Extracto
NSCLC (células no pequeñas de cáncer de pulmón) a menudo exhibe resistencia al tratamiento con paclitaxel. La identificación de los elementos que regulan la respuesta paclitaxel avanzará los esfuerzos para superar esta resistencia en la terapia de NSCLC. Con
in vitro
enfoques, hemos demostrado que la sobre expresión del microARN miR-337-3p sensibiliza las células NCI-H1155 a paclitaxel, y mímica que el miR-337-3p tiene un efecto general sobre la respuesta de paclitaxel en el CPNM líneas de células, lo que puede proporcionar una nueva estrategia adyuvante a paclitaxel en el tratamiento de cáncer de pulmón. Mediante la combinación de
in vitro
y
in silico
enfoques, identificamos
STAT3
y
RAP1A
como objetivos directos que median el efecto de miR-337- 3p sobre la sensibilidad a paclitaxel. Investigaciones posteriores mostraron que imitan el miR-337-3p también sensibiliza a las células con docetaxel, otro miembro de la familia de los taxanos, y que los niveles de STAT3 se correlacionó significativamente con la resistencia taxano en líneas celulares de cáncer de pulmón, lo que sugiere que la expresión endógena de STAT3 es un factor determinante de taxano intrínseca resistencia en cáncer de pulmón. La identificación de un miR-337-3p como modulador de la respuesta celular a los taxanos, y
STAT3
y
RAP1A
como objetivos de regulación que median que la respuesta, define una vía de reglamentación novela la modulación de la sensibilidad paclitaxel en células de cáncer de pulmón, que puede proporcionar nuevas estrategias adyuvantes junto con paclitaxel en el tratamiento de cáncer de pulmón y también puede proporcionar biomarcadores para predecir la respuesta paclitaxel en NSCLC
Visto:. Du L, Subauste MC, DeSevo C, Zhao Z, Baker M, Borkowski R, et al. (2012) miR-337-3p y sus Metas
STAT3
y
RAP1A
modulan la sensibilidad taxano en células no pequeñas cánceres de pulmón. PLoS ONE 7 (6): e39167. doi: 10.1371 /journal.pone.0039167
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Febrero, 2012; Aceptado: 17-may de 2012; Publicado: 18 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Du et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Apoyado en parte por cáncer de pulmón SPORE P50 CA70907 (JD Minna), R01 CA129632 (A. Pertsemlidis) del Instituto Nacional del cáncer, y la beca de excelencia académica EDUD-7824-021007-estadounidense (A. Pertsemlidis) de Sun Microsystems. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Hardware de computación de alto rendimiento fue proporcionado por una beca de excelencia académica de Sun Microsystems. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El paclitaxel es un agente de microtúbulos orientación inicialmente aislada de la de coníferas
Taxus brevifolia
- el tejo tiene una larga historia de usos medicinales [1] - y es ampliamente utilizado en el tratamiento de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón. Para el NSCLC, resistencia a paclitaxel es común, con tasas de respuesta que van del 21% al 24% [2], [3]. Los mecanismos para tal resistencia incluyen la sobre expresión de P-glicoproteína, alteraciones en la composición de la tubulina, y las mutaciones en β-tubulina [4], [5], [6], [7]. Un estudio reciente indica que un gran grupo de genes codificantes de proteínas que pertenecen a una amplia gama de clases funcionales es potencialmente implicados en la modulación de la resistencia a paclitaxel en el tratamiento del cáncer [8]. La identificación de los mecanismos que regulan la expresión de genes clave implicados en la resistencia paclitaxel avanzará los esfuerzos para superar esta resistencia en el tratamiento de cáncer de pulmón.
Estamos interesados en la posible participación de los microARN (miARN) en la modulación de la respuesta paclitaxel en el tratamiento del cáncer de pulmón. miRNAs son cortos, de 19 a 23 ARN de nucleótidos que se encuentran en varios organismos que regulan la expresión génica en gran medida por la disminución de los niveles de ARN mensajero diana [9], [10] y se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la regulación de una amplia variedad de procesos patológicos, incluyendo la patogénesis del cáncer. los niveles de miRNA se pueden manipular fácilmente usando moléculas de ARN sintéticos. A, molécula de ARN de cadena simple químicamente estabilizada complementaria a una miARN objetivo actúa como un inhibidor y disminuye los niveles endógenos de los genes miARN. A la inversa, una molécula de ARN de doble cadena con una hebra idéntico en la secuencia a un miARN maduro actúa como un mimético de la miARN de origen natural y aumenta sus celulares niveles de expresión. Varios estudios han explorado los efectos terapéuticos de imita e inhibidores de miARN y demostrado el potencial de estas clases de oligonucleótidos como agentes terapéuticos [11], [12], [13], [14], [15], [16].
hsa-miR-337 (miR-337) es un locus miARN humano ubicado en el cromosoma 14q32.2. miR-337-3p es altamente expresado en fibroblastos normales inmortalizadas fetales pulmonares (IMR-90), y detectable en células inmortalizadas humanas bronquiales epiteliales (HBECs). La expresión de miR-337-3p en líneas de cáncer de pulmón, sin embargo, es generalmente menor que en líneas de células epiteliales de pulmón normal (Figura S1). predicción Target muestra que miR-337-3p potencialmente regula la expresión de múltiples genes que han sido implicados en la tumorigénesis. Encontramos que el miR-337-3p sensibiliza a las células de cáncer de pulmón al tratamiento con paclitaxel, pero, inesperadamente, no afecta significativamente la viabilidad celular por sí solo. Además, utiliza
in vitro
y
in silico
enfoques para definir los objetivos directos de miR-337-3p que median su efecto sobre la sensibilidad a paclitaxel. También exploramos la relevancia potencial de la mímica de miR-337-3p y sus objetivos en la determinación de la sensibilidad paclitaxel en un gran panel de líneas celulares de cáncer, y de manera preliminar explorado el potencial de miR-337-3p mímica como adyuvante al tratamiento con paclitaxel
in vitro en líneas celulares de cáncer.
Materiales y Métodos
las líneas celulares
las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron del Centro Hamon terapéutica de Oncología de Investigación en UT Southwestern Medical Center. Las líneas que comienzan con "NCI-H" se establecieron en el Instituto Nacional del Cáncer [17], [18]. Las líneas que comienzan con "HCC" y HBECs fueron establecidos por el Centro Hamon Terapéutica de Oncología de Investigación de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center [19]. Todas las líneas celulares de cáncer de pulmón fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal 5% (Atlanta Biologicals,, Lawrenceville, GA). HBECs se cultivaron en medio GIBCO® KSFM suplementado con extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (Life Technologies). Todas las líneas celulares eran ADN huellas digitales usando el 1.2 Sistema GenePrint PowerPlex (Promega, Madison, WI) y se confirmó con las librerías de huellas digitales mantenidos por ATCC y el laboratorio Minna /Gazdar, y la prueba de la contaminación mediante el kit de detección de correo Myco Mycoplasma PCR (Boca Científicas , Boca Raton, FL).
ensayos de viabilidad celular
de sensibilidad de líneas celulares de NSCLC a paclitaxel y docetaxel se midió usando un protocolo estándar como se describe en Zhou et al. [20]. Brevemente, las células se sembraron en formato de 96 pocillos, con paclitaxel añadido en diferentes concentraciones después de 24 h, seguido de incubación con el fármaco durante 96 h. La viabilidad celular se determinó utilizando el CellTiter 96® acuosa Una solución Ensayo de proliferación celular (MTS, Promega). El efecto de miR-337-3p y sus objetivos se determinaron mediante transfección transitoria de cualquiera de miR-337-3p oligos imitan o siRNA dirigidos a genes específicos. En general, las células se inversa-transfectadas con los oligos se indica en el formato de 96 pocillos y se cultivaron durante 72 h, seguido de incubación con fármacos para el adicional 72 h. La viabilidad celular se determinó utilizando el CellTiter 96® Una célula de soluciones acuosas Ensayo de proliferación (MTS, Promega) o la célula CellTiter-Glo luminiscente de viabilidad Ensayo (ATP, Promega).
La citometría de flujo
Las células fueron transfectadas con los oligos se indica en placas de 6 pocillos durante 48 h, seguido de tratamiento con paclitaxel o vehículo para un 16 h adicionales. Ambas células separadas y unidas se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Las células se lavaron una vez con 1X PBS (solución salina tamponada con fosfato) y se fijaron con 1X PBS que contenía EDTA 1 mM y 85% de etanol a 4 ° C. Después de 1 h, las células se recogieron por centrifugación a 1400 rpm durante 5 min a 4 ° C. Las células se resuspendieron en 1X PBS, y se trataron con 50 mg /ml de yoduro de propidio y 100 mg /ml de RNasa A durante 30 minutos a 37 ° C. datos del ciclo celular se recogieron en un 500 flujo Cytomics FC citómetro (Beckman Coulter, Brea, CA), con 20.000 eventos recogidos por muestra. Los datos fueron evaluados usando el software de análisis de datos FlowJo, versión 9.1 (TreeStar, Ashland, Oregón).
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
miARN expresión se midió en un ABI PRISM 7900 Sistema de detección de secuencias utilizando TaqMan® microRNA ensayos (Life Technologies) con la expresión de ARN RNU19 como un control interno para la normalización de la carga de ARN. la expresión de ARNm se midió usando ensayos de expresión de genes con TaqMan® expresión GAPDH mRNA como un control interno. Se obtuvieron los tiempos de ciclo umbral (C
t) y la expresión génica relativa se calculó utilizando el método de tiempo de ciclo comparativa. Se prepararon
Western blots
Los lisados celulares usando tampón NP-40. La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo BCA de Pierce (Thermo Fisher, Rockford, IL). Para la electroforesis, cantidades iguales de lisado celular se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas Immun-Blot PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Las membranas se bloquearon y se sondaron con los siguientes anticuerpos: anti-conejo RAP1A o anti-STAT3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), o de cabra anti-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Santa Cruz Biotechnology) y se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) sustrato (Thermo Fisher). Los cambios relativos en los niveles de proteína se cuantificaron por densitometría usando el software Cantidad Uno (Bio-Rad).
miARN objetivo de predicción
Para identificar los objetivos de regulación de miR-337-3p, se utilizó la miRmate método desarrollado en nuestro laboratorio como se describe anteriormente [21]. En resumen, el método completo recompensas complementariedad en las posiciones 2-8 de los genes miARN (la región de la semilla), los desajustes y las inserciones en el bulbo central en las posiciones 9-11 del miARN, algunos complementariedad en el extremo 3 ', y la composición de secuencia específica a posiciones 1 (a) y 9 (a o C) del miARN, de acuerdo con las conclusiones de Lewis et al. [22].
ensayos de reportero de luciferasa
El segmento de la de tipo salvaje (WT) 3'UTRs que contienen los sitios objetivo previsto de
RAP1A gratis (NM_002884) y
STAT3
(NM_003150) se clonó aguas abajo del ADNc de la luciferasa en PMIR-INFORME (Ambion, Austin, TX), un vector que contiene los dos ADNc de luciferasa y β-galactosidasa bajo el control de los sistemas de promotor /terminador de mamífero separadas. Las construcciones mutantes (
RAP1A
MU y
STAT3
MU) con la posición 3 (2
nd nucleótido en la secuencia de semillas objetivo) cambiado de G a A y la posición 1 (inmediatamente 3 'de la secuencia de semillas) cambió de a a T, se hicieron usando el QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, la Jolla, CA). La actividad de luciferasa y la actividad β-galactosidasa se midieron usando el sistema de ensayo de luciferasa y β-galactosidasa sistema de ensayo (Promega), respectivamente.
expresión de ARNm de perfiles
células NCI-H1155 se transfectaron con miR 337-3p imitador de control sinóptico o negativo. El ARN total se aisló usando mirVana ™ miARN Kit de aislamiento (Ambion), marcado y se hibridó a HumanWG-6 V3 BeadChips expresión (Illumina, San Diego, CA) utilizando protocolos estándar. Las láminas fueron escaneados en una Illumina BeadStation y la intensidad de señal se resumieron mediante BeadStudio v3.3 (iluminación). sustracción de fondo y cuantil normalización se realizaron utilizando el algoritmo MBCB [23].
Correlación de expresión con el contenido motivo 3'UTR
La correlación entre los cambios en la expresión génica inducidos por el miR-337-3p más -expresión y el motivo contenido de sus 3'UTRs se analizó utilizando sylamer (http://www.ebi.ac.uk/enright/sylamer), que calcula los valores p acumulativos y hipergeométricos asociados con pequeñas apariciones de palabras en un orden de puntuación de mayor ss secuencias, en este caso ocurrencias 7-mer en todo el conjunto de RefSeq 3'UTRs, y mediante regresión lineal como se aplica en miReduce [24], [25]. Para estos últimos, cada motivo contenida en la 3'UTRs se considera que contribuya de forma lineal con el perfil de factor de cambio, y miReduce calcula iterativamente los motivos que más contribuyen. El coeficiente de regresión para cada motivo puede ser positivo o negativo, dependiendo de si la interacción da como resultado una supresión o activación de la expresión del gen diana. En el caso de sobre-expresión de los genes miARN, esperamos que los transcritos que contienen motivos complementarios a la secuencia de semillas microRNA a ser reducido en la expresión, por lo que el motivo tendría un coeficiente de regresión negativa.
de fase inversa de la proteína de matriz (RPPA) guía
proteína lisados se prepararon usando tampón de lisis caliente (2% SDS; 0,06 M Tris-Cl, pH 6,8; 5% de glicerol) con inhibidores de proteinasas y de fosfatasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ; Santa Cruz Biotechnology) y β-mercaptoetanol recién añadidos. Los lisados se desnaturalizaron por ebullición durante 5 min con sobrenadantes obtenidos por centrifugación a 13.000 rpm durante 7 min a 4 ° C. Antes de poner en orden las diapositivas, y los lisados de proteínas se filtraron a través de filtros de placas de 96 pocillos con 25 micras de poro membranas (Phenix Research Productos, Candler, Carolina del Norte) para eliminar los agregados. Cantidades iguales de lisados fueron dispuestos por triplicado en ONCYTE® AVID
TM diapositivas de película de nitrocelulosa (Grace Bio-Labs, Bend, Oregon) utilizando un SpotArray
TM24 sistema de impresión de microarrays (PerkinElmer, Waltham, MA) bajo 55-60 % de humedad. Por inmuno-tinción, los portaobjetos fueron incubadas a temperatura ambiente en ReBlot Plus solución suave (Merck Millipore, Billerica, MA) por menos de 7 minutos para relajar la estructura de proteínas y después se lavaron en tampón TBS-T y luego se incubaron en tampón de bloqueo Pierce MAR DEL BLOQUE (Thermo Fisher), se bloquearon con avidina y biotina (Dako, Glostrup, Dinamarca), y se incubó con cualquiera STAT3 (EMD Millipore) o pSTAT3 (S727, Cell Signaling Technology) anticuerpo a 4 ° C durante la noche. a continuación, se lavaron los portaobjetos y se incubaron con anticuerpos biotinilados secundarios (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 30 min seguido de transferencia con Qdot conjugado 655-estreptavidina (Life Technologies) durante 30 min. Las láminas fueron escaneados con un escáner de microarrays ProScanArray (PerkinElmer). los niveles de expresión de proteínas se cuantificaron utilizando el software y normalizado para las diferencias en la carga de proteínas que utilizan señales de manchas de proteínas obtenidas en una diapositiva separada impresa en el mismo lote Sypro Rubí ™ (Life Technologies) MicroVigene ™ (Vigene Tech, Carlisle, MA).
miARN perfiles de expresión de los especímenes tumorales
10-20 micras de espesor de serie de secciones de 249 muestras de NSCLC resecado quirúrgicamente (incluyendo 172 adenocarcinomas y 76 carcinomas de células escamosas) se obtuvieron usando un criostato Leica y se homogeneizaron usando un homogeneizador Omni TH (Omni International, Kennesaw, GA). El ARN total fue aislado utilizando el reactivo TRI (Life Technologies) y se cuantificó usando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Fisher). Se determinó la calidad del ARN en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA):.
Para el análisis de micro ARN, las muestras fueron etiquetadas con el etiquetado completo y miARN Kit Hyb y se hibridan a Agilent microarrays miARN Humano versión 3 chips (Agilent Technologies), que contiene sondas para 866 humana y 89 microRNAs virales humanas basado en miRBase v12.0 (http://microrna.sanger.ac.uk). Las hibridaciones se realizaron en cámaras SureHyb de acero inoxidable (G2534A) a 55 ° C durante 22 h, después de lo cual arreglos fueron lavados y digitalizadas mediante un escáner de microarrays de ADN de Agilent (Agilent Technologies). miARN niveles de expresión se obtuvieron mediante el software de extracción de características (Agilent Technologies) y se procesaron con el paquete de Bioconductor [26] AgiMicroRna para corregir para el fondo, eliminar el control y secuencias no-detectables, y normalizar cuantil y resumir los datos.
resultados
el exceso de expresión de miR-337-3p sensibiliza las células NCI-H1155 con paclitaxel y paclitaxel mejora inducida por G
2 /M detención
para examinar el efecto de miR 337-3p sobre la sensibilidad a paclitaxel en células de cáncer de pulmón, se utilizó miR-337-3p imitador (Dharmacon) para aumentar los niveles de miR-337-3p en células NCI-H1155, una línea celular de cáncer de pulmón caracterizados como moderadamente resistente a paclitaxel en un anterior estudio [8]. Como se muestra en la Figura 1A, miR-337-3p sobre-expresión sensibiliza significativamente las células a tratamiento con paclitaxel, la disminución de la IC
50 - definido como la concentración que conduce a una disminución del 50% de la viabilidad celular - a partir de 27,27 nM (95% CI 25,97-28,90) con control de oligo a 14,60 nM (IC 95% 14,08-15,15) con miR-337-3p imitador (p & lt; 0,0001). A continuación se probó la dependencia de la dosis del efecto de miR-337-3p sobre la sensibilidad a paclitaxel y la viabilidad celular mediante la transfección de células NCI-H1155 con diferentes concentraciones de cualquiera de miR-337-3p oligo imitan o de control, seguido de tratamiento con paclitaxel 16 nM o vehículo. Como se muestra en la Figura 1B, miR-337-3p imitador sensibiliza significativamente células para paclitaxel en relación con el oligo de control en concentraciones tan bajas como 0,5 nM (p = 0,0168), pero no disminuye de manera significativa la viabilidad celular en ausencia de paclitaxel a concentraciones incluso tan alto como 200 nM. A fin de evaluar la regulación de la respuesta paclitaxel por miR-337-3p, hemos examinado el efecto de la inactivación de miR-337-3p sobre la sensibilidad a paclitaxel en células H1155. Como se muestra en la Figura 1C, la inactivación de miR-337-3p por el inhibidor de miR-337-3p disminuye significativamente la respuesta de H1155 a tratamiento con paclitaxel, con la viabilidad celular relativa creciente por 17,81 ± 5,31% (p & lt; 0,0001), en relación con el control oligos.
(a) efecto dependiente de la dosis de paclitaxel sobre la viabilidad celular en presencia o ausencia de miR-337-3p sinóptico. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTS. (*, P & lt; 0,05; **, p & lt; 0,01; ***, p & lt; 0,001; NS, no significativo) (B) La viabilidad celular como una función de la concentración de oligo en presencia o ausencia de paclitaxel. La viabilidad celular se midió utilizando el ensayo de concentración de ATP. (C) Efecto de la caída de miR-337-3p con inhibidor de miR-337-3p (50 nM) sobre la sensibilidad a paclitaxel en células H1155. Se muestra la viabilidad celular relativa en presencia de 16 nM de paclitaxel normalizado para controlar oligos. (****, P & lt; 0,0001) (D) análisis del ciclo celular como una función de la sobreexpresión y paclitaxel tratamiento miR-337-3p. La fracción de células en G
1, S y G
2 fases se estimó utilizando el modelo pragmático Watson, siendo la relación de G
2 a G
1 fracciones de las células tratadas con paclitaxel normalizaron a la observado para las condiciones de control (R = [G
2 /G
1]
paclitaxel /[G
2 /G
1]
portadora).
los taxanos se unen a la subunidad β de la tubulina e inhiben la dinámica normal de desmontaje de los microtúbulos, lo que lleva a los microtúbulos estabilizados y detención prolongada de las células en el G
fase 2 /M del ciclo celular y, finalmente, a la muerte celular [27 ], [28]. Se comparó el efecto de miR-337-3p sobre-expresión en el ciclo celular con o sin tratamiento con paclitaxel, en un punto de tiempo (16 h) antes de la apoptosis inducida por el paclitaxel significativa. Como se muestra en la Figura 1D, en presencia de paclitaxel, imitador miR-337-3p induce una dramática G
2 /M detención, con un normalizado G
2 /G proporción
1 de R = 4,38, en relación con R = 2,48 para el oligo control, R = 2,34 para miR-337-5p mímico, y R = 2,31 para la transfección mock, mientras que miR-337-3p no afecta a la distribución del ciclo celular en ausencia de paclitaxel.
los resultados anteriores indican que el miR-337-3p modula la sensibilidad paclitaxel en células NCI-H1155 por mejorar específicamente la detención celular en el G
2 /M fase del ciclo celular sin afectar significativamente la supervivencia celular por sí solo.
array análisis expresión indica que muchos de los objetivos de predecir miR-337-3p son las reguladas en el ARNm por miR-337-3p sobreexpresión
con el fin de buscar exhaustivamente por la diana genes que median el efecto de miR-337-3p sobre la sensibilidad a paclitaxel de las células NCI-H1155, que perfilan la expresión génica mediante microarrays para identificar las transcripciones que están reguladas por el miR-337-3p sobre-expresión, ya que al aumentar la evidencia muestra que los miRNAs regular la expresión del gen diana a través de la disminución de los niveles de ARNm [29]. La magnitud de miR-337-3p la sobre expresión (Figura 2A) es comparable a las diferencias en la expresión endógena observados en diferentes tejidos y entre IMR-90 fibroblastos de pulmón fetal y HBECs (Figura S1). Como la mayoría de estudios recientes apoyan la complementariedad perfecta entre 7-dores en la región de la semilla (que abarca las posiciones 1-8) de un miARN maduro con secuencias en el 3'UTR del transcrito de ARNm como un determinante crítico de la interacción entre un miARN y un gen diana [30], [31], se evaluó la correlación entre la expresión y el contenido motivo de transcritos de ARNm basado en la ocurrencia de 7-dores en sus 3'UTRs. Como se muestra en la Figura 2B, significativamente más de los 1.211 genes que contienen el 7-mer UAUAGGA complementaria a la secuencia de miR-337-3p semilla - bases de 2-8, que se considera el factor más determinante de los genes miARN: diana de interacción - disminución de la expresión de aumento (p = 1,37 × 10
-2), de los que 32 genes disminuyen ≥2 veces y sólo 3 genes aumentar ≥2 veces (Figura 2D). Por el contrario, aproximadamente el mismo número de los 19.262 genes que no contienen la disminución del 7-mer y el aumento de la expresión. Además, las cifras 2C y 2D muestran que entre los motivos 16.384 7-mer que se producen en la 3'UTRs de transcritos de ARNm humanos, varios son sobre-representadas en los 3'UTRs de genes que disminuyó en las células transfectadas transitoriamente con miR-337-3p imitar con relación a un imitador control negativo (Figura 2C), con sólo 10 motivos que muestra una correlación negativa significativa entre los niveles de expresión de ARNm y su presencia en 3'UTRs (Figura 2D). 5 de los motivos corresponden a la región de la semilla de un miARN conocido (miR-337-3p), incluyendo 1 con motivos correspondiente a las bases de 2-8 y 4 correspondientes a las posiciones 1-7 y 2-7, en consonancia con el trabajo reciente sobre la región de la semilla partidos [30], [31]. Curiosamente, se encontró que un motivo (GUAGGAA) contiene una G: U pares de bases en la posición 7, lo que sugiere que los determinantes de los genes miARN objetivos pueden incluir no-Watson: Crick complementariedad. La Figura 2E muestra que, aunque muchos de los genes diana identificados por los 5 motivos se superponen, los 4 motivos adicionales identificar objetivos únicos. En general, los resultados anteriores muestran que un número significativo de genes que contienen putativo sitios objetivo de miR-337-3p se redujo reguladas por el miR-337-3p a nivel de mRNA y resaltar el valor de una búsqueda exhaustiva de los genes miARN objetivos sobre la base de 7- mer complementariedad de la región de la semilla.
(a) los niveles de expresión de miR-337-3p después de 72 horas de la transfección de las células NCI-H1155 con 50 nM de miR-337-3p mímica según lo medido por QRT-PCR. (B) Histograma de cambios en el nivel de expresión de ARNm como una función de miR-337-3p sobre-expresión. Las barras en negro muestran las frecuencias relativas de registro observada
2 veces los cambios para todos los genes, mientras que las barras en rojo muestran la distribución de los genes con 3'UTRs que contienen al menos un 7-mer correspondiente a la semilla de miR-337-3p región. (C) La trama paisaje importancia para 7-dores en todos los genes, ordenados por el cambio en la expresión, de la mayor parte se redujo a más aumentado, mostrando 7-meros que son altamente enriquecido en los 3'UTRs de genes que han disminuido en la expresión. (D) La correlación entre la expresión del ARNm y el contenido motivo de 3'UTRs inducidos por el miR-337-3p sobre-expresión. Se muestra son: (1) el motivo 7-mer, destacó para mostrar la complementariedad de miR-337-3p, (2) el coeficiente de regresión, (3) el valor de p, (4) el número de genes que contienen el motivo, (5 ) el miARN a la cual corresponde con motivos, con las posiciones de nucleótidos totalmente complementarias a las secuencias resaltados en la columna 1 se indican entre corchetes, y el número de genes que (6) disminución de la expresión o (7) aumento de la expresión por ≥2 veces . En la columna 6, el número de genes que contienen el motivo de la lista, pero no contienen la secuencia diana de semilla de miR-337-3p canónica, se indica entre paréntesis. diagrama de (E) proporcional Venn que muestra la relación entre los genes que disminuyen ≥2 veces en la expresión y que contienen uno o más de los cinco 7-meros correspondientes a las secuencias madura miR-337-3p.
STAT3
y
RAP1A ¿Cuáles son los objetivos directos que median el efecto de miR-337-3p sobre la sensibilidad a paclitaxel
Entre los genes regulados por miR-337-3p ,
RAP1A
y
STAT3
, que están reguladas por el 60% y el 63% en el miR-337-3p sobre-expresión, respectivamente, están ambos prevé que ser blanco directo de miR 337-3p (Figura 3A) y están potencialmente implicados en la regulación de la sensibilidad paclitaxel. Para validar estas interacciones, se construyó vectores informadores de luciferasa que contenían los 3'UTRs de tipo salvaje de
STAT3
y
RAP1A
y los correspondientes 3'UTRs de control con mutaciones en el primer y tercer nucleótidos del objetivo secuencias del sitio (Figura 3A), que han demostrado ser crucial en la interrupción de los genes miARN: interacciones diana [22]. Como se muestra en la Figura 3B, miR-337-3p sobre-expresión disminuyó significativamente la actividad de luciferasa en células que expresan los 3'UTRs de tipo salvaje en comparación con no 3'UTR o mutadas 3'UTRs, lo que demuestra que el miR-337-3p interactúa directamente con específica sitios en los 3'UTRs de
STAT3
y
RAP1A
. La figura 3C muestra que el efecto de miR-337-3p en los niveles de mRNA expresión de los dos genes es, junto con la baja regulación de los niveles endógenos de expresión de proteínas en células H1155. Asimismo, examinó el efecto de la sobreexpresión de miR-337-3p sobre los niveles de STAT3 y Rap1A en H1993, una línea celular de NSCLC que se define como el paclitaxel-resistente, con un indefinido IC
50. Al igual que con las células H1155, miR-337-3p también regula a la baja los niveles de STAT3 y Rap1A en mRNA y los niveles de proteína en las células H1993, como se muestra en la figura 3D. Estos resultados sugieren que el miR-337-3p tiene un efecto regulador general sobre STAT3 y expresión RAP1A en células de cáncer de pulmón
.
(A) miR-337-3p y su interacción con los sitios de destino predicho en
RAP1A Opiniones y
STAT3
. Se muestran las estructuras y las secuencias de los genes miARN: interacciones objetivo de miR-337-3p y la 3'UTRs de
RAP1A
y
STAT3
, y la energía libre predicha de la hibridación. La secuencia de semillas se resalta en rojo. Bases alteradas por mutagénesis dirigida al sitio están subrayados. reportero de ensayo (B) de la luciferasa. células NCI-H1155 fueron co-transfectadas con los oligos indicados y los vectores indicadores de luciferasa. Las actividades de luciferasa y β-galactosidasa se midieron después de 72 h, con la actividad de la luciferasa se normalizó a la ß-galactosidasa actividad. (C) Expresión de
RAP1A
y
STAT3
los niveles de ARNm y de proteína después de 72 h de la transfección de las células NCI-H1155, ya sea con 50 nM de miR-337-3p, 25 nM siRNA dirigidos contra cada uno de los genes o oligos de control negativo. Se demuestran los resultados promedio de QRT-PCR de tres transfecciones independientes e imágenes representativas de Western blot y cuantificación de las intensidades de las bandas. (D)
RAP1A
y
STAT3
ARNm y la expresión de proteínas en células NCI-H1993. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P. & Lt; 0,001
Con el fin de evaluar si
STAT3
y
RAP1A
mediar el efecto de miR-337-3p sobre la sensibilidad a paclitaxel, derribaron cada gen individual y los dos juntos. La Figura 4A muestra que desmontables de
STAT3
y
RAP1A
aumentó la sensibilidad de las células NCI-H1155 a tratamiento con paclitaxel en comparación con los oligos de control, pero no afectó significativamente la supervivencia celular en ausencia de paclitaxel . La combinación de los dos siRNAs en mitad de la concentración conduce a una mayor disminución de la viabilidad celular que el observado con cualquiera de siRNA solo (p = 0,017 para
RAP1A
y p = 0,041 para
STAT3
), lo que sugiere que la caída combinada tiene un efecto sinérgico sobre la respuesta de paclitaxel (Figura 4B). Por otra parte, la figura 4C muestra que desmontables de
STAT3
o
RAP1A
mejora significativamente el G
2 /M detención en virtud de paclitaxel tratamiento en comparación con los oligos de control, con normalizada G
2 /G
1 relaciones de R = 3,02 y R = 3,70, respectivamente, en relación con R = 1,93 para los controles y comparables a R = 4,37 para la transfección con el miR-337-3p mímica.
( a) Efecto de la caída de
RAP1A
y
STAT3
expresión de siRNA sobre la viabilidad celular en presencia y ausencia de paclitaxel. Se muestra en rojo es la viabilidad celular en 16 nM de paclitaxel normalizado a la viabilidad de soporte en función de concentraciones crecientes de siRNAs contra el
RAP1A
o
STAT3
. Se muestra en negro es la viabilidad celular en ausencia de paclitaxel. (B) Efecto de la caída combinada de
RAP1A
y
STAT3
sobre la sensibilidad a paclitaxel. Se muestra la viabilidad celular relativa en presencia 16 nM paclitaxel normalizado para controlar oligos. (C) Derribo de STAT3 y RAP1A mejora paclitaxel inducida G
2 /M detención, medida por citometría de flujo. La relación (R) de la G
2 a G
1 fracciones inducidos por el tratamiento paclitaxel se determinó como anteriormente. (D) viabilidad celular como una función de la concentración de oligo (miR-337-3p imitador control de imitar o negativa) en presencia de cucurbitacina. *, P & lt;. 0.05
aumento de la evidencia apoya la aplicación de inhibidores de STAT3, como cucurbitacina, como agentes terapéuticos en el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Por lo tanto, a prueba el efecto de miR-337-3p sobre-expresión de la respuesta de las células NCI-H1155 con el tratamiento con cucurbitacina, la citotoxicidad de la que se basa al menos parcialmente en la inhibición de la actividad STAT3 [32], [33]. Como se muestra en la Figura 4D, imitan el miR-337-3p sensibiliza a las células a cucurbitacina, la disminución de la IC
50 desde 1,14 M (IC 95% 1.3 a 1.28) a 0,37 mM (IC del 95% 0,33 a 0,42) (p & lt; 0,0001), lo que indica que la orientación tanto
STAT3
expresión mímica con la activación de STAT3 y miR-337-3p con cucurbitacina tiene un efecto sinérgico sobre la supervivencia de las células cancerosas, y sugiriendo que el miR-337-3p también puede servir como un adyuvante a los inhibidores de STAT3.
miR-337-3p sensibiliza las dos líneas celulares paclitaxel-sensibles y resistentes a paclitaxel, así como los procedentes de diferentes subtipos histológicos
con el fin de probar la generalidad del efecto de