múltiples muestras de tejido del paciente en un solo experimento. Por otra parte, la comparación de IHC y el péptido de perfiles de expresión de los valores de relación debe hacerse con cuidado, ya que parece que antes de enriquecimiento de afinidad de muestras podría introducir algún sesgo.
Sin embargo, nuestro estudio hacen hincapié en el gran potencial de la proteómica en la caracterización molecular de cáncer. Identificación de proteínas expresadas diferencialmente por PIMAC y MALDI-TOF /TOF MS se realizó en digestos trípticos fraccionados derivados de pequeñas cantidades de tejidos obtenidos de pulmón normal y muestras de NSCLC. El uso de un método de preparación de muestras optimizado y una cuidadosa estrategia de adquisición de datos, hemos superado el reto principal de la reproducibilidad de los perfiles de péptido basado en MS MALDI. Independientemente de la naturaleza de los péptidos identificados por MS /MS, la combinación apropiada de valores de expresión de péptido es capaz de discriminar pulmonar normal a partir de muestras de NSCLC y entre los diferentes subtipos histológicos de NSCLC. Futuros estudios tienen por objeto establecer perfiles de péptido como una herramienta útil en el descubrimiento de nuevos biomarcadores potencialmente relevantes para el diagnóstico o theragnostic.
Apoyo a la Información
Figura S1.
diagramas de Venn que muestra m /z picos solapados entre las listas m /z pico finales a partir de:. (a) cuatro combinaciones diferentes Mx-Mt, (B) resinas IMAC, y (C) matrices MALDI
doi: 10.1371 /journal.pone.0007731.s001 gratis (0.04 MB PPT)
Tabla S1.
porcentajes de muestras clasificadas correctamente, dejando uno fuera porcentajes de validación cruzada de las muestras clasificadas correctamente y picos de m /z se incluyen en cada modelo de combinación discriminante Mx-Mt. Los picos en negrita también se incluyen en el directorio /z picos modelo de discriminación global de 9 m
doi:. 10.1371 /journal.pone.0007731.s002 gratis (DOC 0,03 MB)
Tabla S2.
diferencialmente expresado péptido masas de los espectros de MALDI-CHCA identificadas por MALDI-TOF /TOF y motor de búsqueda MASCOT. MASCOTA individuo iones puntuaciones son significativas (p & lt; 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0007731.s003 gratis (0.03 MB DOC)