Extracto
Mastermind tipo 1 (MAML1) es un coregulator transcripcional de activadores en diversas señalizaciones vías, tales como Notch, p53, miocitos factor de potenciador de 2C (MEF2C) y beta-catenina. En estudios anteriores, hemos demostrado que MAML1 mejorado la actividad acetiltransferasa p300, lo que aumentó la acetilación de Notch por p300. En este estudio, mostramos que MAML1 fuertemente inducidos acetilación del factor de transcripción temprano crecimiento respuesta-1 (EGR1) por p300, y el aumento de expresión de la proteína EGR1 en células de riñón embrionarias.
EGR1
transcritos de ARNm también se upregulated en presencia de MAML1. Se demuestra que MAML1 interactuaba físicamente con, y actuó en cooperación con EGR1 para aumentar la actividad transcripcional del EGR1 y P300 promotores, que ambos contienen sitios de unión EGR1. evaluación bioinformática reveló una correlación entre el
p300
,
EGR1
y
MAML1
número de copias del mRNA y alteraciones en el carcinoma renal de células claras y
p300
,
EGR1
y
MAML1
alteraciones genéticas se asociaron con un aumento de la supervivencia global. Nuestros hallazgos sugieren MAML1 puede ser un componente de las redes de transcripción que regulan los genes diana EGR1 durante nefrogénesis y también podría tener implicaciones para el desarrollo de carcinoma de células renales
Visto:. Hansson ML, Behmer S, R Ceder, Mohammadi S, Preta G, Grafström RC, et al. (2012) Hechos MAML1 cooperativamente con EGR1 para activar EGR1-Regulado Promotores: Implicaciones para la nefrogénesis y el desarrollo de cáncer renal. PLoS ONE 7 (9): e46001. doi: 10.1371 /journal.pone.0046001
Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile
Recibido: Abril 23, 2012; Aceptado: 27 Agosto 2012; De publicación: septiembre 27 de, 2012
Copyright: © Hansson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores recibido el apoyo del Consejo de Investigación sueco, sueco Cancer Society y la Fundación de cáncer Infantil de sueca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Mastermind tipo 1 (MAML1) es el homólogo humano de
Drosophila
Mastermind, un gen neurogénico ligado genéticamente a la función Notch [1], [2]. La vía de señalización Notch desempeña un papel importante en muchos procesos de desarrollo al influir en la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis. En el núcleo, el dominio intracelular de Notch (Notch CIE) se asocia con el factor de transcripción CSL (también conocido como RBP-Jk o CBF1 en los vertebrados, supresor de sin pelo en
Drosophila Opiniones y Lag-1 en
C . elegans
) cuando se une al ADN, y coactivadores como PCAF [3], GCN5 [3], p300 [4] y MAML1 [1], [2] son reclutados para activar la expresión de genes diana Notch . Recientemente, MAML1 se ha demostrado que funcionan como un coactivador factores de transcripción involucrados en una variedad de vías de señalización Notch-independiente, incluyendo 2C factor de miocitos potenciador (MEF2C) [5], p53 [6] y beta-catenina [7], y el N-terminal de MAML1 es crucial para estas interacciones. Estos hallazgos sugieren que las funciones de MAML1 como un coactivador en diversos procesos celulares y pueden ser un mediador de la diafonía entre diferentes vías de señalización. MAML1 también puede afectar a varias vías de señalización mediante la interacción con p300, un coactivador de uso común. Nosotros y otros investigadores han informado anteriormente de que MAML1 media la transcripción mediada por la CIE Notch in vivo, y también puede formar plantillas de la cromatina in vitro, mediante la contratación de p300 a un ADN-CSL-Notch complejo [8], [9], [10]. Recientemente hemos informado de que MAML1 mejora autoacetylation p300, acetiltransferasa de histonas actividad (HAT) y la función coactivador [11]. También se encontró que p300 acetila el Notch1 ICD en ensayos de cultivo de células y
in vitro
, y que las regiones situadas dentro de la muesca C-terminal son esenciales para la acetilación de Notch. MAML1 y CSL, componentes del complejo de transcripción Notch, aumentan fuertemente acetilación Notch y nos sugirieron que MAML1 aumenta la acetilación Notch potenciando p300 autoacetylation [12]. p300 también puede acetilar MAML1, aunque actualmente se desconoce el efecto de esta modificación postraduccional de la función de MAML1. MAML1 es una fosfoproteína, y previamente identificados GSK3ß como una quinasa responsable de la fosforilación de MAML1
in vitro
[13]. La forma activa de GSK3ß interactúa directamente con el N-terminal de MAML1 para inhibir la actividad transcripcional MAML1 [13]. Además, el MAML1 N-terminal está sujeta a Sumoylation, que también reprime la actividad transcripcional de MAML1 [14].
El factor de transcripción temprana de crecimiento respuesta-1 (EGR1) se expresa en respuesta a diversas señales extracelulares , tales como factores de crecimiento, citoquinas, radiación, y diversos tipos de estrés. En muchas células normales, la estimulación del factor de crecimiento rápidamente induce la expresión de EGR1, que posteriormente conduce a la activación de las vías de crecimiento aguas abajo [15]. Sin embargo, EGR1 también puede suprimir el crecimiento cuando se sobreexpresa en las células transformadas en varios sistemas experimentales [16]. La respuesta celular a EGR1 con respecto a la apoptosis varía: EGR1 puede inducir la apoptosis mediante la estimulación ya sea p53 o PTEN; sin embargo, EGR1 también puede promover la supervivencia en ciertos tipos de células contrarrestando dependiente de p53 apoptosis [17]. EGR1 juega un papel importante como un supresor de tumor en la mama, el cerebro y el cáncer de pulmón, como EGR1 es pobremente expresado en estos tejidos y actúa como un supresor de crecimiento y la transformación cuando se sobreexpresa [16]. En contraste, la expresión de EGR1 parece ser mantenido en una alta proporción de los cánceres de próstata y de los riñones, donde promueve el crecimiento. EGR1 está ausente o se expresa en niveles bajos en los tejidos normales de la próstata; mientras que el promotor de EGR1 es regulada por un bucle de retroalimentación positiva entre EGR1 y factores de crecimiento en células de cáncer de próstata, lo que resulta en el crecimiento constitutivo. tejidos de cáncer de próstata también expresan altos niveles de p300, lo que conduce a constitutivamente altos niveles de proteína EGR1 acetilado estable, que es un componente importante en la transformación y progresión de esta enfermedad [18]. Los niveles de EGR1 aumentan con el grado de malignidad en el cáncer de próstata, como se indica por la puntuación de Gleason tumor [15]. La capacidad de reducir la expresión EGR1 puede proporcionar un tratamiento clínico eficaz para el cáncer de próstata, como regulación a la baja de EGR1 puede reducir la inducción del factor de crecimiento y regeneración positiva al promotor EGF1.
EGR1 se ha implicado como un factor importante en la nefrogénesis y el desarrollo de cáncer renal. Durante la embriogénesis, EGR1 se expresa en casi todas las células proliferantes, incluyendo blastems metanéfrico; Sin embargo, normalmente se downregulated durante el desarrollo renal [19]. Expresión de EGR1 también es elevada en los tumores de Wilms muchos 'en comparación con los tejidos normales del riñón. El tumor de Wilms es una neoplasia maligna pediátrica del riñón, que a menudo es de origen embrionario [20]. La sobreexpresión de EGR1 se ha informado para aumentar la proliferación, mejorar el crecimiento del tumor y antagonizar los efectos de la supresor de tumor de Wilms tumor 1 (WT1) en células de riñón de rata bebé [21]. El carcinoma de células renales (CCR) es el cáncer renal más común en los adultos, que representan el 80-85% de las lesiones malignas primarias de riñón. CCR de células claras (convencional) y el carcinoma de células renales papilar son los tipos más y segunda más frecuentes de RCC, respectivamente. Strefford y sus colegas informaron de que el cromosoma 5 fue excesivamente y se han reorganizado en una proporción significativa de 19 líneas celulares de carcinoma de células renales, con los genes que codifican
EGR1 gratis (5q31.1) y
CSF1R gratis (de colonias factor estimulante de receptor 1) (5q33-q35) alterado con más frecuencia en el cromosoma 5, más el apoyo a un papel para EGR1 en el cáncer renal [22]. En un estudio previo, se informó de que MAML1 aumento de la actividad autoacetylation p300 y p300 en la acetilación de riñón embrionario (HEK293) células [11]. El objetivo del presente estudio fue investigar si MAML1 y P300 regulan los niveles de EGR1 en células de riñón.
Materiales y Métodos
Los plásmidos
pcDNA3.1-FLAG EGR1 y pGL3-p300 se adquirieron de Addgene (Cambridge, MA, EE.UU.). El plásmido 4xEBS1-luc fue una especie de regalo del doctor G. Thiel (Universidad del Sarre Medical Center, Homburg, Alemania) y pGL3-EGR1 fue generosamente proporcionado por el Dr. T. E. Eling (Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental, Carolina del Norte, EE.UU.). pcDNA3.1-FLAG-MAML1 (1-1016), (1-625) y CMV-p300-HA se han descrito anteriormente [11]. El ADNc que codifica MAML1 (1-127) y (75-1016) fueron amplificados por PCR y se subclonó en el vector de expresión pcDNA3.1-FLAG.
Las líneas celulares
Las líneas celulares fueron MAML1 construido mediante la transfección de riñón embrionario humano (HEK) -293 células con los vectores pcDNA3.1-FLAG-MAML1 o pcDNA3.1-MAML1 y clones estables se seleccionaron con geneticina [11].
siRNA transfección
HEK-293 células fueron transfectadas transitoriamente con 100 nM MAML1 siRNA (prediseñado conjunto MAML1 SmartPool de 4 siRNAs; Dharmacon) o Control de siRNA utilizando DharmaFECT 1 reactivos siRNA (Dharmacon, Lafayette Colorado, USA), y se cultivaron en presencia o ausencia de 50 ng /ml (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, EE.UU.).
Reportero ensayo de gen
HEK 293 células TPA en 24 -Bueno placas fueron transfectadas transitoriamente utilizando el reactivo de tránsito LT1 (Mirus, Madison, WI, EE.UU.) con 200 ng de plásmido reportero de ADN y 150 ng EGR1 o ADN vector de expresión MAML1, como se indica en las figuras. Las células se lisaron en tampón de lisis reportero (Promega, Madison, WI, EE.UU.) después de 24 horas y se midió la actividad luciferasa usando LucySoft3. Los datos se presentan como los valores medios de al menos tres experimentos independientes.
PCR en tiempo real
El ARN total se purificó usando el kit RNeasy mini (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con la el protocolo del fabricante y se sintetizó ADNc utilizando el sistema de síntesis de la primera cadena Superíndice III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). PCR en tiempo real se realizó con mezcla maestra de energía SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en un detector de secuencia 7500 de Applied Biosystems utilizando los conjuntos de cebadores siguientes:
EGR1
adelante, 5'-TACGAGCACCTGACCGCAG- 3 ';
retroceso, 5'-CACCAGCACCTTCTCGTTGTT-3';
18S rRNA adelante, 5'-CCTGCGGCTTTAATTTGACTCA-3 ';
inversa, 5'-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC- 3 '.
EGR1
expresión de ARNm se normalizó a 18S rRNA en cada muestra.
en vivo
acetilación ensayo
HEK -293 células fueron transfectadas transitoriamente con pcDNA3.1-FLAG-EGR1, pcDNA3.1-MAML1 y CMV-p300-HA-LT1 usar el transporte reactivo de transfección (Mirus, Madison, WI, EE.UU.). Después de 24 h, las células se trataron con butirato de sodio 10 mM. Las células se recogieron 40 h después de la transfección, se lisaron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100 y completa de inhibidor de proteasa libre de EDTA-Pierce). La inmunoprecipitación de FLAG-EGR1 se realizó con M2-agarosa que reconoce el epítopo FLAG. Las muestras (IP) de entrada y de inmunoprecipitación se analizaron por transferencia Western utilizando los siguientes anticuerpos: EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.), las lisinas acetiladas en EGR1 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, EE.UU.), p300 (Santa Cruz biotecnología, CA, EE.UU.), MAML1 (Bethyl Laboratories, Cambridge, Reino Unido;. Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) y p300 acetilado lisina 1499 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, EE.UU.)
Co- inmunoprecipitación
lisados de células enteras de células HEK-293 fueron pre-borra y MAML1 endógena se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo MAML1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). Las muestras de entrada e IP se analizaron por transferencia de Western usando los anticuerpos siguientes:. MAML1 (laboratorios Bethyl, Cambridge, Reino Unido) y EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) guía
La inmunotinción
células HCT116 fueron transfectadas con pcDNA3-FLAG-EGR1 y pcDNA3.1-MAML1 usando el reactivo de transfección TransIT-LT1 (Mirus, Madison, WI, EE.UU.), se incubaron durante 24 h, se lavaron con PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído, y se permeabilizaron con 0,5% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Las células fueron immunostained utilizando anticuerpos FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.) y MAML1 (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), y se analizaron usando una microscopía confocal Leica (Leica Microsystems, Wetzler, Alemania).
GST pull-down ensayo
HEK293 se transfectaron con pcDNA3.1-FLAG-EGR1 usando el reactivo de transfección con el tránsito LT1, y se cultivaron durante 2 horas con 50 ng /ml de TPA 24 h después de la transfección . Lisados de células enteras se prepararon y partes alícuotas de 100 l de extracto de proteína en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1 mM de DTT y 1 x completo libre de EDTA cóctel inhibidor de la proteasa) eran se incubaron con proteínas GST (preparada como se describe en [14]) unida a perlas de glutatión Sepharose 4B (GE Healthcare, Little Chalford, Reino Unido) en BC-150 de tampón (Tris-HCl 50 mM de pH 7,5, KCl 150 mM, 10% de glicerol ) durante la noche a 4 ° C. Después de lavar con BC-150 tampón, las proteínas unidas se eluyeron en tampón de SDS-PAGE de carga (1 M Tris-HCl pH 6,8, 50% de glicerol, 10% SDS, 1% de azul de bromofenol, DTT 1 mM), separada por medio de 7,5% geles de poliacrilamida-SDS, se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare, Little Chalford, Reino Unido) y se incubaron con un anticuerpo que reconoce EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.).
ensayo de estabilidad de la proteína
HEK-293 HEK-293 células de control FLAG-MAML1 y se cultivaron en placas de 24 pocillos y se trataron con 50 ng /ml de TPA durante 2 h y 50 mg /ml ciclohexamida (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.) durante 1 h. Las células se recogieron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100 y completo cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA), las proteínas se separaron usando SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia utilizando una anticuerpo que reconoce EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). Las intensidades de las bandas se cuantificaron con la imagen J (rsb.info.nih.gov/ij/index.html).
El análisis bioinformático de
MAML1, EGR1
y
p300
la expresión de
MAML1
,
EGR1
y
p300
fueron analizados en muestras de tumores de cáncer de 20 estudios diferentes que utilizan el cáncer CBio basado en la web Portal genómica (http://www.cbioportal.org/, accedió por última vez 26/07/12) incluyendo los datos de la genómica, por ejemplo, los datos de número de copias de ADN a partir de 5134 muestras (matriz de hibridación genómica comparativa) y los datos de expresión de mRNA de 2430 muestras ( RNA-secuenciación). Putativos de copia alteraciones numéricas tales como amplificaciones y deleciones homocigóticas se derivaron dentro del portal utilizando la "identificación genómica de los objetivos importantes en el cáncer" algoritmo [23]. Los cambios en la expresión de ARNm se consideraron significativas si las muestras mostraron una puntuación Z ≥2 en comparación con la población de referencia (tumores diploides o tejidos adyacentes normales si es aplicable). La asociación de la expresión de genes alterados con la supervivencia global fue evaluado en estudios de cáncer seleccionados mediante análisis de Kaplan-Meier. Las muestras de los pacientes se dividieron en dos grupos en función de "conjunto de genes alterados" o "conjunto de genes no alterado" por medio de los datos genómicos seleccionados, y la supervivencia significativa diferencias entre los grupos se determinaron mediante la prueba de log-rank;
p-valores
& lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados y Discusión
MAML1 regula EGR1 ARNm y la expresión de la proteína
EGR1 estabilidad de la proteína ha sido. informaron que ha de estabilizarse por acetilación p300, lo que resulta en la transactivación de genes de supervivencia [18]. Como ya hemos encontrado que aumenta MAML1 autoacetylation p300, lo que aumentó la actividad de acetilación de p300 [11], nos propusimos investigar si los niveles de expresión EGR1 podrían ser elevados por MAML1. En primer lugar, transfectadas de riñón embrionario (HEK-293) células con
MAML1
siRNA o control (Ctrl) siRNA, y se cultivaron las células en presencia de TPA para inducir la expresión de EGR1. Las proteínas se detectaron por inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen MAML1, EGR1 y GAPDH. se indujo la expresión de EGR1 en células cultivadas con TPA (Figura 1A, carriles 3 y 4); mientras que los niveles de EGR1 se redujeron en células tratadas con
MAML1
siRNA (carril 4), en comparación con las células tratadas con ARNsi de control (carril 3). A continuación, se prepararon extractos de células enteras de células HEK-293 que expresan establemente células MAML1 y control HEK-293, después de la inducción de la expresión de EGR1 con TPA. Las proteínas se detectaron por inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen MAML1, EGR1 y GAPDH. Como se muestra en la Figura 1B, EGR1 se indujo por TPA (carriles 2 y 4) y la expresión de EGR1 aumentaron significativamente en las células que sobreexpresan MAML1 (carril 4). A continuación, se investigó si MAML1 afectada
EGR1
niveles de mRNA. Las células HEK-293 se transfectaron con
MAML1
siRNA o siRNA control, se cultivaron con TPA durante 2 horas, y
EGR1
expresión del ARNm se analizaron por tiempo real RT-PCR. La transfección de células HEK-293 con
MAML1
siRNA redujo significativamente la expresión de
EGR1
mRNA, en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control (Figura 1C). De acuerdo con esta observación,
EGR1
ARNm aumentó en la línea celular que expresa MAML1 después de la inducción con TPA, en comparación con las células control HEK-293 (Figura 1D). Por lo tanto, nuestros datos sugieren que MAML1 podría estar implicado en la regulación de EGR1 ARNm y la expresión de proteínas en células embrionarias de riñón.
células (A) HEK-293 se transfectaron con
MAML1
siRNA o control (Ctrl) siRNA, y se cultivaron en presencia de TPA para inducir la expresión de EGR1. Las proteínas se detectaron por inmunotransferencia utilizando anticuerpos que reconocen MAML1, EGR1 y GAPDH. (B) Los extractos celulares se prepararon a partir de células que expresan las células MAML1 y control HEK-293 cultivadas con TPA. Las proteínas se detectaron por inmunotransferencia utilizando los anticuerpos indicados. (C) HEK-293 células fueron transfectadas con
MAML1
siRNA o siRNA control, se cultivaron con TPA; a continuación,
EGR1
la expresión de ARNm fue analizado por PCR en tiempo real. (D) células control HEK-293 y las células HEK-293 que expresan establemente FLAG-MAML1 se cultivaron con TPA; a continuación,
EGR1
la expresión de ARNm fue analizado por PCR en tiempo real. Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM) y se expresó con relación a
EGR1
niveles en células de control HEK-293 cultivadas en ausencia de TPA.
EGR1 tiene un patrón de expresión espacio-temporal distinta durante nefrogénesis [19], y las alteraciones en la regulación de la expresión de la proteína EGR1 puede dar lugar a efectos no deseados sobre el destino de las células normales. La sobreexpresión de EGR1 se ha informado a aumentar la proliferación de células de riñón y mejorar la tumorigénesis [21]. Por lo tanto, las proteínas que afectan a la expresión de EGR1, como MAML1, pueden en última instancia ser conectados a la vía de señalización de EGR1, que determina el destino celular.
MAML1 interacciona físicamente con EGR1
A continuación se investigó si MAML1 podría inducir la expresión de un promotor diana EGR1, transfectando el reportero 4xEBS-luc que contiene cuatro sitios de unión EGR1 en células que expresan FLAG-MAML1 y control de las células HEK-293, y el cultivo de las células con TPA. La actividad del indicador aumentó cuando EGR1 se indujo en las células de control usando TPA; sin embargo, la actividad de reportero se mejoró casi tres veces en las células FLAG-MAML1 cultivadas con TPA, en comparación con las células de control cultivadas con TPA (Figura 2A). Además, las células HEK-293 fueron co-transfectadas con vectores 4xEBS-Luc y que expresan EGR1 y /o MAML1. Mientras tanto EGR1 y MAML1 incrementaron la actividad del promotor de EGR1; junto EGR1 y MAML1 sinérgicamente indujeron un aumento de 500 veces en la actividad del promotor objetivo EGR1 (Figura 2B). Por lo tanto, nuestros datos sugieren MAML1 pueden ser reclutados para promotores regulados por EGR1, para aumentar la expresión de los genes regulados por EGR1.
(A) FLAG-MAML1 células y HEK-293 que expresan las células de control fueron transfectadas con una luciferasa informador que contiene cuatro sitios de unión (EGR1 4xEBS-luc) y se cultivaron con TPA para inducir la expresión de EGR1. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. (B) las células HEK-293 se co-transfectaron con vectores 4xEBS-Luc y que expresan EGR1 y MAML1. (C) los extractos de células enteras se prepararon a partir de células HEK-293 y de la proteína MAML1 se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo que reconoce MAML1. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos que reconocen MAML1 y EGR1. (D) vectores que expresan FLAG-EGR1 y MAML1 fueron co-transfectadas en células HCT116; después de 24 h las células fueron immunostained utilizando los anticuerpos indicados y se analizaron por microscopía confocal con 100 × lente de aceite.
Para dilucidar si MAML1 interactúa con EGR1, extractos de células enteras se prepararon a partir de células HEK-293 y MAML1 se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo que reconoce MAML1. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos que reconocen MAML1 y EGR1. Como se muestra en la Figura 2C, MAML1 y EGR1 interactuaron en los extractos celulares (carril 3). Para determinar si EGR1 colocalized con MAML1, HCT116 células fueron co-transfectadas con vectores Bandera-EGR1 y MAML1 y immunostained con anticuerpos que reconocen FLAG y MAML1. EGR1 y MAML1 fueron fuertemente colocalized en el núcleo (Figura 2D). Nos dimos cuenta de que el patrón de expresión de EGR1 en el núcleo cambió en presencia de MAML1. Nosotros, y otros, hemos informado anteriormente de que MAML1 colocalize MAML1-proteínas que interactúan con los cuerpos nucleares [24]. Nuestros datos sugieren que EGR1 y MAML1 pueden formar parte de un complejo de transcripción potenciador, que puede aumentar la expresión de genes con sitios de unión EGR1. Tanto MAML1 y EGR1 se expresan de forma endógena en células de riñón embrionarias, y ambos de estos factores de transcripción se han demostrado para regular la expresión génica durante los procesos de desarrollo [25], [26]; Sin embargo, queda por dilucidar si MAML1 y EGR1 cooperan para regular cualquiera de estos genes.
MAML1 y EGR1 activan de forma sinérgica del promotor p300
El promotor de p300 se ha informado que contienen sitios de unión EGR1 y que se rige por EGR1 [18]. Por lo tanto, co-transfectadas las células HEK-293 con un reportero y vectores que expresan EGR1 y MAML1 p300-luc, y después se cultivaron las células en presencia de TPA. EGR1 solo activa el reportero p300-luc en presencia de TPA, y co-transfección de MAML1 con EGR1 aumentó fuertemente la actividad del reportero p300 (Figura 3A). La hipótesis de que MAML1 puede regular la expresión de p300, así como la actividad de acetilación de p300 [11]. Los lisados se prepararon a partir de una línea celular de FLAG-MAML1 y HEK-293 células de control, y los niveles de p300 se analizaron por transferencia de Western usando un anticuerpo que reconoce p300. La expresión de p300 se incrementó en la línea celular MAML1-expresión, en comparación con las células control (Figura 3B, comparar carril 2); mientras que el nivel de expresión de GAPDH, que no es un objetivo MAML1, fue similar en ambas líneas celulares (carriles 1 y 2).
células (A) células HEK-293 se co-transfectaron con un reportero p300-luc , EGR1 y MAML1, después se cultivaron en presencia de TPA para inducir la expresión de EGR1. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. (B) los extractos de células enteras se prepararon a partir FLAG-MAML1 células HEK-293 transfectadas y de control (Ctrl) y MAML1, p300 y GAPDH se detectaron por transferencia de Western. (C) los extractos de células enteras se prepararon a partir de células HEK-293 transfectadas con vectores que expresan FLAG-EGR, MAML1 y P300; BANDERA-EGR1 se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo que reconoce el epítopo FLAG. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se detectaron por transferencia Western utilizando anticuerpos que reconocen EGR1, lisinas acetiladas en EGR1, MAML1, p300 y p300 de lysine1499 acetilado. (D) células HEK-293 que expresan establemente FLAG-MAML1 y HEK-293 células de control se cultivaron con TPA (2 h) en presencia o ausencia de ciclohexamida (1) y la expresión de proteínas EGR1 se analizó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo que reconoce EGR1 . En el gráfico, la expresión de proteínas EGR1 en la línea celular estable MAML1 se expresa en relación con las células control tratadas con ciclohexamida. La relación de intensidades de las bandas antes de la adición de cicloheximida y después de 1 h de tratamiento con cicloheximida se determinó con la imagen J.
EGR1 es un sustrato para la acetilación por p300 [18], y hemos demostrado previamente que MAML1 regula la actividad de p300 mediante el aumento de p300 autoacetylation [11]. Por lo tanto, se investigó si MAML1 regula p300 dependientes de la acetilación de EGR1. extractos de células enteras se prepararon a partir de células HEK-293 y EGR1 se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo que reconoce EGR1. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos que reconocen EGR1, las lisinas acetiladas en EGR1, MAML1, p300 y la lisina acetilada en 1499 de p300 (un marcador de autoacetylation p300). Notamos que la expresión de EGR1 aumenta en presencia de co-expresado MAML1 y /o p300 (Figura 3C, comparar carriles 1 a carriles 2-4). Sin embargo, sólo detectamos acetilados EGR1 en presencia de p300 co-expresó (carriles 3 y 4), que aumentó fuertemente en presencia de MAML1 (carril 4). El aumento de la expresión de la proteína de EGR1 en presencia de co-expresado MAML1 (carril 2) podría ser debido a MAML1 dependiente de la regulación de EGR1 mRNA (véase la Figura 1). De acuerdo con nuestras observaciones anteriores, autoacetylation p300 se incrementó significativamente por MAML1 (comparar los carriles 3 y 4). Así, suponemos que autoacetylated p300 acetila EGR1 más eficiente.
Numerosos informes han descrito cómo acetilación puede aumentar la estabilidad de proteínas [27]. Por lo tanto, se indujo la expresión de EGR1 usando TPA en células que expresan de forma estable MAML1 y HEK-293 células de control. Después de 1 h de incubación con ciclohexamida, significativamente más proteína EGR1 estaba presente en la línea celular MAML1 expresan en comparación con las células control (Figura 3D). Por lo tanto, sugerimos que MAML1 puede estar implicada en la regulación de la estabilidad de EGR1, posiblemente por el aumento de la acetilación de EGR1. La acetilación de EGR1 por p300 Se ha informado que para aumentar los niveles de proteínas de EGR1, para estimular la expresión de factores de crecimiento celular y la supervivencia genes tales como FGF2, PDGFB, TGFB1 y IGF2, y por lo tanto juega un papel crucial en el cáncer de próstata [15], [18 ]. Como EGR1 se expresa en altos niveles en el cáncer de próstata y también ciertos tipos de cáncer renal [21], [22], queda por investigar si la acetilación P300 dependiente de EGR1 afecta a la expresión de EGR1 genes diana o juega un papel en el desarrollo de cáncer renal.
la N-terminal de MAML1 coopera con EGR1 durante la activación transcripcional
la proteína MAML1 contiene varios dominios, que son importantes para las interacciones de proteínas y la función de MAML1 (ver esquema en la figura 4A). Los aminoácidos 1 a 74 de MAML1 interactúan con el ICD Notch y MEF2C, mientras que los aminoácidos 75-305 son importantes para la interacción con p300. El dominio N-terminal de MAML1 también interactúa con p53 y GSK3ß [24]. Para investigar qué dominio MAML1 se requiere para la activación de los promotores regulados por EGR1, plásmidos que expresan EGR1 y diversos dominios MAML1 fueron co-transfectadas con el reportero 4xEBS-luc, que contiene cuatro sitios de unión EGR1, en células HEK-293. Como se muestra en la Figura 4B, MAML1 (1-1016) y (75-1016) fuertemente mejorado la actividad del gen indicador de luciferasa en presencia de EGR1, mientras MAML1 (1-625) no tuvo efecto detectable sobre la activación de EGR1-promotor. MAML1 (1-1016) y (75-1016) se expresaron en niveles similares en el ensayo de cultivo de células, mientras que se detectaron niveles más altos de MAML1 (1-625) (Figura 4C).
(A) Esquema ilustración de los dominios MAML1. (B) las células HEK-293 se co-transfectaron con 4xEBS-luc y vectores que expresan EGR1, MAML1 y truncamientos de MAML1, como se indica en la figura. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. (C) las transferencias Western que muestran los niveles de expresión de MAML1 de longitud completa y proteínas mutantes en las células HEK-293. (D) PageBlue Protein-manchado SDS-gel que muestra la migración de las proteínas MAML1 marcada con GST purificadas utilizadas para el ensayo de interacción proteína-proteína. (E) derivados MAML1 marcada con GST y GST acoplados a perlas de glutatión-Sepharose se incubaron con HEK 293-extractos de células enteras, y MAML1-interactuar EGR1 se detectó por inmunotransferencia. La entrada representa 2% de la totalidad del extracto celular utilizado en la reacción de unión. células (F) HEK-293 se co-transfectaron con 4xEBS-luc y vectores que expresan EGR1, MAML1 (1-1016) y (1-127). Los datos se presentan como media ± desviación estándar.
Con el fin de examinar qué región del MAML1 interactúa con EGR1, derivados de longitud completa marcada con GST MAML1 proteínas y MAML1 (Figura 4D) se incubaron con células enteras extractos de células HEK293 transfectadas con EGR1. EGR1 interactuaba fuertemente con la proteína de longitud completa GST-MAML1 y MAML1 (1-300); pero sólo mostró una interacción semanas con MAML1 (1-625) y (309-625) (Figura 4E). Dado que hemos detectado una fuerte interacción EGR1-especialmente con MAML1 (1-300), se investigó el papel de la N-terminal MAML1 en la transcripción EGR1 por co-transfección de células HEK-293 con el reportero 4xEBS-Luc y los plásmidos que expresan EGR1, MAML1 de cuerpo entero y MAML1 (1-127). Como se muestra en la Figura 4F, MAML1 (1-127) reprimida la activación sinérgica MAML1-EGR1 de la EGR1-promotor. Llegamos a la conclusión de que un dominio dentro de los aminoácidos 75-127 de MAML1 puede ser importante para el efecto sinérgico de MAML1 y EGR1 en la transcripción de genes. El MAML1 N-terminal se informó de interactuar con Notch, MEF2C, p53 y GSK3beta, y jugar un papel importante en la actividad transcripcional de estos factores [1], [2], [5], [6], [13] . También se requiere el dominio N-terminal de MAML1 para la interacción de MAML1 con p300, lo que conduce a un aumento de autoacetylation p300 y la actividad HAT [12]. Además, MAML1 contiene dos sitios de Sumoylation N-terminal (K217 y K299) que reprimen la actividad MAML1 [14]. Por lo tanto, las interacciones de MAML1 deben investigarse más a fondo, a fin de determinar si la interacción de EGR1 con MAML1 se produce en la competencia, o tal vez en sinergia, con otros factores de transcripción tales como Notch y p53.
MAML1 correlaciona positivamente con EGR1 y p300 en el cáncer de riñón
sobre la base de la fuerte evidencia mecanicista presentado por la corregulación entre MAML1, EGR1 y p300, se evaluó una base de datos genómica para dicha relación.