Extracto
El
MDM2
proto-oncogén juega un papel clave en los procesos celulares centrales como el control de crecimiento y apoptosis, y el locus del gen es frecuentemente amplificada en sarcomas. Dos polimorfismos localizados en el promotor P2 MDM2 han sido demostrado que afectan el riesgo de cáncer. Uno de estos polimorfismos (SNP309T & gt; G; rs2279744) facilita el factor de transcripción Sp1 vinculante para el promotor y se asocia con un mayor riesgo de cáncer. Por el contrario, SNP285G & gt; C (rs117039649), situado a 24 pb aguas arriba de rs2279744, y en completo desequilibrio de ligamiento con el alelo SNP309G, reduce el reclutamiento Sp1 y disminuye el riesgo de cáncer. Por lo tanto, la regulación fina de la expresión de MDM2 ha demostrado ser de gran importancia con respecto a la tumorigénesis. Se evaluaron los posibles efectos funcionales de una tercera
MDM2
polimorfismo promotor P2 (SNP344T & gt; A; rs1196333) situados en el alelo SNP309T. Mientras que
in silico
análisis SNP344A indicada para modular TFAP2A, SPIB y factor de transcripción AP1 vinculante, no se encontraron efectos de la condición de SNP344 en los niveles de expresión de MDM2. La evaluación de la frecuencia de SNP344A en los caucásicos sanos (n = 2.954) y los pacientes que sufren de ovario (n = 1.927), mama (n = 1.271), de endometrio (n = 895) o el cáncer de próstata (n = 641), se detectaron significativa diferencia en la distribución de este polimorfismo entre cualquiera de estas formas de cáncer y controles sanos (6,1% en los controles sanos, y el 4,9%, 5,0%, 5,4% y 7,2% en los grupos de cáncer, respectivamente). En conclusión, nuestros resultados proporcionan pruebas que indiquen que puede afectar a la transcripción SNP344A MDM2 o el riesgo de cáncer
Visto:. Knappskog S, Gansmo LB, Romundstad P, Bjørnslett H, J Trovik, Sommerfelt-Pettersen J, et al. (2012)
MDM2
Promotor SNP344T & gt; A (rs1196333) Estado no afecta el riesgo de cáncer. PLoS ONE 7 (4): e36263. doi: 10.1371 /journal.pone.0036263
Editor: Klaus Roemer, Universidad del Sarre, Alemania |
Recibido: 20 Febrero, 2012; Aceptado: 4 Abril 2012; Publicado: 30 de abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Knappskog et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por becas de la Sociedad del cáncer de Noruega y la Región de Salud de Noruega Oeste. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El ratón doble Minuto homólogo 2 (MDM2) es un regulador clave de p53, así como la función de la proteína retinoblastoma [1], [2], [3]. Por lo tanto, elevados niveles de proteína MDM2 debido a
MDM2
amplificación de genes o de otros mecanismos han sido considerados como una alternativa a
TP53
mutaciones que disminuyen la función de p53 en muchos cánceres humanos [2], [4], . [5], [6], [7]
en 2004, el grupo de A. Levine descubrió un polimorfismo SNP309T & gt; G (rs2279744) en el
MDM2
promotor P2 intrónica [8] . Mejora SNP309G
MDM2
niveles de expresión mediante el aumento de la transcripción Sp1 vinculante del factor y posteriormente se demostró que se asocian con un mayor riesgo y una temprana edad al momento del diagnóstico de varias enfermedades malignas [8], [9], [10].
mientras que los estudios posteriores han confirmado una asociación entre SNP309G y el riesgo de múltiples formas de cáncer, el efecto de este SNP parece diferir entre los grupos étnicos: por lo tanto, mientras que la mayoría de los estudios realizados en poblaciones judías asiáticos o Ashkenazi informes de la variante SNP309G a . aumentar el riesgo de cáncer muchos estudios realizados en poblaciones caucásicas han fracasado para reproducir un efecto similar [11], [12]
Recientemente, se informó de un segundo polimorfismo, SNP285G & gt; C (rs117039649), situado a 24 pares de bases de SNP309 en el
MDM2
promotor P2. El alelo variante SNP285C se observó sólo entre los caucásicos, en los que se forma un distintivo que representa aproximadamente el 12% de los alelos SNP309G [13] SNP285C /haplotipo 309G. SNP285C antagoniza el efecto de SNP309G mediante la reducción de factor de transcripción Sp1 fuerza de unión a la
MDM2
promotor y se asocia con un riesgo reducido de cáncer de mama, de ovario y de endometrio [13], [14].
en conjunto, los datos de los estudios sobre SNP309 y SNP285 indican claramente puesta a punto de
MDM2
la actividad del promotor P2 son de importancia para el riesgo de cáncer. Por tanto, es de interés para buscar variantes adicionales en el
MDM2
promotor que puede contribuir al riesgo de cáncer alterado
SNP344T & gt;. A (rs1196333), situado a 35 pares de bases aguas abajo del SNP309, fue inicialmente identificado por Bond et [8] al en 4 de cada 50 individuos sanos. A continuación, presentamos el primer informe de evaluación sobre el impacto del estado SNP344 sobre la expresión de MDM2, así como el riesgo de cáncer en poblaciones grandes. Por lo tanto, hemos examinado su impacto en el riesgo de cáncer de ovario, de mama, de endometrio y cáncer de próstata, y estudiadas las mismas cohortes de pacientes para los que los perfiles de riesgo vinculados a SNP309T & gt; G y SNP285G & gt; C han sido previamente analizados en detalle [13], [14].
Materiales y Métodos
MDM2
detección de estado promotor SNP344
Una región de la
MDM2 promotor P2 que contiene
SNP344 (así como SNP285 y SNP309) se amplificó previamente por PCR, secuenciado y analizado para SNP285 y el estado SNP309 [13], [14]. A continuación, se analizaron estas trazas de secuencia para el estado SNP344.
in silico predicciones
Las predicciones de los posibles sitios de unión de transcripción en el
MDM2 promotor afectados por
estado SNP344 se realizaron utilizando la base de datos JASPAR en http://jaspar.genereg.net [15]. secuencias de entrada para las predicciones eran
tgcctgtcgggtca
para el alelo-SNP344T y
tgcctgacgggtca Opiniones de la SNP344A-alelo. Perfil umbral de puntuación se establece en el 80% (configuración predeterminada).
análisis de la expresión de MDM2
El ARN total fue extraído de células blancas de la sangre extraídas de 215 hombres jóvenes como parte de una prueba de rutina durante el servicio militar obligatorio en la Marina [13] utilizando el reactivo Trizol (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se disolvió en DEPC tratada ddH
2O.
síntesis de ADNc de cadena sencilla se realizó con 500 ng de ARN total, oligo-dT - y cebadores aleatorios hexamer (Sigma) con Transcriptor de la transcriptasa inversa (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de RT-PCR del ADNc se diluyó 1:10 en ddH
2O.
PCR cuantitativas para el total de los niveles de expresión de MDM2, promotor de MDM2 2 expresión y RPLP2 (referencia interna) específica se llevaron a cabo utilizando sondas de hidrólisis ( TIB MOLBIOL) en un instrumento Ligthcycler 480 (Roche). Se utilizaron los siguientes cebadores: MDM2_F; aacatgtacctactgatggtgc, MDM2_R; cagggtctcttgttccgaagc, MDM2_TM; 6FAM-aaccacctcacagattcc-barbacoa, MDM2P2_S; gcgattggagggtagacctgt, MDM2P2_R: ggtattgcacatttgcctggat, MDM2P2_TM; 6FAM-agtggcgtgcgtccgtgcc-barbacoa, RPLP2_F; gaccggctcaacaaggttat, RPLP2_A; ccccaccagcaggtacac y RPLP2_TM; 6FAM-agctgaatggaaaaaacattgaagacgtc-barbacoa. Las amplificaciones se realizaron en un volumen de reacción de 10 l utilizando el kit LigthCycler® 480 Sondas Master (Roche) con 0,5 M de adelante y cebador, 0,125 mM de cada sonda de hidrólisis y 3 cDNA l inversa. Las condiciones de termociclado fueron: 5 min de desnaturalización a 95 ° C, antes de los 45 ciclos a 95 ° C durante 10 s y a 55 ° C durante 20 s, y una etapa final de enfriamiento a 40 ° C durante 10 s. Relativos concentraciones de ARNm de MDM2 se calcularon en base a ejecutar en las curvas de calibración y la normalización de los niveles de mRNA RPLP2 en las mismas muestras. El agua se incluye en cada control de gestión como negativo y todos los análisis se realizaron por triplicado en carreras.
controles caucásicos sanos
La distribución de los
MDM2
SNP344 entre los pacientes con cáncer se comparó con 2.954 controles sanos noruegos. Los controles se han descrito en detalle previamente [13], [14].
individuos afroamericanos
ADN de individuos afroamericanos (n = 50) se adquirió de Instituto Coriell de Investigación Médica ( Cat#HD50AA).
Los pacientes con cáncer
ovárica (n = 1.927), mama (n = 1.271), de endometrio (n = 895) y pacientes con cáncer de próstata (n = 641) eran de cohortes de pacientes que fueron analizados previamente para
MDM2
SNP285 y SNP309 [13], [14].
Ética Consideraciones
Obtención y utilización de muestras de pacientes con cáncer y controles sanos , así como los controles para análisis de expresión, fue aprobado por los Comités de Ética de la región del oeste de Noruega (hospital Universitario de Haukeland), el centro de Noruega (Universidad Noruega de Ciencia y Tecnología), y el sudeste de Noruega (Universidad de Oslo Radiumhospitalet hospital; muestras noruegas) y los comités de ética médica del Centro Médico de la Universidad de Leiden, Leiden, Países Bajos, y el foso Erasmus MC-Daniel Hoed Cancer Center de Rotterdam, Países Bajos (muestras holandesas). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.
El análisis estadístico
Los niveles de expresión de MDM2 entre los individuos con los diferentes genotipos de SNP344 se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. Entre los individuos para los cuales se analizó la expresión de MDM2 (n = 215), uno albergaba el genotipo SNP344AA. Para los cálculos estadísticos, este individuo se incluyó en el grupo SNP344TA y en comparación con el grupo SNP344TT.
diferencias potenciales en la distribución de SNP344 entre los pacientes con cáncer y controles sanos, así como entre los subgrupos de cada forma de cáncer fueron evaluados por la odds ratio (OR) y mediante la prueba exacta de Fisher. RUP se dan con intervalos de confianza del 95% (IC).
Las diferencias de potencial en la edad de aparición de la enfermedad entre los pacientes fueron evaluados mediante pruebas de rangos de Kruskal-Wallis.
La supervivencia se evaluó mediante Kaplan Meier de análisis cuando se compararon los diferentes grupos de pacientes mediante la prueba de log rank; muertes por causas distintas al cáncer de mama fueron censurados.
Todos los valores de p son de doble cara, y los valores de p calculados por la prueba exacta de Fischer son acumulativos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el SPSS /PASW (versión 15.0.1 y 17) paquete de software
Resultados
SNP344:. Haplotipo de estado y la distribución étnica
SNP344 (rs1196333 ) se encuentra dentro de la
MDM2
promotor P2, 344 pb aguas abajo del exón 1 (Figura 1). Entre 2.954 controles sanos de Noruega, se observó la SNP344A variante en 181 individuos (6,1%). Un individuo albergaba el genotipo homocigótico SNP344AA, mientras que 180 eran heterocigotos (SNP344TA; Tabla 1). Por lo tanto, la frecuencia del alelo menor fue del 3,1%, y la distribución de los genotipos fue de acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg.
(A) El promotor se encuentra entre el exón 1 y 2 de la
MDM2
gen y puertos SNP285 (rs117039649), SNP309 (rs2279744) y SNP344 (1.196.333). (B) Representante cromatograma de secuenciación de un individuo heterocigoto para SNP344 (secuencia inversa mostró como complementaria a la cadena sentido).
En particular, se observó la SNP344A variante sólo entre los individuos que albergan el SNP309TT o TG genotipo, SNP344A fuertemente indicando que se encuentra en la SNP309T de alelo, haciendo una distinta SNP309T /344A haplotipo (p & lt; 1 × 10
-10). Además, puesto que SNP285C se encuentra en la SNP309G-alelo, se puede deducir que SNP344A sólo existen en el haplotipo SNP285G /309T /344A.
En una cohorte de los afroamericanos (n = 50) que se encuentra 17 (34 %) individuos que albergan SNP344A (uno homocigotos y heterocigotos 16). Esta frecuencia fue significativamente mayor en comparación con la frecuencia observada entre los caucásicos (P & lt; 0,001). Cabe destacar que la distribución de SNP344 entre los afroamericanos estaba en línea con los datos limitados sobre este SNP se presenta en la base de datos Ensembl. En cuanto a los caucásicos, encontramos el SNP344A-alelo sólo entre los afroamericanos que albergan el SNP309T-alelo.
Efecto de la condición de SNP344 el factor de transcripción vinculante
Con el fin de evaluar el impacto potencial de la condición de SNP344 en el factor de transcripción de unión, se realizó
in silico
los análisis usando la base de datos JASPAR [15], la predicción de factor de transcripción de unión a la SNP344T y a-alelos. Utilizando la secuencia SNP344T-alelo "tipo salvaje" y un umbral perfil puntuación de 80% (configuración predeterminada) en la búsqueda de base de datos, se identificaron dos factores de transcripción sitios de unión incluyendo la posición de SNP344: un sitio de unión para TFAP2A y uno para SPIB (Tabla 2). Cuando se sustituye el SNP344T con la A-variante, la fuerza de unión predicha de TFAP2A se incrementó ligeramente, mientras que el sitio para SPIB fue interrumpido. Además, la introducción de la A genera un nuevo sitio de unión de AP1. Por lo tanto, la eficacia de la transcripción de la A-alelo, en comparación con el alelo T, podría ser reducida debido a un sitio SPIB interrumpido o aumentó debido a una mayor unión de TFAP2A y un nuevo sitio de AP1.
SNP344 niveles de estado y MDM2 expresión
Para evaluar el impacto potencial de SNP344 genotipo en la expresión de MDM2, se analizaron los niveles de ARNm de MDM2 en los leucocitos de un subgrupo de 215 hombres jóvenes sanos por qPCR. No hay diferencia en el nivel de expresión de MDM2 entre los individuos que albergan el SNP344AA (n = 1), 344TA (n = 10) o 344TT (n = 204) genotipos se registró (p & gt; 0,5 Figura 2A): perfil
caja de parcelas. representando log transformado niveles relativos de mRNA total de MDM2 (a) y ARNm específico promotor P2 (B) en los individuos que albergan el genotipo SNP344TT frente a los genotipos TA y AA.
Desde el SNP344A-variante reside en el los análisis de SNP309T alelo, se realizó subgrupo separado limita a individuos que albergan el SNP309TG (n = 101) o 309TT (n = 75) de genotipo. No hay diferencia en el nivel de expresión de MDM2 relacionada con el estado SNP344 se registró en cualquiera de estos subgrupos (p & gt; 0,4)
Dado que uno puede asumir que el estado SNP344 sólo afecta a la expresión de MDM2 de promotor P2, en la que el SNP es localizada, y que el efecto de este SNP puede estar enmascarado en ensayos que analizan el total de los niveles de expresión de MDM2, hemos realizado experimentos de qPCR similar al descrito anteriormente pero específica para el ARNm procedente de promotor P2. No se observó ninguna asociación entre el estado y la expresión específica SNP344 promotor P2 (p & gt; 0,5).
Estado SNP344 y el riesgo de cáncer
Con el fin de evaluar el impacto potencial de la condición de SNP344 sobre el riesgo de cáncer, nos comparación de la frecuencia de SNP344 variantes entre ovario (n = 1927), de mama (n = 1271), endometrial (n = 895) y pacientes con cáncer de próstata (n = 641) con los controles sanos (n = 2.954). Los resultados se resumen en la Tabla 1. No se encontraron diferencias significativas entre la frecuencia de SNP344A en cualquiera de los grupos de cáncer analizados y los controles sanos.
Dado que SNP344A estaba vinculada a la SNP309T-alelo, como se describió anteriormente , los individuos que albergan el genotipo SNP309GG pueden ser censuradas como no informativa con respecto al efecto de SNP344. Por lo tanto, se evaluó el impacto de SNP344 sobre el riesgo de cáncer entre los individuos que albergan SNP309T-alelo solamente (SNP309TG o genotipo TT, Tabla 3). No se encontró ninguna asociación entre el estado SNP344 y cualquiera de las formas de cáncer que analizan los portadores SNP309TG y 309TT por separado o combinados (Figura 3).
Forrest trama que muestra el efecto de SNP344A sobre el riesgo de cáncer de ovario, de mama, de endometrio y el cáncer de próstata, en comparación con los controles sanos, entre los individuos que albergan el genotipo SNP309TG (a), el genotipo SNP309TT (B) y los genotipos de TG y TT combinan (C).
SNP344 de estado y parámetros clínicos
se evaluó además el impacto potencial de la condición de SNP344 de varios parámetros clínicos entre los pacientes incluidos en las comparaciones de casos y controles descritos anteriormente.
los datos para la edad de aparición de la enfermedad fue de disponible para todos endometrial (n = 895) y pacientes con cáncer de próstata (n = 641), así como grandes sub-cohortes de mama (n = 1,173) y los pacientes con cáncer de ovario (n = 761). No se encontraron efectos de SNP344-estado en la edad de inicio en cualquiera de las cuatro formas de cáncer cuando se comparan grupos de pacientes totales para cada forma de cáncer o subgrupos estratificados según SNP309-estado (todos los valores p & gt; 0,15).
Entre el cáncer de mama pacientes analizados, muchos estaban matriculados en estudios prospectivos para identificar mecanismos genéticos de la resistencia a la quimioterapia; n = 106 a partir de dos estudios que evalúan la monoterapia con doxorrubicina o un combinado de los regímenes de 5-fluorouracilo /mitomicina [16], [17], mientras que n = 201 se obtuvieron de un estudio de aleatorización entre epirubicina y paclitaxel monoterapia [18], [19]. Por lo tanto, para estos pacientes que teníamos registros detallados de respuesta objetiva a la terapia en el tratamiento neoadyuvante. estado SNP344 no afectó a la respuesta a cualquiera de dañar el ADN fármacos (doxorrubicina, mitomicina) o veneno husillo (paclitaxel; p & gt; 0,1 para todas las comparaciones) en estos estudios, aunque la conclusión aquí puede ser incierto debido a un número limitado de SNP344A-alelos observados. El efecto potencial de la condición de SNP344 en la supervivencia libre de recaída o general puede ser evaluada en estos estudios debido al número limitado de individuos que albergan el alelo 344A-.
En un estudio anterior, encontramos el estado de MDM2 SNP285 correlacionar poner en escena en los carcinomas de endometrio [14]. En este caso, no se registró ninguna correlación entre la FIGO estadio y el estado SNP344. (Todos los valores p & gt; 0,3).
Discusión
MDM2 es un factor importante para la regulación de la homeostasis celular a través de su estrecha interacción con las proteínas como p53, PRB y E2F1. Por lo tanto, MDM2 controla procesos como la detención del crecimiento, la apoptosis y senescencia, y la amplificación del gen MDM2 y la traducción mejorada se han observado en muchas formas de tumores [2], [4], [5], [6], [7].
la importancia de la expresión de MDM2 en la prevención del desarrollo de cáncer se destaca además en el hallazgo de que el
MDM2
promotor P2 SNP 285 y 309 tanto modular la unión del factor de transcripción y afectan el riesgo de múltiples formas de cáncer [8], [11], [13], [14]. Si bien el mecanismo exacto de la iniciación de la transcripción de la
MDM2
promotor P2 no se conoce, este promotor se activa en respuesta al estrés celular, y además de Sp1, P2 alberga sitios de unión para múltiples factores de transcripción, incluyendo p53, la receptor de estrógeno, AP1 [8], [14], así como varios otros (de predicción por la base de datos JASPAR; datos no mostrados).
SNP344T & gt; A es el tercio
MDM2
polimorfismo promotor P2 . SNP285C contraste, que se encuentra en el alelo SNP309G, SNP344A reside en el alelo SNP309T. Aquí, hemos realizado
in silico
predicción evaluar la resistencia de unión al factor de transcripción y se determinó el efecto del estado SNP344 en los niveles de transcripción de MDM2 en los linfocitos. Mientras SNP344 se encontró a afectar a la unión de los factores de transcripción TFAP2A, SPIB y AP1, no se registró ningún efecto del estado SNP344 de MDM2 transcripción. Es importante destacar que la evaluación de la distribución de un SNP344 en una gran cohorte de individuos sanos y en los pacientes que sufren de ovario, de mama, de endometrio y cáncer de próstata, se detectó ninguna diferencia con respecto a la distribución SNP344 entre individuos sanos y pacientes con cáncer. Si bien nuestro estudio incluyó un número limitado de formas de cáncer, para tres de estos tipos de cáncer (mama, endometrio final ovario) la variante SNP285C previamente se ha demostrado que afectan el riesgo individual en la misma población étnica [13], [14]. Por lo tanto, estos tumores malignos representan formas de cáncer adecuados para detectar cualquier efecto potencial del estado SNP344 sobre el riesgo de la enfermedad
Contrastando la SNP285G & gt;. C polimorfismo que se detecta entre los caucásicos única [13], SNP344A, similar a SNP309G, parece ser un antiguo polimorfismo que también está presente entre los africanos. Curiosamente, la distribución del alelo variante SNP309G, sino también SNP344A, parece ser muy variable entre los diferentes grupos étnicos. Mientras que la frecuencia del alelo SNP309G varía de ~ 10% en los africanos a ~ 40% en caucásicos y ~ 50% en los asiáticos [12], la frecuencia del alelo SNP344A es de aproximadamente 18% en los africanos pero 3% sólo en los caucásicos. Esta diferencia en la distribución étnica, en conjunto con la rápida propagación del polimorfismo SNP285C joven entre los caucásicos [20], indica que los tres
MDM2
polimorfismos del promotor P2 pueden estar sujetos a la selección evolutiva bajo diferentes condiciones de vida. Por lo tanto, nuevas investigaciones que aclaren impacto potencial de SNP344 en función biológica distinta de las formas de cáncer reportados aquí pueden estar justificados.
Reconocimientos
La mayor parte del trabajo se realizó en el Laboratorio de Investigación del Cáncer Mohn. Agradecemos a Beryl Leirvaag, Elise de Faveri, Gjertrud T. Iversen, Nhat Kim Duong y Hildegunn Helle para la asistencia técnica. Agradecemos también el Servicio Médico, Marina Real de Noruega y el Servicio Médico noruego defensa para facilitar la recogida de muestras. Los investigadores clínicos en el seno de Noruega Grupo de Cáncer de prueba NBCG VI son Pistola Anker, Departamento de Oncología, Hospital Universitario de Haukeland; Bjorn Ostenstad, Departamento de Oncología, Hospital de la Universidad Ullevaal; Steinar Lundgren, Hospital de la Universidad de St.Olav; Terje Risberg, Departamento de Oncología, Hospital de la Universidad del Norte de Noruega; y Ingvil Mjaaland, División de Hematología y Oncología del Hospital Universitario de Stavanger.