Extracto
MDA-7 /IL-24 estuvo involucrado en la apoptosis específica del cáncer a través de la supresión de expresión Bcl-2, que es una proteína reguladora de la apoptosis clave de la vía de la muerte mitocondrial. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de esta regulación no están claros. Presentamos aquí que la replicación del adenovirus-tumoral selectiva ZD55-IL-24 conduce a Bcl-2 y S-denitrosylation ubiquitinación concomitante, que participan en la degradación del proteasoma 26S. IL-24 siRNA bloquea completamente Bcl-2 de ubiquitinación a través de la reversión de Bcl-2 S-denitrosylation y lo protege de la degradación proteasomal que confirmó el importante papel de la MDA-7 /IL-24 en la regulación de la modificación postraduccional de Bcl-2 en células de cáncer . El óxido nítrico (NO) es un regulador clave de la proteína S-nitrosilación y denitrosylation. El donador de NO, nitroprusiato de sodio (SNP), regula a la baja Bcl-2 S-denitrosylation, atenúa Bcl-2 ubiquitinación y posteriormente contrarresta MDA-7 /IL-24 inducida por apoptosis de las células del cáncer, mientras que no inhibidor de 2- (4-carboxifenil) 4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxi-3-óxido (PTIO) muestra el efecto contrario. Al mismo tiempo, estos NO moduladores dejar de afectar la fosforilación de Bcl-2, lo que sugiere que el NO regula la estabilidad de Bcl-2 de una manera independiente de la fosforilación. Además, Bcl-2 la reducción de S-nitrosilación inducida por ZD55-IL-24 se atribuyó a tanto iNOS disminución y aumento TrxR1. iNOS-siRNA facilita Bcl-2 y S-denitrosylation ubiquitina-degradación, mientras que el inhibidor de la auranofina TrxR1 impide Bcl-2 de denitrosylation y ubiquitinación, por tanto, restringe la activación de la vía de señalización de la caspasa y la posterior apoptosis de las células del cáncer. Tomados en conjunto, nuestros estudios revelan que la MDA-7 /IL-24 induce la Bcl-2 S-denitrosylation través de la regulación de la iNOS y TrxR1. Por otra parte, denitrosylation de Bcl-2 resultados en su ubiquitinación y la posterior activación de la familia caspasa de proteasas, como consecuencia, la susceptibilidad apoptosis. Estos resultados proporcionan una nueva visión de MDA-7 /IL-24 inducida por la inhibición del crecimiento y la apoptosis carcinoma
Visto:. Tian H, Wang J, Zhang B, Di J, Chen F, Li H, et al. (2012) MDA-7 /IL-24 Induce Bcl-2 y Denitrosylation ubiquitina de degradación que tienen en Cancer Cell apoptosis. PLoS ONE 7 (5): e37200. doi: 10.1371 /journal.pone.0037200
Editor: Demetrios Vavvas, Massachusetts Ojos & amp; Ear Infirmary-Escuela Médica de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de diciembre de 2011; Aceptado: April 16, 2012; Publicado: 21 de mayo 2012
Derechos de Autor © 2012 Tian et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81071854) y el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Jiangsu (BK2010177, BK2010179). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
interleucina 24 (IL-24), también llamado diferenciación melanoma asociado gen-7 (MDA-7), es un miembro único de la familia de genes de IL-10, que muestra una inducción selectiva de la apoptosis específica cáncer sin efectos nocivos sobre las células normales [1] - [3]. MDA-7 /IL-24 induce la supresión del crecimiento y la apoptosis en un amplio espectro de células de cáncer humano, incluyendo melanoma, glioma maligno, y carcinomas de mama [4] - [8]. La participación de MDA-7 apoptosis /IL-24 inducida en los tejidos tumorales se asoció con retículo endoplasmático estrés (ER) y la disfunción mitocondrial y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) [7], [9], [10]. Por otra parte, MDA-7 /IL-24 induce una potente actividad "espectador antitumoral", la capacidad de bloquear la angiogénesis tumoral, la sinergia con la radiación, quimioterapia, terapias de anticuerpos monoclonales y la actividad moduladora inmune [11], [12], que lo convierten en un ideales herramienta para la terapia génica del cáncer.
Aunque las vías por las que MDA-7 /IL-24 potencia la apoptosis en las células tumorales no se aclaran completamente, la evidencia de varios estudios sugiere que MDA-7 /IL-24 media en muchas proteínas importante para la aparición de la inhibición del crecimiento y la implicación de la vía de la muerte celular apoptótica mitocondrial [7]. De células B de linfoma de genes 2 (Bcl-2), uno de los miembros Bcl-2 en la familia anti-apoptóticos, se localiza en la membrana mitocondrial externa. Algunos mecanismos antiapoptóticos de Bcl-2 incluyen la regulación de la homeostasis del calcio y la neutralización de la proteína proapoptótica Bax mediante la formación de heterodímeros. Además, Bcl-2 promueve el bloqueo de la liberación del citocromo c y la asociación con el factor de apoptosis mitocondrial APAF1, finalmente impedido la activación de la caspasa familia de la proteasa y conservado la integridad mitocondrial [13], [14]. MDA-7 /IL-24 reprimida Bcl-2 expresión de la proteína, que de este modo aumenta la relación de pro- específica y las proteínas anti-apoptóticas inclinar el equilibrio de la supervivencia a la muerte en células de carcinoma. Por el contrario, la sobreexpresión de Bcl-2 células de cáncer de próstata protegido del MDA-7 apoptosis /IL-24 mediada, lo que sugiere Bcl-2 juega un papel importante en la apoptosis de células de cáncer en respuesta a MDA-7 /IL-24 [8]. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual MDA-7 /IL-24 regulada Bcl-2 para facilitar la disfunción mitocondrial no se ha identificado. En el presente estudio, hemos utilizado replicante adenovirus-tumor selectiva que expresan IL-24 (ZD55-IL-24), que elimina el gen esencial viral E1B 55 kDa y ejerce un fuerte efecto citopático y la apoptosis significativa en las células tumorales sin células normales [15] para explorar aún más el mecanismo de MDA-7 /IL-24 de la inducción de Bcl-2 baja regulación y la posterior apoptosis de las células de carcinoma.
(a) Tiempo de análisis del curso de expresión de la proteína IL-24 en Hela, A375 y 7860 las células tratadas con ZD55-IL-24 (20 MOI). (B) Análisis Evolución temporal de la expresión de la proteína E1A en Hela, A375 y 7860 células tratadas con ZD55-IL-24 (20 MOI). Curso de Análisis (C) Tiempo de Bcl-2 y la expresión de proteínas en Hela, A375 y 7860 células tratadas con ZD55-IL-24 (20 MOI). β-actina se utilizó como control de carga. (D) ZD55-EGFP (5 MOI) que lleva gen informe EGFP se utilizó para detectar eficacia de infección del adenovirus replicativo en diferentes puntos de tiempo (aumento x 200). (E) Hela, A375 y 7860 células viabilidad tratados con ZD55-IL-24 (20 MOI) en los diferentes puntos de tiempo se determinaron mediante el ensayo de MTT. Los datos son medias ± desviación estándar (S. D.) de tres experimentos independientes (n = 3); *
p
. & Lt; 0,05 frente al grupo de control
(A) Efectos de los diferentes títulos de ZD55-IL-24 (0,1 MOI, 1 MOI, 5 MOI, 10 MOI , 20 MOI) de Bcl-2 y la expresión inducida por Western Blot 48 h después de la infección de ZD22-IL24. β-actina se utilizó como control de carga. (B) ZD55-EGFP en los diferentes títulos se utilizó para detectar eficiencia de infección de adenovirus replicativo (aumento x 200). la viabilidad celular (C) Hela tratados con los diferentes títulos de ZD55-IL-24 se determinó mediante el ensayo de MTT. Los datos son medias ± desviación estándar (S. D.) de tres experimentos independientes (n = 3); *
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& lt; 0,05 frente al grupo de control
(A) Hela, A375 y 7860 células en respuesta a ZD55-IL-24 (20 MOI) se prepararon para la inmunoprecipitación utilizando. -Bcl-2 anticuerpo anti. Los complejos inmunes resultantes se analizaron para anticuerpos anti-S-nitrosocisteína por Western Blot y se pusieron de Bcl-2 nivel S-nitrosilación en los diferentes puntos de tiempo de 12 h, 24 h, 36 hy 48 h, respectivamente. (B) Evolución temporal de Bcl-2 en células HeLa ubiquitinación se detectó por inmunoprecipitación usando anti-Bcl-2 de anticuerpos y luego seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-ubiquitina. (C) Efecto de la IL-24-siRNA (100 nM) a IL-24, Bcl-2 expresión, Bcl-2 S-nitrosilación y ubiquitinación en células HeLa se detectó mediante transferencia Western y co-inmunoprecipitación. β-actina se utilizó como control de carga. Las bandas correspondientes se escanearon y se determinó la densidad óptica (D.O.) como el factor de cambio frente al grupo control. Los datos son medias ± desviación estándar (S. D.) de tres experimentos independientes (n = 3); *
p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo de control;
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p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo siRNA revueltos
(A) Tiempo de análisis del curso de la caspasa-9, caspasa-3 y PARP en células HeLa tratadas con ZD55. -IL-24 (20 MOI). Las bandas correspondientes se escanearon y se determinó la densidad óptica (D.O.) como el factor de cambio frente al grupo control. (B) la apoptosis temprana y tardía de la apoptosis en células HeLa fueron detectados por tinción de las células con anexina V-FITC (color verde) y yoduro de propidio (color rojo) en los diferentes puntos de tiempo. células (C) Hela tratados con ZD55-IL-24 para el tiempo diferente se tiñeron con Anexina V-FITC /yoduro de propidio (PI) y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. Los datos se presentan como el porcentaje de células anexina V positivas a partir de tres experimentos independientes. *
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. & Lt; 0,05 frente al grupo de control
(A) Hela, células A375 y 7860 fueron pretratados con ZD55-IL-24 (20 MOI) durante 24 horas y luego tratado con NO SNP donante (2 mM), inhibidor de la NO PTIO (300 M) y SNP co-administración de agente reductor DTT (10 mM) durante 6 h, respectivamente. Bcl-2 S-nitrosilación se detectó por inmunoprecipitación usando anti-Bcl-2 de anticuerpos y luego seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-S-nitrosocisteína. (B) Efecto de NO moduladores en Bcl-2 ubiquitinación en células HeLa fueron detectados por inmunoprecipitación usando anti-Bcl-2 de anticuerpos y luego seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-ubiquitina. (C) Efecto del NO moduladores de la expresión de Bcl-2 en Hela, A375 y células 7860 se detectó por Western Blot utilizando anticuerpos anti-Bcl-2. (D) Hela, A375 y 7860 células fueron pretratadas con ZD55-IL24 durante 24 h y después se trataron con MG132 inhibidor proteasomal (10 mM) durante 6 h. Bcl-2 expresión se analizó por transferencia Western usando el anticuerpo anti-Bcl-2. (E) Bcl-2 fosforilación en células HeLa se detectó mediante transferencia de Western con anti-p-Bcl-2 de anticuerpos (Ser87). β-actina se utilizó como control de carga. Las bandas correspondientes se escanearon y las intensidades se determinaron por medidas de densidad óptica (de DO). Los datos son medias ± desviación estándar (S. D.) a partir de tres experimentos independientes (n = 3).
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p Hotel & lt; 0,05 frente a ZD55-EGFP; *
p Hotel & lt; 0,05 ZD55-IL-24 en comparación con el grupo;
@
p
. & Lt; 0,05 frente al grupo DMSO
células (A) Hela fueron pretratados con ZD55-IL24 (20 MOI) durante 24 horas y después se añaden con el NO SNP donante (2 mM), inhibidor de la NO PTIO (300 mM), SNP co-administración de agente reductor DTT (10 mM) y MG132 inhibidor proteasomal (10 mM) durante 6 h, respectivamente. Procaspasa-9, se escindió de la caspasa-9, procaspasa-3, caspasa-3 escinde se detectaron por transferencia de Western. (B) Efecto de NO moduladores SNP, PTIO, SNP + TDT y MG132 inhibidor del proteasoma sobre la apoptosis temprana y apoptosis tardía en células HeLa tratadas con ZD55-IL-24 se detectó por tinción con Anexina V-FITC (color verde) y yoduro de propidio (color rojo), respectivamente. las células (C) HeLa se tiñeron con Anexina V-FITC y yoduro de propidio y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. (D) los efectos moduladores de NO y MG132 en Hela viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. Las bandas correspondientes se escanearon y se determinó la densidad óptica (D.O.) como el factor de cambio frente al grupo control. Los datos son medias ± desviación estándar (S. D.) a partir de tres experimentos independientes (n = 3).
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p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo ZD55-EGFP; *
p Hotel & lt; 0,05 ZD55-IL-24 en comparación con el grupo;
@
p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo DMSO
(A) Análisis Evolución temporal de la expresión de la iNOS en Hela, A375 y 7860 células tratadas con ZD55-IL-24. (20 MOI). (B) Hela, A375 y 7860 células fueron transfectadas con iNOS-siRNA (100 nM) durante 12 h, después se trató con ZD55-IL-24 durante 12 h. Efecto de la iNOS-siRNA sobre la expresión de iNOS se analizó por transferencia Western. (C) Efecto de la iNOS-siRNA en Bcl-2 expresión de la proteína se analizó por transferencia Western. (D) Efecto de la iNOS-siRNA en Bcl-2 S-nitrosilación se detectó por inmunoprecipitación usando anti-Bcl-2 de anticuerpos y luego seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-S-nitrosocisteína. (E) Efecto de la iNOS-siRNA en ubiquitina-Bcl-2 se detectó por inmunoprecipitación usando anti-Bcl-2 de anticuerpos y luego seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-ubiquitina. (F) Efecto de la iNOS-siRNA en la caspasa-9, caspasa-3 y PARP en células HeLa se detectó mediante transferencia Western. Las bandas correspondientes se escanearon y se determinó la densidad óptica (D.O.) como el factor de cambio frente al grupo control. Los datos son medias ± desviación estándar (S. D.) a partir de tres experimentos independientes (n = 3). *
p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo de control;
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. & Lt; 0,05 frente al grupo siRNA revueltos
(A) Análisis Evolución temporal de la expresión TrxR1 en Hela, A375 y 7860 células tratadas con IL-ZD55 24 (20 MOI). (B) Hela, A375 y 7860 células fueron tratadas con ZD55-IL-24 durante 24 h y después se añadió con TrxR1 inhibidor auranofina (5 mM) durante 6 h. Efecto de TrxR1 auranofina inhibidor sobre la expresión de la proteína TrxR1 se detectó mediante transferencia Western. (C) Efecto del inhibidor TrxR1 auranofina de Bcl-2 y la expresión de proteínas en Hela, A375 y 7860 células se detectó mediante el ensayo de western blot. (D) Efecto de la TrxR1 inhibidor auranofina en Bcl-2 S-nitrosilación se detectó por inmunoprecipitación usando anti-Bcl-2 de anticuerpos y luego seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-S-nitrosocisteína. (E) Efecto de TrxR1 auranofina inhibidor de Bcl-2 en células HeLa ubiquitinación se detectó por inmunoprecipitación usando anti-Bcl-2 de anticuerpos y luego seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-ubiquitina. (F) Efecto del inhibidor de TrxR1 auranofina en la caspasa-9, 3 y PARP se detectó mediante transferencia Western. β-actina se utilizó como control de carga. Las bandas correspondientes se escanearon y se determinó la densidad óptica (D.O.) como el factor de cambio frente al grupo control. Los datos son medias ± desviación estándar (S. D.) a partir de tres experimentos independientes (n = 3). *
p Hotel & lt; 0,05 frente a ZD55-EGFP;
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p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo DMSO
(I) IL-24 inhibe la expresión de iNOS conduce a la reducción de NO consigue una atenuación de Bcl-2 S-. nitrosilación. (II) Trx denitrosylates S-nitrosilados Bcl-2 a través de su resto de ditiol, formando de este modo una reducción de Bcl-2 y oxidan Trx; oxidada Trx se reduce (y por lo tanto reactiva) por el Trx reductasa seleno-flavoproteínas (TrxR) y NADPH, lo que sugiere que TrxR través reductor oxidado Trx puede facilitar la Bcl-2 denitrosylation. (III) En condiciones basales, Bcl-2 S-nitrosilación estabiliza la estructura de proteínas y es resistente a la degradación ubiquitina-proteasoma. La formación de heterodímeros con proteínas proapoptótico tales como Bax, la inhibición de la liberación del citocromo c y la activación de la familia de la proteasa de la caspasa, y la regulación del potencial transmembrana mitocondrial son algunos de los mecanismos por los que Bcl-2 ejerce su efecto anti-apoptótica. (IV) En respuesta a IL-24, Bcl-2 S-denitrosylation tanto a través de iNOS disminución (a) y aumento TrxR1 (b) facilita la Bcl-2 ubiquitinación, que finalmente se degrada por el proteasoma 26S. Bax desencadena la liberación de citocromo c y la activación de la familia de la proteasa de la caspasa, que mediada la proteolisis intracelular que es característico de la apoptosis celular.
Aunque la expresión de Bcl-2 está regulada por varios mecanismos, tales como la transcripción , modificación postraduccional, dimerización y la degradación [16], [17], el aumento de la evidencia demuestra que la modificación postraduccional juega un papel crítico en un potencial de facturación Bcl-2 en condiciones de estrés [18], [19], [20]. Algunos estudios indican proteína S-nitrosilación es un proceso de regulación en las vías de transducción de señal que ajusta la función de Bcl-2 por la unión covalente de un grupo de óxido nítrico (NO) a una cadena lateral de tiol de cisteína. Se ha demostrado que los dos residuos de cisteína de Bcl-2, Cys
158 y Cys
229 son responsables de S-nitrosilación de Bcl-2, y la mutación de estos dos residuos de inhibir completamente Bcl-2 S-nitrosilación [dieciséis]. S-nitrosilación ha sido regulada por la NO sintasa (NOS), incluyendo NOSs neuronal (nNOS), NOS endotelial (eNOS) y la NOS inducible (iNOS) [21], [22]. Entre tres NO sintasas, iNOS, un Ca
2 + -independiente de la enzima, se define como el 'alto rendimiento' NOS, la generación de grandes cantidades de NO. Algunos trabajos anteriores muestran también fue encontrado iNOS que aumentarse en etapas avanzadas de melanoma y la expresión de iNOS expresión regulada negativamente MDA-7 /IL-24 en líneas celulares de melanoma maligno [23], [24], [25], lo que sugiere que la iNOS podría contribuir a mejorar la progresión tumoral. Sin embargo, la función exacta de iNOS en la tumorigénesis está claro. inducida por ZD55-IL-24 si la disminución de la iNOS influiría más Bcl-2 nivel S-nitrosilación es el primer objetivo de nuestro estudio. Dado que la proteína nivel S-nitrosilación no sólo depende de la S-nitrosilación NO mediada a través de la NOS, sino también denitrosylating enzima tal como los sistemas de tiorredoxina (Trx /TrxR) [26], también investigamos si la reducción de S-nitrosilación Bcl-2 en respuesta a ZD55-IL-24 se determina por tanto los sistemas /TrxR Trx iNOS y.
Algunos informes actuales muestran que la generación inducida por cisplatino de especies reactivas de oxígeno hace que la Bcl-2 S-nitrosilación que inhibe la degradación del proteasoma 26S, lo que indica que la S-nitrosilación puede ejercer la función biológica mediante el cambio de la estabilidad de la proteína. Del mismo modo, mediada por NO-S-nitrosilación de Bcl-2 asociada a su degradación ubiquitina podría ser importante en la resistencia a la apoptosis y el desarrollo de cáncer de pulmón inducida por Cr (VI) y otros carcinógenos [16], [27]. En consecuencia, existe un interés creciente hacia la comprensión de los mecanismos celulares si Bcl-2 S-nitrosilación alteración en adición de ZD55-IL-24 está implicada en su ubiquitinación y degradación proteasomal.
Dado que los mecanismos por los que MDA-7 /IL-24 suprime la expresión de Bcl-2 y facilita la apoptosis de las células cancerosas no se han aclarado. Nuestro presente estudio determinó el importante papel de Bcl-2 denitrosylation en su degradación ubiquitina proteasoma, que finalmente se media la activación de la vía de señal de caspasas y apoptosis de las células del cáncer en respuesta a ZD55-IL-24. Por otra parte, Bcl-2 S-nitrosilación disminución en respuesta a ZD55-IL-24 incluye tanto mediada por iNOS S-nitrosilación y Trx /TrxR1 involucrado con denitrosylation, que posteriormente se facilita la degradación mediada por ubiquitina proteasoma. Tal relación estrecha entre Bcl-2 y ubiquitinación denitrosylation arroja nueva luz sobre inducida por IL-24 la degradación de Bcl-2 y la apoptosis tumoral específica.
Materiales y Métodos
Células y Reactivos
el Henrietta Lacks línea celular humana (HeLa), la línea humana de células malignas del cáncer del melanoma (A375) y la línea celular de carcinoma renal humano (7860) se obtuvieron de Shanghai Recolección de células (Shanghai, china). las células HeLa y A375 se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) (GIBCO BRL, Grand Island, NY) que contiene 5% de suero bovino fetal (FBS, GIBCO-BRL), 2 mM L-glutamina, y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina y un entorno de CO2 al 5% a 37 ° C. Las células renales cáncer 7860 se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 5% de FBS y antibióticos. Nitroprusiato de sodio (SNP), 2- (4-carboxifenil) 4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxi-3-óxido (PTIO), ditiotreitol (DTT), dimetil sulfóxido (DMSO) y Z-Leu- Leu-Leu-al (MG132) se adquirieron de Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO), anticuerpos para Bcl-2, Bcl-fosfo-2 (Ser87), NOS2 (iNOS), proteína a-agarosa, y IL -24-siRNA, iNOS-siRNA y revueltos control de siRNA fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos para ubiquitina y S-nitrosocisteína fueron de Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO). Los anticuerpos para β-actina, la procaspasa-3, caspasa-3 troceados, la procaspasa-9, se escindió de la caspasa-9 anticuerpos, anti-polimerasa poli ADP-ribosa (PARP) y PARP escindida se adquirieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)
construcción de virus y la producción
pZD55, el borrado de E1B-55-kDa construcción del plásmido de adenovirus oncolítico.; pCA13, el plásmido lanzadera de adenovirus con E1 suprimido; y ZD55-aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) con el gen reportero EGFP fueron amablemente proporcionados por el profesor Liu (Liu Xin-Yuan, Instituto de Bioquímica y Biología Celular, Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas de la Academia China de Ciencias, Shanghai, China). IL-24 se clonó primero en pCA13 para formar pCA13-IL-24. A continuación, IL-24 escindido del pCA13 se subclonó en pZD55 para construir pZD55-IL-24. adenovirus oncolítico, ZD55-IL-24 fue generada en células HEK293 (Recolección de células Shanghai, Shanghai, China) por recombinación homóloga entre pZD55-IL-24 y el plásmido de empaquetamiento de adenovirus pBHGE3 (Microbix Biosystems), respectivamente. purificación a gran escala de todas las partículas de adenovirus se llevó a cabo mediante ultracentrifugación con cloruro de cesio de acuerdo con técnicas estándar. Los títulos se determinaron utilizando un ensayo de placas en células HEK293.
ARN interferente pequeño ensayo
Para los experimentos con IL-24 siRNAs específicos, las células (3 × 10
5 por pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos. A las 24 h después de la incubación, se lavaron las células Hela, que se repone con medio fresco y se trata con ZD55-IL-24 (20 MOI) durante 12 h, posteriormente se lavaron las células y se colocaron en medio de cultivo fresco y se añaden con IL-24 siRNA ( 100 nM) mediante el uso de un reactivo de transfección siRNA. Después de 24 h de siRNA transfección, lisados de células se prepararon y se sometieron al análisis de transferencia Western como se describe a continuación.
Para los experimentos que implican iNOS-siRNAs, se transfectaron las células con 100 nM siRNA iNOS específica durante 12 h, las células se lavaron posteriormente y se coloca en medio de cultivo fresco y después se trató con ZD-55-IL-24 (20 MOI) de 12 h. Después de 24 h de siRNA transfección, lisados de células se prepararon y se sometieron al análisis de transferencia Western como se describe a continuación.
Western Blotting
Después de tratamientos específicos, las células se incubaron en tampón de lisis que contiene 20 mmol /L Tris-HCl (pH 7,5), 1% de Triton X-100, 150 mmol /L de NaCl, 10% de glicerol, 1 mmol /L Na
3Vo
4, 50 mmol /L NaF, 100 mmol /L fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y una mezcla de inhibidor de la proteasa comercial (Roche Molecular Biochemicals) durante 20 minutos en hielo. Después de los restos insolubles se sedimentaron por centrifugación a 14.000 g durante 15 minutos a 4 ° C, se recogieron los sobrenadantes y se determinó el contenido de proteína utilizando el método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las proteínas (80 g) se resolvieron en condiciones de desnaturalización por SDS-PAGE (10%) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear durante 2 h en solución salina tamponada con fosfato con 0,1% Tween 20 (PBST) y 3% de albúmina de suero bovino (BSA), las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario apropiado en PBST que contiene 3% de BSA. a continuación, las membranas se lavaron y se incubaron con fosfatasa alcalina de cabra conjugado con IgG anti-conejo o anti-IgG de ratón (Sigma, 01:10 000) en PBST durante 2 h y se desarrolló usando el sustrato /BCIP de color NBT (Promega, Madison, EE.UU.).
inmunoprecipitación
Para la inmunoprecipitación, las fracciones citosólicas (que contienen cada uno 400 g de proteínas) se diluyeron cuatro veces con tampón HEPES que contiene HEPES 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 10% de glicerol, 1% Triton X-100, y 1 mM de cada uno de EGTA, EDTA, PMSF y Na
3Vo
4. Las muestras fueron luego pre-incubaron durante 1 h con 20 l de proteína A agarosa y se centrifugaron para eliminar cualquier proteína no específicamente adheridas de la proteína A agarosa. El sobrenadante se incubó con anticuerpos específicos 2 g durante la noche a 4 ° C. Después de la adición de la proteína A de agarosa, la mezcla se incubó a 4 ° C durante 2 h adicionales. Las muestras se lavaron triple con tampón HEPES y se eluyeron por tampón de carga de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE) luego se hierve a 100 ° C durante 5 minutos. Los complejos inmunes se separaron por 10% SDS-PAGE y se analizaron por transferencia de Western como se describe anteriormente.
Medición de la apoptosis por análisis de Anexina V
Se utilizó un ensayo de unión Anexina V-acuerdo con el fabricante de instrucciones. Brevemente, las células (3 × 10
5 por pocillo) en placas de 6 pocillos se trataron con ZD55-IL24 (20 MOI) para el diverso tiempo de 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, y 72 h. Se recogieron las células y se realizó el ensayo de doble tinción de Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante ((Nanjing Keygen Biotech, China). Células recogidas se lavaron brevemente con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS ) dos veces y se resuspendieron en 200 l 1 × tampón de unión que contiene 5 l de Anexina V-FITC durante 15 minutos y luego en 300 l 1 x tampón que contiene 5 l yoduro de propidio (PI) durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad de unión. Después de la incubación , se analizaron las células usando un FACStar citómetro de flujo.
viabilidad de las células de ensayo
se incubaron las células de carcinoma (1,0 x 10
4 por pocillo) por triplicado en una placa de 96 pocillos y se trató con ZD55-IL-24 y NO moduladores. Cell tasa de supervivencia se evaluó mediante un estándar de 3- (4, 5-dimethylthazol-2-il) bromuro (MTT) ensayo de -2,5-difeniltetrazolio (Sigma, St. Louis , MO) en presencia o ausencia de las muestras de ensayo indicados en un volumen final de 0,2 ml para varios períodos de tiempo a 37 ° C. después de esto, 20 solución de MTT l (5 mg /a continuación se añadió ml en PBS) a cada pocillo . Después de 4 h de incubación a 37 ° C, se añadió DMSO 150 l. Finalmente las placas se agitaron y la densidad óptica a 570 nm se midió en un lector espectrómetro ELX-800 (Bio-Tek Instruments Inc., EE.UU.). Cuatro pocillos replicados se ensayaron por ensayo y cada experimento se repitió tres veces. la viabilidad celular Se calculó el porcentaje como la relación de las muestras experimentales para las muestras de control × 100.
El análisis estadístico
Los valores se expresan como media ± SD. El análisis estadístico de los resultados se realizó mediante la prueba t de Student o el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido por el nuevo método de rangos múltiples de Duncan o prueba de Newman-Keuls.
P-valores
. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Efecto de ZD55-IL-24 sobre la Bcl-2 y la expresión celular de cáncer de viabilidad
expresiones de proteína de IL-24 y E1A acompañados con adenovirus ZD55-IL-24 la replicación y la traducción en Hela, A375 y 7860 células se detectaron por transferencia de Western en los diferentes puntos de tiempo. Nuestros datos muestran un claro aumento de IL-24 a partir de 24 h a 72 h en comparación con los controles, como se muestra en la Fig. 1A. Al mismo tiempo, la proteína E1A de pie para la capacidad de replicación de ZD55-IL-24 mostró la mejora evidente a partir de 12 h a 72 h en la Fig. 1B, que es similar a la evolución en el tiempo de aumento de proteína de fluorescencia verde expresión (EGFP) tratados con ZD55-EGFP en la Fig. 1D. Además, Bcl-2 expresión tiene la disminución inversa de 24 h a 72 h (Fig. 1C). Por otra parte, la Bcl-2 en respuesta a la disminución ZD55-IL-24 se muestra en una forma dependiente de la dosis. Los títulos eficaces de ZD55-IL-24 para inhibir la expresión de Bcl-2 son 10 y 20 MOI, como se muestra en la Fig. 2A. Para investigar más si ZD55-IL24 afecta a la supervivencia tres células de carcinoma, la viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT (Fig. 1E). Nuestros resultados mostraron que ZD55-IL-24 se redujo eficazmente la supervivencia celular y esta inhibición también se mostró de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1E y 2C). Tomados en conjunto, estos resultados indican la ZD55-IL24 podría mediar en un alto nivel y estable de IL-24 expresión a partir de las 24 h hasta las 72 h, y reducir el nivel de Bcl-2 de proteínas en tiempo y forma dependiente de la dosis.
efecto de ZD55-IL-24 sobre la Bcl-2 y S-nitrosilación ubiquitinación
para investigar si ZD55-IL-24 podría contribuir a la alteración de Bcl-2 y S-nitrosilación ubiquitinación, hemos detectado Bcl-2 S -nitrosylation y el nivel de ubiquitinación en Hela, A375 y 7860 células. Los resultados mostraron que ZD55-IL-24 en células HeLa disminuyó la Bcl-2 S-nitrosilación de 79% a las 24 h a 38% a las 48 h en comparación con el grupo control (Fig. 3A). En contraste, Bcl-2 ubiquitinación aumentó de 1,4 veces a las 24 h de 2,3 veces a las 48 h, como se muestra en la Fig. 3B. Los resultados de A375 y 7860 células fueron consistentes con la tendencia anterior. Para confirmar aún más el papel potencial de la IL-24 en la regulación de Bcl-2 y S-nitrosilación ubiquitinación, específica de IL-24 siRNA se utilizó para derribar IL-24 expresión. Nuestros datos indicaron IL-24-siRNA obviamente restaurado Bcl-2 S-nitrosilación y por lo tanto suprimen Bcl-2 ubiquitinación comparación con el control revueltos siRNA (Fig. 3C). En consecuencia, ZD55-IL-24 induce la disminución de Bcl-2 S-nitrosilación y el aumento de Bcl-2 ubiquitinación.
Efecto de ZD55-IL-24 en la activación de caspasas y apoptosis de las células cancerosas
Para más determinar si la Bcl-2 disminución aberrante en respuesta a ZD55-IL-24 daría lugar a la activación de la vía de señal de la caspasa en las células HeLa, la caspasa-9, se detectaron caspasa-3 y PARP en los diferentes puntos de tiempo de 12 h, 24 h , 36 h y 48 h respectivamente, como se muestra en la Fig. 4A. Los resultados demostraron que la procaspasa-9 disminuye gradualmente desde 76% a las 24 h de 36% a 48 h. En contraste, la caspasa-9 escindido aumentó correspondientemente desde 1,5 a las 24 h de 2,5 veces a las 48 h en comparación con el grupo control. Caspasa-3 y PARP cabo la alteración similar como la caspasa-9. Nuestros resultados muestran que ZD55-IL-24 induce la escisión de la caspasa-9, caspasa-3 y PARP para activar la ruta de señalización de caspasa. Además, Hela células apoptosis se detectó por Anexina V /PI y después se analizó mediante citometría de flujo (Fig. 4B y C). Los resultados indicaron que ZD55-IL-24 mejora considerablemente la apoptosis en células Hela de 2.3- a las 24 h de 7,4 veces a las 72 h en comparación con el grupo control. Tomados en conjunto, ZD55-IL-24 inició la apoptosis vía de activación de la caspasa y la señal de las células cancerosas.
Efecto de Bcl-2 alteración S-nitrosilación en la regulación de su ubiquitinación en respuesta a ZD55-IL-24
Para investigar si ZD55-IL-24 podría regular Bcl-2 S-nitrosilación a través de NO, que posteriormente afecta a su ubiquitinación, se trataron Hela, A375 y 7860 células con NO SNP donante, inhibidor de la NO OITP y SNP coadministración del agente reductor de DTT después de la administración de ZD55-IL24, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 5A, NO exógeno donante SNP aumentó efectivamente la Bcl-2 S-nitrosilación mientras que este efecto de rescate fue negada por la coadministración con TDT. Al mismo tiempo, inhibidor de la NO PTIO reducido significativamente Bcl-2 S-nitrosilación. Por el contrario, NO SNP donante inhibe la ubiquitinación de Bcl-2, pero TDT co-tratamiento contrarresta los efectos del SNP. Por otra parte, inhibidor de la NO PTIO facilitó la ubiquitinación de Bcl-2 en la Fig. 5B. Higo. 5C muestra el tratamiento ZD55-IL-24 durante 24 h causó una disminución significativa de Bcl-2 expresión, que se redujo aún más con la adición de NO PTIO inhibidor. En contraste, el tratamiento con NO SNP donante resistió significativamente-IL-24 inducida por ZD55 Bcl-2 baja regulación. Higo.