Extracto
Antecedentes
Estudios anteriores han demostrado que los microARNs se dysregulated en el cáncer de tiroides y juegan un papel importante en la regulación post-transcripcional de oncogenes diana y /o genes supresores de tumores.
Metodología /Principales conclusiones
Se estudió la función de miR-126-3p en células de cáncer de tiroides, y como marcador de la agresividad de la enfermedad. Hemos encontrado que la expresión de miR-126-3p fue significativamente menor en los tumores más grandes, en muestras de tumores con invasión extratiroidea, y en el cáncer de tiroides grupo de mayor riesgo en 496 muestras de cáncer de tiroides papilar de la cohorte del estudio del Genoma del Cáncer Atlas. En un conjunto de muestras independientes, disminuir la expresión de miR-126-3p se observó en los cánceres de tiroides folicular (que tienen capsular y la invasión vascular) en comparación con los adenomas foliculares. la proliferación de células de cáncer de tiroides de manera mecánica, la sobreexpresión ectópica de miR-126-3p inhibió significativamente,
in vitro gratis (p & lt; 0,01) y
in vivo gratis (p & lt; 0,01), la formación de colonias (p & lt; 0.01), la formación de esferoides de tumor (p & lt; 0,05), la migración celular (p & lt; 0,05), VEGF secreción y formación de tubo endotelial y pulmón metástasis
in vivo
. Encontramos 14 predijo genes diana, que se alteraron significativamente tras la transfección de miR-126-3p en células de cáncer de la tiroides, y que están involucrados en la biología del cáncer. De estos 14 genes,
SLC7A5
y
ADAM9
se confirmó que es inhibida por la sobreexpresión de miR-126-3p y ser blanco directo de miR-136-3p.
conclusiones /Importancia
para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que demuestra que el miR-126-3p tiene una función supresora de tumores en las células del cáncer de tiroides, y está asociado con fenotipo de la enfermedad agresiva.
Visto: Xiong y, Kotian S, Zeiger MA, Zhang L, Kebebew e (2015) miR-126-3p inhibe el crecimiento celular del cáncer de tiroides y metástasis, y se asocia con el cáncer de tiroides agresivo. PLoS ONE 10 (8): e0130496. doi: 10.1371 /journal.pone.0130496
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, CHINA
Recibido: 20 Marzo, 2015; Aceptado: 19-may de 2015; Publicado: 5 de Agosto, el año 2015
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la licencia Creative Commons CC0 dominio público dedicación
Disponibilidad de datos:. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Esta investigación fue apoyada por el intramural programa de investigación del Centro de investigación del cáncer, Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Los autores no tienen ningún conflicto de intereses a revelar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de tiroides es el cáncer endocrino más común. y una de las de más rápido crecimiento diagnósticos de cáncer en los Estados Unidos [1,2]. Los cánceres de tiroides se originan a partir de células parafoliculares (medular) y las células foliculares (no medular), que representan más del 95% de todos los casos de cáncer de tiroides y se clasifican en cuatro grandes grupos histológicos: cáncer de tiroides folicular (FTC), cáncer papilar de tiroides (PTC ), cáncer de tiroides anaplásico (ATC), y el carcinoma de células Hürthle (HCC).
Los microARN (miRNA) son pequeñas, los ARN no codificantes que son aproximadamente 21 nucleótidos de longitud y regulan la expresión génica [3,4]. miRNAs juegan un papel importante en la tumorigénesis y muestran una notable especificidad de tejido, y también se han encontrado miRNAs a ser buenos biomarcadores de cáncer [5]. Estudios anteriores han demostrado que varios miRNAs se dysregulated en cánceres de tiroides procedentes de células foliculares [6-8]. En nuestro estudio anterior, se encontró que la expresión de miR-126-3p se downregulated en muestras de tumores malignos de tiroides en comparación con muestras de tumores benignos de la tiroides [9,10]. Se observó regulados a la baja expresión de miR-126-3p en FTC y HCC, que sólo son histológicamente distinguible de folicular o adenomas de células Hürthle cuando la invasión capsular y /o invasión vascular están presentes. El papel de miR-126-3p en el cáncer de tiroides no se ha estudiado anteriormente, pero nuestro análisis de la expresión en muestras de cáncer de tiroides sugiere que la pérdida de miR-126-3p puede estar asociada con la progresión del cáncer de tiroides, y que puede funcionar como una supresor de tumores.
En el presente estudio, hemos probado la hipótesis de que el miR-126-3p es un supresor de tumores y se asocia con fenotipo de la enfermedad. Se determinó la función de miR-126-3p en células de cáncer de tiroides, utilizando tanto
in vitro
y
in vivo y modelos. Se encontró que la sobreexpresión de miR-proliferación 126-3p inhibió significativamente las células del cáncer de tiroides, la formación de colonias, la formación de esferoides de tumores, la migración, la secreción de VEGF y la formación de tubo HUVEC, y metástasis pulmonares
in vivo
. Además, hemos encontrado que el miR-126-3p regula la expresión de muchos genes relacionados con el cáncer, incluyendo los que codifican soluto transportista familia de 7 miembros 5 (
SLC7A5
) y una proteína desintegrina y metaloproteinasa de dominio que contienen 9 (
ADAM9
), y que se dirige directamente a estos genes. Por último, se encontró que la expresión de miR-126-3p estar asociado con la agresividad de la enfermedad.
Métodos
El Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de la Salud aprobó el estudio de los animales protocolo. Cuando los ratones alcanzaron los criterios de eutanasia humanitaria, los ratones fueron imágenes y sacrificados por inhalación de CO2. El estudio fue aprobado por la Oficina de Protección de Investigación Humanos y se recogió la información del paciente de forma prospectiva en virtud de un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional de los Institutos Nacionales de Salud Centro Clínico (Bethesda, Maryland) después de obtener el consentimiento informado por escrito.
muestras de tumores de tiroides humana, líneas celulares y condiciones de cultivo
tejido tiroideo humano se obtuvo en el momento de la extirpación del tumor, inmediatamente se congelaron y se almacenaron a -80 ° C. secciones de tejido de serie se utilizaron para la extracción de RNA y se tiñeron con hematoxilina y eosina para confirmar el diagnóstico y que el contenido de células tumorales era 80% o superior. El estudio fue aprobado por la Oficina de Protección de Investigación Humanos y se recogió la información del paciente de forma prospectiva en virtud de un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional de los Institutos Nacionales de la Salud después de obtener el consentimiento informado por escrito.
líneas celulares de cáncer de tiroides humana XTC- 1 (HCC), FTC-133 (FTC), y TPC-1 (PTC) se mantuvieron en DMEM con 4.500 mg /l de D-glucosa y L-glutamina, y 110 mg /l de piruvato de sodio, suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), estimulante de la tiroides de la hormona (10 mU /ml), penicilina (10.000 U /ml), estreptomicina (10.000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml), y la insulina (10 mg /ml) en un incubador humidificado estándar a 37 ° C en un 5% de CO
2 y el 95% de O
2 atmósfera. células FTC-133-Luc2 se generaron mediante la transfección de células de FTC-133 con un vector de luciferasa que expresan, y las células se cultivaron en el mismo medio con G418 a una concentración de 200 mg /ml [11]. Las líneas celulares se autentican utilizando repeticiones cortas en tándem perfiles
miARN transfección
Un miARN para imitar hsa-miR-126-3p (miARN mímica, Ensayo de identificación:. MC12841; Applied Biosystems, Foster City , CA) se transfectó en células a una concentración de 25 nM usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. Un oligonucleótido que no representan a ningún conocido miARN (miARN Mimic Control Negativo#1; Applied Biosystems). Se utilizó como control negativo
El aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
El ARN total fue aislado de las líneas celulares y muestras de tejidos utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). El microARN ensayo TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) se utilizó para medir el nivel de expresión de miR-126-3p (HSA-mir-126-3p, Ensayo ID: 002228). El ARN total se transcribió de forma inversa con un cebador-miARN específico, seguido por PCR en tiempo real utilizando sondas TaqMan. U6 se utilizó como control endógeno. Las cantidades relativas de
ADAM9
y
SLC7A5
ARNm se determinaron utilizando el ensayo TaqMan (Applied Biosystems) en un sistema ABI 7900 HT; humano
GAPDH
se utilizó como control endógeno. El método ΔΔ Ct se utilizó para calcular los niveles de expresión.
Western blot
lisado de células completas se preparó con tampón RIPA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y se utilizó para la detección de proteínas ADAM9 por transferencia de Western usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-ADAM9 anticuerpo (dilución 1: 1000; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) y para la detección de proteínas SLC7A5 por Western blot utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-SLC7A5 (1: 500 dilución; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). proteína GAPDH, un control, se detectó mediante el uso de un (# 0411) de anticuerpo-GAPDH contra (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). monoclonal de ratón
se determinó Ensayo de proliferación de
La proliferación celular usando el Cell CyQUANT Ensayo de proliferación (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La intensidad de fluorescencia se midió utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), con excitación a 485 nm y emisión detección a 538 nm.
se midió ensayo de migración
migración celular usando una Cámara BD (Catálogo#354578, BD Biosciences, Bedford, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Medio de cultivo celular con 10% de FBS se utilizó como un quimioatrayente en el pocillo inferior de la cámara de Boyden. las células del cáncer de tiroides se sembraron en el compartimiento superior de la cámara en medio libre de suero (4 × 10
4 células por pocillo). Después de incubación a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 22 horas, las células no migran se retiran de la superficie superior, y las células que habían migrado a través de la membrana a la superficie inferior se tiñeron con el Diff-Quik Equipo de tinción (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Las imágenes fueron tomadas de la membrana de cada inserto con un microscopio (50 aumentos) usando una cámara digital. Las imágenes se ven en la pantalla del ordenador y se contaron las células en cinco campos de cada inserto.
cultura esferoide
Dos días después de miARN transfección, se tripsinizaron las células, se contaron, se resuspendieron en medio de cultivo , y se colocaron en una placa de clústeres ultra bajo (Costar, Corning, NY) a 3,5 × 10
4 células por pocillo. Las placas se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2, y el medio se cambió cada 2 a 3 días. Después de 2 semanas de cultivo, las células se tiñeron con violeta cristal y se fotografiaron con un microscopio. La superficie total ocupada por esferoides dentro de una imagen se midió circunscribiendo el perímetro de cada esferoide, que marca toda la zona, y el cálculo del número de píxeles utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU.).
ensayo de agar suave para la formación de colonias
Tres días después de miARN transfección, se tripsinizaron FTC-133 células, se contaron, y se resuspendieron en medio de cultivo. Dos capas ensayos de agar blando se realizaron en placas de seis pocillos. La capa inferior de agar (2 ml /pocillo) contenía% de agar 0,6 (Difco agar noble; BD Diagnostics, Sparks, MD) en medio F-12 de Ham, suplementado con 10% FBS, penicilina (100 U /ml), estreptomicina ( 10000 U /ml) y Fungizone (250 ng /ml). Treinta mil células se mezclaron con 1 ml de solución de agar superior (agar 0,35% en medio de cultivo). Después de 30 minutos, se añadió 1 ml de medio de cultivo a cada pocillo. Las placas se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2, y los medios se cambiaron dos veces a la semana. Después de dos semanas de cultivo, las colonias de células se tiñeron con violeta cristal y se examinan bajo un microscopio. recuento de colonias se llevó a cabo en tres campos diferentes.
estudios de xenoinjertos de tumores
células FTC-133 que contienen el gen indicador de luciferasa
luc2
fueron transfectadas con miR-126-3p o miR NC y por vía subcutánea inoculado (10
6 células viables) en los costados izquierdo y derecho de ratones desnudos atímicos. Los tumores se midieron con calibradores en diferentes puntos de tiempo, y los volúmenes se calcularon como longitud x anchura x altura. muestras de tumores de la autopsia fueron fotografiados para documentar la morfología bruto, y luego se pesaron las muestras. FTC-133-
luc2
células (7,5 × 10
5) transfectadas con el miR-126-3p y miR-NC se inyectaron en ratones desnudos atímicos a través de la vena de la cola, y los ratones fueron imágenes utilizando semanal un sistema 100 Xenogen IVIS.
cicatrización de heridas ensayo
el cáncer de tiroides migración celular se evaluó mediante un ensayo de herida cero [12] en el que las células se transfectaron con 150.000 miRNAs, plateado en la curación de seis pocillos placas, y deja que se unan y crecer durante 44 horas (miRNAs). A continuación, tres heridas verticales se hicieron con una punta de pipeta de 10 l estéril, y luego una línea horizontal se hizo a través de las tres líneas de modo que las células se pudo observar en el mismo punto. Las células fueron inspeccionados cada 12 horas y medidas de ancho tomadas hasta 24 horas.
VEGF ELISA
se recogió sobrenadante del cultivo de medios de 72 horas después de la transfección de las células de cáncer de tiroides con miR-NC o miR 126-3p. Los niveles de VEGF se midieron utilizando el kit de VEGF humano Quantikine ELISA (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN). Los niveles de VEGF se normalizaron a los niveles de proteína total utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
La inmunohistoquímica
embebidos en parafina secciones de tejido pulmonar de los ratones inyectados con FTC-133- Luc2 células transfectadas con cualquiera de miR-NC o miR-126-3p se des-con parafina y rehidratada. Las secciones se trataron a continuación con anti-VEGF (ab46154, Abcam, Cambridge, MA). Las láminas fueron escaneados utilizando un escáner de diapositivas digitales XT ScanScope, y se analizó usando el software ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).
formación de tubo endotelial ensayo
Las células transfectadas con el miR-NC y miR-126-3p se sembraron a una densidad de 3000-4000 células en una placa de 96 pocillos, 48 horas después de la transfección. Las células se dejó que se unieran durante la noche, y la matriz de matrigel sótano (BD Biosciences) se colocó sobre las células. a continuación, se añadieron células HUVEC (Lonza, Walkersville, MD) en la parte superior de la capa de matrigel a una densidad de 60.000 células por pocillo. Se observó la formación de tubos endoteliales y se fotografió con el tiempo.
array expresión del ARNm de todo el genoma
células TPC-1 y la FTC-133 se transfectaron con miR-126-3p y miR-NC . Tres días después de la transfección, las células se recogieron y el ARN total se extrajo de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE.UU.). Uno de ciento cincuenta nanogramos de ARN total se utilizaron para llevar a cabo la transcripción inversa de ADNc, la síntesis, la amplificación, la fragmentación y marcaje terminal usando GeneChip WT Sentido Meta Etiquetado y reactivos de control (Affymetrix, Santa Clara, CA). Aproximadamente el 25 ng /l de cDNA se hibrida con un Affymetrix Human Gene 1.0 ST GeneChip matriz. Los arreglos fueron lavados y teñidos utilizando el protocolo de fluidos FS450_0007 procedimiento en una estación de fluidos Affymetrix 450. Las intensidades de la sonda fueron escaneados con el escáner GeneChip 3000. Los datos en bruto se normalizaron y se analizaron usando el software Partek Genómica Suite (Partek, Inc., St. Louis, MO). Se utilizó el análisis de varianza para determinar los conjuntos de sonda que fueron significativamente diferentes entre los dos grupos. La lista de genes se filtró con un factor de cambio de corte de 1,3 y p & lt ajustado; 0.05. Se utilizó el sistema Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) para el análisis de la vía
predicciones miARN-126-3p
TargetScan 5.1 (http:. //TargetScan .org /) se utilizó para identificar los posibles genes diana directa de miR-126-3p.
reportero de luciferasa ensayo
El par 1.573-base 3'-UTR del ser humano
ADAM9
se clonó en un vector informador de luciferasa vacío, pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), generando un tipo salvaje
ADAM9
3'-UTR constructo informador de luciferasa (pEZX-ADAM9-3'UTR) . El par 2.947-base 3'-UTR del ser humano
SLC7A5
también se clonó en pEZX-MT01, generando un tipo salvaje
SLC7A5
3'-UTR constructo informador de luciferasa (pEZX-SLC7A5- 3'UTR). Para el ensayo de luciferasa dual, células FTC-133 se sembraron por triplicado en placas de 24 pocillos y se co-transfectaron con 0,25 g del constructo reportero y 15 pmol de miR-126-3p o miR-NC usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . A las 24 horas, se lisaron y se ensayaron para las células tanto de luciérnaga y
Renilla
actividad de luciferasa usando el ensayo de luciferasa de miR Kit (GeneCopoeia) en un lector de microplacas SpectraMax M5e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), de acuerdo con la las instrucciones del fabricante.
análisis de los datos
cáncer del Instituto Nacional del cáncer Atlas del Genoma (TCGA) se utilizó conjunto de datos para el cáncer de tiroides para determinar una asociación entre la expresión de miR-126-3p y la enfermedad de la agresividad (datos portal, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). valores de intensidad normalizada (log 10) para la expresión de miR-126-3p se obtuvieron de 454 papilares muestras de cáncer de tiroides. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media. Para determinar la significación estadística, se utilizó un análisis de la prueba de varianza y t, como sea apropiado. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
expresión de miR-126-3p en el cáncer de tiroides está asociado con fenotipo de la enfermedad agresiva y los tumores con invasión vascular y capsular
Nos habíamos identificado previamente miR-126-3p a ser regulado por disminución en los cánceres tiroideos de origen folicular de células y en los tipos de tumores que eran difíciles de diagnosticar por examen biopsia del tumor como la invasión capsular y la invasión vascular no se pueden determinar mediante citología. Por lo tanto, estaban interesados en determinar si la expresión de miR-126-3p se asoció con la agresividad de la enfermedad y, específicamente, en los tumores con invasión capsular y la invasión vascular. Para investigar esto, hemos utilizado el conjunto de datos TCGA para el cáncer papilar de tiroides. Hemos encontrado que la expresión de miR-126-3p fue menor en los tumores primarios más grandes (Fig 1A), en muestras de tumores con invasión extratiroidea (Fig 1B), y en alto riesgo de cáncer de tiroides grupo (Fig 1C). Dada la asociación de miR-126-3p con cáncer papilar de tiroides más agresivo, la próxima pregunta si la expresión de miR-126-3p fue menor en los tumores localizados con invasión capsular y la invasión vascular utilizando muestras de cáncer de tiroides folicular y adenomas para los que la malignidad se establece solamente por la presencia de estas dos características del cáncer. Encontramos miR-126-3p fue significativamente menor en el cáncer de tiroides folicular localizado en comparación con adenomas foliculares (Fig 1D). Estos resultados en conjunto sugieren que el miR-126-3p puede tener un papel importante en la iniciación del cáncer de tiroides y el o la progresión.
(A) miR-126-3p es significativamente menor en el cáncer papilar de tiroides más grande (en comparación con T3 T2 y tumores T1). Los datos para las muestras TCGA con datos de tamaño de tumor disponibles. T1 tumores menores de 2 cm y no crece fuera de la tiroides, tumores T2 & gt; 2 cm, pero & lt; 4cm y no crece fuera de la tiroides, tumores T3 medición & gt; 4cm o en crecimiento fuera de la tiroides. ** Indica p & lt; 0,01, *** indica p & lt; 0.001. eje Y es log
10 normalizada de expresión. (B) la expresión de miR-126-3p es significativamente menor en el cáncer papilar de tiroides con invasión mínima y extratiroidea moderada. ** Indica p & lt; 0,01, *** indica p & lt; 0.001. eje Y es log
10 normalizada de expresión. la expresión (C) miR-126-3p es significativamente menor en papilar riesgo del cáncer de tiroides alta e intermedia MACIS en comparación con los tumores de bajo riesgo MACIS. MACIS es un sistema de puntuación de pronóstico utilizado en la base de datos TCGA que se basa en la presencia de metástasis, la edad del paciente, integral de la resección, la invasión local, y el tamaño del tumor. ** Indica p & lt; 0,01, *** indica p & lt; 0.001. eje Y es log
10 normalizada de expresión. expresión (D) miR-126-3p es significativamente menor en el cáncer de tiroides folicular de adenoma folicular de tiroides. Todos los casos de cáncer de tiroides folicular tenían evidencia histológica de invasión capsular y vascular y los adenomas no tenía ninguna evidencia de invasión capsular y vascular. ** Indica p & lt; 0.01. eje Y es 2 ^ -. (ΔΔCt) guía empresas
miR-126-3p tiroides regula la proliferación de células cancerosas, la colonia y la formación de esferoides, y la migración celular
Dada la asociación entre miR 126-3p expresión y el fenotipo de la enfermedad del cáncer de tiroides agresivo, que querían determinar si la función de miR-126-3p en el cáncer de tiroides podría explicar esta asociación de manera mecánica. Overexpressed miR-126-3p en tres líneas celulares de cáncer de tiroides bien caracterizados y autenticados (TPC-1, FTC-133 y XTC-1) usando el miR-NC como control negativo para determinar su efecto sobre la proliferación celular. sobreexpresión inhibe la proliferación celular miR-126-3p significativamente en TPC-1 y las células en 120 horas, por 52% (p & lt; 0,001) 133-FTC y 37% (p & lt; 0,001), respectivamente; sin embargo, inhibió la proliferación solamente por 16% en las células XTC-1 a 168 horas (P & lt; 0,001) (Figura 2A, 2B y 2C). Un ensayo de formación de colonias en agar blando se realizó para evaluar el crecimiento independiente de anclaje en FTC-133, que es una línea celular de cáncer de tiroides de formación de colonias. Encontramos un número significativamente menor de colonias en las líneas celulares que sobreexpresan FTC-133 miR-126-3p (figura 2D). También se estudió el efecto de miR-126-3p en la formación de esferoides de tumor de células del cáncer de tiroides. Las líneas celulares FTC-133 y XTC-1 forman esferoides cuando se cultivan en matraces de ultra-bajas cultivo adherente, y después de la transfección con miR-126-3p, el número y tamaño de esferoides se redujo significativamente (Fig 2E).
(A-C) la proliferación de células de cáncer de tiroides línea con la sobreexpresión de miR-126-3p. El eje Y representa el número de células. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). (* Indica p & lt; 0,05; ** indica p & lt; 0,01; *** indica p & lt; 0,001). sobreexpresión (D) miR-126-3p inhibe la formación de colonias en células de cáncer de tiroides. el número de colonias en las líneas celulares FTC-133. El eje Y representa el número de colonias por campo. Las barras de error representan SEM (*** indica p & lt; 0,001). la sobreexpresión de (E) miR-126-3p disminuye el tamaño y el número de esferoides. Panel superior: imagen representativa de esferoides en la cultura con la sobreexpresión de miR-126-3p (FTC-133 células). Panel inferior: La cuantificación de las diferencias entre los esferoides XTC-1 y células FTC-133 con sobreexpresión de miR-126-3p. La superficie total ocupada por los esferoides dentro de una imagen se midió circunscribiendo el perímetro de cada esferoide, que marca toda la zona, y el cálculo del número de píxeles con el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU.). El eje Y representa el tamaño y número de los esferoides. Las barras de error representan el SEM (* indica p & lt; 0,05).
Se determinó el efecto al lado de miR-126-3p sobre la migración celular utilizando el ensayo cero cicatrización de la herida. Se encontró que la sobreexpresión de MIR 126-3p-cierre de la herida, inhibió en las células TPC-1 (P & lt; 0,001), FTC-133 células (p & lt; 0,001), y las células XTC-1 (P & lt; 0,01) (Fig 3A). Para confirmar nuestros hallazgos, que también se utiliza una cámara de Boyden ensayo para estudiar el efecto de miR-126-3p sobre la migración celular. Se encontró que la sobreexpresión de miR-126-3p también la migración de células inhibió significativamente (Fig 3B).
herida de ensayo (A) y el ensayo de cámara de Boyden (B) los datos de curación. la sobreexpresión de miR-126-3p disminuyó significativamente cierre de la herida anchura a las 24 horas en todas las líneas celulares de cáncer de tiroides estudiados. El eje Y representa la distancia de la herida. Las barras de error representan SEM (** indica p & lt; 0,01; *** indica p & lt; 0,001). la sobreexpresión de miR-126-3p disminuyó significativamente el número de células migradas en todas las células de cáncer de tiroides en el ensayo de cámara de Boyden. El eje Y representa el número de células que migraron por campo. Las barras de error representan el SEM (* indica p & lt; 0,05; ** indica p & lt; 0,01; *** indica p & lt; 0,001).
miR-126-3p regula el crecimiento de tumores de tiroides y metástasis
in vivo
Dada nuestra
in vitro
de datos, hemos querido evaluar el efecto de miR-126-3p sobre el crecimiento tumoral
in vivo
y determinar si transitoriamente niveles elevados de miR-126-3p podrían tener un efecto fenotípico sostenida a largo plazo. Se encontró que los xenoinjertos tumorales derivadas de FTC-133-
luc2
células transfectadas con miR-126-3p fueron significativamente más pequeño y pesaba menos de xenoinjertos de tumor del grupo de miR-NC (p & lt; 0,01) (Fig 4A) . Debido a que uno de los efectos más dramáticos de la sobreexpresión de miR-126-3p
in vitro
estaba en la migración celular, A continuación se determinó si las metástasis regulado miR-126-3p
in vivo
. Para determinar si la sobreexpresión de miR-126-3p podría inhibir la metástasis tumoral
in vivo
, FTC-133-
luc2
células transfectadas con el miR-126-3p y miR-NC se inyectaron en atímicos ratones desnudos a través de la vena de la cola, y los ratones se obtuvieron imágenes de todas las semanas. Se encontró que la sobreexpresión de la metástasis de pulmón miR-126-3p suprimida drásticamente en este modelo (Fig 4B).
(A) Crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos. Panel izquierdo: imágenes representativas de tamaño de xenoinjerto en ratones en la autopsia. el panel central y derecho: la actividad luciferasa del tumor y la medición del volumen del tumor y el peso. células FTC-133-Luc2 transfectadas con miR-126-3p y miR-NC se inocularon por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos atímicos. (B) la metástasis del tumor. Panel izquierdo: Imágenes representativas de los ratones con metástasis que muestran señal de luminiscencia. El panel medio: La cuantificación de las diferencias de intensidad de señal de luminiscencia entre miR-126-3p y miR-NC. células FTC-133-Luc2 transfectadas con miR-126-3p y miR-NC se inyectaron en ratones desnudos atímicos a través de la vena de la cola, y los ratones fueron imágenes con un sistema de 100 Xenogen IVIS. La señal de luminiscencia relativa de cada ratón se calculó como la relación de la señal original a la señal tomada 14 días después de la inyección. Las imágenes que aparecen aquí se tomaron 7 semanas después de la inyección venosa de las células tumorales. Las barras de error representan SEM (* indica p & lt; 0,05; ** indica p & lt; 0,01; *** indica p & lt; 0,001). Todos los experimentos con animales se repitieron dos veces. sección teñida-E del tumor de pulmón metastásico inducida por la FTC, una imagen microscópica representante (hematoxilina y eosina [H & amp; E] manchas) de tumor de pulmón metastásico inducida por las células FTC-133-Luc2 transfectadas con el miR-NC y un H & amp: El panel de la derecha -133-Luc2 células transfectadas con el miR-126-3p.
miR-126-3p regula ADAM9 y expresión SLC7A5 en células de cáncer de tiroides
Dado que el miR-126-3p tenía un efecto sobre la proliferación celular, la migración y la metástasis
in vitro
y
in vivo
, estábamos interesados en la determinación de su vía (s) de destino y el gen (s). Se han utilizado dos enfoques para determinar candidatos objetivos de miR-126-3p:. (1) análisis de la expresión de todo el genoma con la sobreexpresión de miR-126-3p y (2) un análisis de la base de datos de predicción objetivo
análisis
Integrado de la datos de expresión de genes en todo el genoma y el objetivo de predicción de exploración reveló 14 genes como objetivos de miR-126-3p (S1 Tabla). A continuación realizó un análisis de la vía con estos 14 genes. Las enfermedades principales y las funciones biológicas identificadas por el IPA se resumen en la Tabla S2. El cáncer fue la categoría de enfermedad de la punta, con cuatro moléculas implicadas en esta vía que se redujo significativamente por la sobreexpresión de miR-126-3p. Por otra parte, entre los 14 genes, se encontró que los
SLC7A5
tenía los más altos cambios veces en ambas líneas celulares tras la sobreexpresión de miR-126-3p, y
ADAM9
tenía el segundo más alto factor de cambio (2,8 -fold) en las células FTC-133, que se utilizaron para ambos
in vitro Opiniones y
in vivo
ensayos en el presente estudio. Tanto
ADAM9
y
SLC7A5
juegan un papel importante en varios tipos de cáncer y se ha demostrado que pueden ser objetivo de miR-126-3p [13-16]. Por lo tanto, estaban interesados en determinar si los niveles de proteína y SLC7A5 ADAM9 se alteraron a la sobreexpresión de miR-126-3p. Se encontró que la sobreexpresión de la reducción de expresión de proteínas SLC7A5 miR-126-3p en TPC-1 y células (Fig 5A) 1 XTC-y redujo la expresión de proteínas ADAM9 en las tres líneas celulares (TPC-1, FTC-133, y XTC-1) (Fig 5B). También se encontró que la sobreexpresión de miR-126-3p downregulated expresión de la proteína en ADAM9 FTC-133-
luc2
xenoinjertos de tumores que habían sido inoculados por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos atímicos y se dejó desarrollar durante 10 días (Figura 5C ). Teniendo en cuenta estos resultados, se determinó a continuación si
ADAM9
y /o
SLC7A5
eran blancos directos de miR-126-3p. Hemos realizado ensayos de luciferasa en células FTC-133 co-transfectadas con pEZX-ADAM9-3'UTR (vector con 3'-UTR de
ADAM9
) y miR-126-3p o miR-NC. Se encontró que la sobreexpresión de miR-126-3p disminuyó significativamente la actividad de luciferasa en comparación con el control negativo (Fig 5D), sugiriendo que miR-126-3p se dirige directamente a la región 3'-UTR de
ADAM9
y
SLC7A5
en células de cáncer de tiroides. A continuación analizaron si había una asociación entre la expresión de miR-126-3p y expresión ADAM9 y SLC7A5 ARNm en el conjunto de datos papilar cáncer de tiroides TCGA, y se encontró una asociación inversa significativa con la expresión de ARNm SLC7A5 (r = -0.257, p & lt; 0,01), pero no con la expresión ADAM9 ARNm (figura 5E).
(a) inmunotransferencias de SLC7A5 y GAPDH en líneas celulares XTC-1 TPC-1 y, que fueron transfectadas con cualquiera de miR-126-3p o miR-NC para 72 horas. La línea celular FTC-133 no tenía ninguna expresión de la proteína detectable por SLC7A5. (B) Las inmunotransferencias para ADAM9 y GAPDH en TPC-1, las líneas celulares XTC-1 FTC-133 y, que fueron transfectadas con cualquiera de miR-126-3p o miR-NC durante 72 horas
in vitro
. (C) Las inmunotransferencias para detectar ADAM9 y GAPDH en xenoinjertos de tumores FTC-133-Luc2 que habían sido inoculados por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos atímicos y se dejó desarrollar durante 10 días. (D) La actividad de luciferasa de pEZX-SLC7A5-3'UTR y pEZX-SLC7A5-3'UTR en las células FTC-133 cuando se co-transfectaron con miR-126-3p o miR-NC. Todas las mediciones de luciferasa se realizaron por triplicado y las lecturas se realizaron 24 horas después de la transfección. Las barras de error representan SEM (*** indica p & lt; 0,001). (E) El nivel de expresión de miR-126-3p está significativamente asociada inversamente con el nivel de expresión de
Hoteles en SLC7A5 481 papilares muestras de cáncer de tiroides del conjunto de datos TCGA. *** Indica p & lt;. 0.001
miR-126-3p reduce la secreción de VEGF y la formación del tubo endotelial
Dado que nos encontramos la expresión de miR-126-3p es menor en folicular localizada cáncer de tiroides con invasión capsular y vascular, y miR-126-3p ha informado de regular la angiogénesis y destino
VEGF
, a continuación se determinó si el miR-126-3p regula la angiogénesis en células de cáncer de tiroides [17-20] . Se encontró que la sobreexpresión de miR-126-3p disminuyó significativamente la secreción de VEGF en dos de las tres células de cáncer de tiroides
in vitro gratis (Figura 6A). Uno de los principales factores determinantes para el crecimiento del tumor éxito es la capacidad de reclutar nuevos vasos sanguíneos. Por lo tanto, hemos analizado el nivel de expresión de la proteína VEGF en el pulmón los tumores metastásicos de los
in vivo
estudios y la formación del tubo endotelial mediante el ensayo HUVEC
in vitro
.