Extracto
Antecedentes
microRNAs (miRNAs) juegan un papel crítico en la tumorigénesis, ya sea como un supresor de tumores o como un miARN oncogénico, en función de los diferentes tipos de tumores. Hasta la fecha, los científicos han obtenido una cantidad considerable de conocimientos con respecto a miRNAs en el cáncer de páncreas. Sin embargo, la expresión y función de miR-371-5p en el cáncer de páncreas no ha sido claramente dilucidado. El objetivo de este estudio fue investigar los papeles de miR-371-5p en el cáncer de páncreas y su asociación con la supervivencia de pacientes con cáncer de páncreas.
Métodos
La expresión de miR-371 -5p se examinó en el adenocarcinoma del conducto pancreático (PDAC) y sus tejidos adyacentes normales de páncreas (ANPT) o en líneas celulares de cáncer pancreático por QRT-PCR. Se determinó la asociación de la expresión de miR-371-5p con la supervivencia global. La proliferación y apoptosis de SW-1990 y células Panc-1, transfectadas con imita o inhibidor de miR-371-5p, se evaluaron mediante el ensayo de MTT y citometría de flujo, respectivamente. La tumorigenicidad se evaluó a través de experimentos de xenoinjerto en ratones. interacciones promotor de miR-371-5p se analizaron mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP). La expresión de proteínas se analizó por Western blot.
Resultados
El nivel de expresión de miR-371-5p se reguló de manera espectacular en los tejidos PDAC clínicos en comparación con ANPT. Los pacientes con expresión de miR-371-5p alta tuvieron una supervivencia significativamente menor que aquellos con baja expresión de miR-371-5p. La in vitro y en ensayos in vivo mostraron que la sobreexpresión de miR-371-5p resultó en la proliferación celular y el aumento de crecimiento del tumor, que se asoció con el inhibidor del crecimiento 1 downregulation (ING1). Curiosamente, también se encontró que ING1, a su vez, inhibe la expresión de miR-371-5p en la región promotora.
Conclusiones
Nuestro estudio demuestra una novela ING1-miR-371-5p reglamentario bucle de retroalimentación, que puede tener un papel crítico en PDAC. Por lo tanto miR-371-5p puede llegar a ser un factor pronóstico novedoso y diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de páncreas
Visto:. Él D, Miao H, Xu Y, Xiong L, Wang Y, Xiang H, et al . (2014) miR-371-5p Facilita la proliferación de células de cáncer de páncreas y disminuye la supervivencia del paciente. PLoS ONE 9 (11): e112930. doi: 10.1371 /journal.pone.0112930
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 10 de julio de 2014; Aceptado: 16 de octubre de 2014; Publicado: noviembre 20, 2014
Derechos de Autor © 2014 He et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por donación de la Innovación de Ciencia y TechnologyCommission de Shenzhen Municipio (núm JCYJ20140414103937769). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, DataCollection y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
PDAC es un fenotipo altamente maligno que se caracteriza por una rápida progresión, metástasis temprana y una respuesta limitada a la radioterapia y la quimioterapia. A pesar de más de 10 años de regímenes terapéuticos aprobados por la FDA y grandes mejoras en la atención médica, se ha observado ningún efecto significativo sobre la supervivencia de los pacientes PDAC [1]. Ahora bien, es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con cáncer en los EE.UU., con una tasa de supervivencia a 5 años del 5% al año [2]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar marcadores biológicos que promuevan el diagnóstico precoz y permitir estrategias de tratamiento personalizadas para pacientes con alto riesgo de PDAC.
El desarrollo y la progresión de la PDAC son un proceso complejo, que implica la desregulación de múltiples los genes que son esenciales para los procesos biológicos de la célula. Los factores de transcripción (TFS) y miRNAs son reguladores importantes para la expresión de genes [3]. En los últimos 10 años, los miRNAs son particularmente importantes en casi todos los estudios sobre el desarrollo del tumor, ya que pueden ser objeto de lesiones genómicas, controlados por señales tumorales clásicos, y ellos mismos se presente como una clase de oncogenes o supresores tumorales [4]. Recientemente, se han sugerido miRNAs estar estrechamente asociada con la tumorigénesis PDAC [5]
miRNAs son pequeñas (21 a 24 nt) no codificante moléculas de ARN que regulan la expresión génica mediante la unión de secuencias complementarias sin apretar en el 3 '. región no traducida de los ARNm diana para reprimir la traducción o inducir mRNA división [6]. El descubrimiento de miRNAs ha arrojado nuevas perspectivas en cuanto a la regulación de la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la senescencia, y también ha contribuido a que el manejo del paciente, incluyendo el diagnóstico y tratamiento [7].
Aunque estudios previos han aclarado las funciones de muchos miRNAs en el cáncer de páncreas [8], ningún estudio ha abordado el papel de miR-371-5p. Estudios recientes demostraron que miR-371-5p fue significativamente elevado en el cáncer gástrico (GC) de los pacientes y carcinoma hepatocelular regulado (HCC) la proliferación celular mediante la aceleración de la transición G1 /S [9], [10]. Sobre todo, una mayor validación indica que el suero de miR-371-5p, como un nuevo marcador biológico, tenía un fuerte potencial para discriminar pacientes GC de controles sanos [9]. Por lo tanto, la hipótesis de que miR-371-5p también puede ser un nuevo mecanismo que contribuye a un mayor riesgo PDAC por perturbar la progresión del ciclo celular a través de la orientación genes relacionados con el ciclo de células. Para abordar esta cuestión, se compararon los perfiles de expresión de miR-371-5p entre los tejidos PDAC y ANPT. Nosotros aquí muestran que la expresión de miR-371-5p se upregulated significativamente en los tejidos en comparación con los PDAC ANPT, lo que resultó en la proliferación celular y el aumento de crecimiento del tumor. Por lo tanto, el miR-371-5p puede llegar a ser un factor pronóstico novedoso y diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Las líneas celulares PDAC SW-1990 y Panc-1 se obtuvieron del Centro chino para el Type Culture Collection (Shanghai, china). Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos (100 U /ml de penicilina y 100 mg de sulfato de estreptomicina /ml). Las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C suplementado con 5% de CO2.
proliferación de las células de ensayo
MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-diphenyltetrazoliumbr-omide] - ensayo basado se realizó para estimar el efecto de miR-371-5p sobre la proliferación celular PDAC. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (5.000 células /pocillo en 200 l de medio) y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO
2. PDAC células fueron transfectadas con el miR-NC, miR-371-5p, miR-control, anti-miR-371-5p, NC-siRNA o ING1-siRNA utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Life Technologies) para 1, 2, 3 y 4 día, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células cultivadas con medio completo se utilizaron como control en blanco. Al final del cultivo, 20 l de 5 mg /ml de MTT (Sigma, EE.UU.) se añadió una solución por pocillo, y se incubaron las células durante otras 4 horas a 37 ° C. Los sobrenadantes fueron retirados y cristales de formazán se disolvieron en 150 ml de dimetilsulfóxido (Sigma, EE.UU.). Por último, se determinó la densidad óptica a 490 nm usando el sistema de ensayo de múltiples microplacas (polarstar OPTIMA, Alemania). En cada ensayo, se hicieron cinco pocillos paralelos, y los resultados se recogen como la media de más de tres experimentos independientes. Los lisados se recogieron para el análisis de transferencia Western.
análisis del ciclo celular
Para analizar el ciclo celular, se analizó el contenido de ADN por duplicado utilizando el software FACSort Cellquect (BD Biosciences, EE.UU.). Las células PDAC se colocaron en placas de 6 pocillos durante la noche y se transfectaron con el miR-NC, miR-371-5p, el miR-con, anti-miR-371-5p, NC-siRNA, o ING1-siRNA durante 48 horas, respectivamente.
al final del cultivo, las células fueron fijadas en etanol al 75% enfriado con hielo durante la noche a 4 ° C. Las células fijadas se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI) que contiene 50 mg /ml de RNasa A (DNasa libre) durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad y se analizaron por fluorescencia de células activadas por la clasificación (Becton Dickinson, EE.UU.). Las células se excitaron a 488 nm y la emisión se recogieron a través de un filtro de 630 nm. En total, se recogieron 20.000 células de cada muestra. La distribución del ciclo celular se evaluó mediante el cálculo de la proporción de células en G1 /S, y G2 fases G0 /M. En cada experimento independiente, se realizaron tres pocillos paralelos, y los procedimientos se llevaron a cabo por triplicado. Los datos obtenidos se presentan como media ± desviación estándar.
ensayos de reportero de luciferasa
En pocas palabras, los fragmentos de la región no traducida 3 '(3'-UTR) de ING1 ARNm contiene el putativo (WT) eran amplificada por PCR a partir de ADN genómico, y el producto de PCR se subclonó en un vector de control pGL3 (Promega, EE.UU.) inmediatamente aguas abajo del gen de la luciferasa. Para construir mutantes pGL3-ING1 (MU), se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene) para inducir seis mutaciones puntuales en la región UTR de WT-pGL3-ING1. El ADN del plásmido fue secuenciado para confirmar su autenticidad.
Para el ensayo indicador de luciferasa, las células se cotransfectaron con 300 ng de construcciones pGL3-ING1-Mut pGL3-ING1-WT o y pcDNA3-miR-371-5p o un control negativo utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada muestra se cotransfectaron con 50 ng de pRL-TK plásmido que expresa la luciferasa de Renilla (Promega, EE.UU.). Las células se recogieron 48 h después de la transfección y se analizaron usando el Dual Luciferase-Reporter Assay System (Promega, EE.UU.). mediciones relativas de luciferasa se realizaron 48 horas después de la transfección usando el Dual Luciferase reportero sistema de ensayo (Promega, EE.UU.) utilizando un contador de luminiscencia. Las transfecciones se realizaron por duplicado y se repitieron al menos 3 veces en experimentos independientes. MIR-371-5p inhibidor, siING1 y sus controles negativos (NC) fueron adquiridos de Panagene Inc (Corea) y Santa Cruz (EE.UU.), respectivamente. Las secuencias fueron los siguientes: inhibidor de miR-371-5p: 5'-TTTTAACATTGCACT-3 '. Ad-ING1 adenovirus (Cat #: 1601) y su Ad-GFP control de adenovirus (Cat #: 1700) fueron adquiridos de Biolabs vector (USA) guía
RT-PCR cuantitativa
El ARN total. se aisló utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). 2 g ARN totales fueron transcritas invertir utilizando los miR-371-5p cebadores de transcripción inversa específicos (Ribobio, China) usando polimerasa poli-A primer capítulo de síntesis kit (Takara Bio, Japón) siguiendo el protocolo del fabricante basan, y la expresión relativa de miR-371-5p se determinó utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, china). U6 snRNA se utilizó para la normalización. El método delta-Ct se utilizó para evaluar los análisis de los datos de PCR en tiempo real. En semi-cuantitativos RT-PCR, los productos de PCR finales después se sometieron a electroforesis cierto número de ciclos en geles de agarosa al 2% seguido por tinción con bromuro de etidio y se fotografió con transiluminación UV. Los cebadores para miR-371-5p: imprimación RT, 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC-3 '; Adelante, 5'-GTCGTATCCAGTGCAGCCG-CCACTCAAACTGTGGGG-3 '. Los cebadores para U6 snRNA: cebador RT, 5'-GGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAAT-ATGG-3 '; Adelante, 5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3 '.
ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
ING1 vinculante para el promotor de miR-371-5p se puso a prueba utilizando el análisis de chip. chip de ensayo se realizó utilizando el kit EZ-chip de Millipore (Millipore, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, aproximadamente 3 × 10
6 Panc-1, ya sea infectada con adenovirus Ad-GFP Ad-GFP-ING1 o fueron reticulado usando 1% de formaldehído (Bio-Rad, EE.UU.) durante 15 minutos a 37 ° C. Las células se recogieron después del temple con 0,125 M de glicina y se lisaron en tampón de chip de lisis (NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, Tris 50 mM (pH 8,0), 0,1% de desoxicolato, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, 1 mg /ml de pepstatina, 1 mg /ml de aprotinina y 1 mg /ml de leupeptina). Los extractos se sometieron a ultrasonidos seis veces durante 9 s cada uno y lisados se centrifugó mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 20 min a 4 ° C. De esta muestra, 150 l se utilizó como entrada. Los sobrenadantes se immunoprecipiated ya sea con anti-ING1 o con IgG de ratón (control negativo) a 4 ° C durante 4 h, seguido de proteína G Sepharose (Sigma, EE.UU.) durante 2 horas a 4 ° C. Los inmunoprecipitados se lavaron secuencialmente con 1 ml de tampón de lisis ChIP dos veces, tampón de lisis chip con NaCl 500 mM dos veces y con LiCl /solución de detergente (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, LiCl 250 mM, 0,5% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, EDTA 1 mM) dos veces y, finalmente, con tampón TE (Tris 10 mM y EDTA 1 mM, pH 8,0). Las perlas se eluyeron usando 1% de SDS y una solución de bicarbonato de sodio 0,1 M. La entrada y las muestras eluyentes fueron inversa reticulado usando NaCl durante 5 horas a 65 ° C. El ADN de las muestras se aisló mediante fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol. Promotor de unión se ensayó mediante PCR utilizando cebadores que abarcan las regiones aguas arriba de miR-371-5p empezar sitios, secuencias de cebadores: chip-ING1, F: 5'-AATGTTCACTGCCGCACTGT-3 '; R: 5'-ACACCTATAATCCCTGC- TAC-3 '; Chip-neg-F: 5'-ACGGCCAACATGCTCAGG-3 '; R: 5'-TGTTTGCAACTGCTGCGTTAG-3 '
Western blot
Las células se lisaron con 1% tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 50, pH cloruro de sodio mM 8.0,150, 1. % NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio, EDTA 2 mM) que contiene 1 x cóctel de inhibidor de proteasa (Roche) 48 h después de la transfección. Se recogieron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteína usando el kit de ensayo BCA (Pierce). Las muestras de proteína se separaron en 10% SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5%, seguido de una incubación durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo de conejo primario indicado. La membrana se lavó tres veces en TBST y después se incubó con un anticuerpo secundario. Por último, el anticuerpo unido se detectó por quimioluminiscencia con el reactivo de detección ECL (Pierce). Los datos se normalizaron a GAPDH o β-actina.
En vivo
cáncer de páncreas modelo de xenoinjerto
Panc-1 células de PDAC moderadamente diferenciado fueron transfectadas de forma estable con el miR-371 -5p o miR-NC plásmido de control. Se recogieron las células transfectadas, se suspendió en 200 l de PBS (1 × 10
7 células), y se inyecta por vía subcutánea, en 4 semanas de edad, macho BALB /c ratones desnudos (
n
= 10 /grupo) . Los ratones se mantuvieron en un entorno específico libre de patógenos durante 5 semanas y luego se sacrificaron. El volumen del tumor
V
se calculó usando su longitud
L
y anchura
W
, de acuerdo con la ecuación
V
= 0,4
LW
2. El uso de ratones desnudos cumplido con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el estudio fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad Médica del Sur.
Pacientes y tejidos tumorales
se obtuvieron un total de 60 tejidos humanos de cáncer de páncreas (CP) y los tejidos normales emparejados adyacentes pancreáticas (NP) durante la cirugía en el hospital Baoan (Shenzhen, china) entre enero de 2008 y diciembre de 2010. el diagnóstico se basa en la evidencia patológica. Además, otros 15 pares de PDAC y sus muestras de control se obtuvieron de los pacientes durante las resecciones quirúrgicas y almacenadas en nitrógeno líquido. Todos los 75 pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de sus tejidos y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica del Sur.
El análisis estadístico
Las asociaciones de miR-371ºC- 5p expresión con las características patológicas clínicas empleando las pruebas de Chi-cuadrado o de Mann-Whitney. La curva de supervivencia se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Los grupos se compararon usando de Student
t-test
. El análisis de correlación se realizó mediante análisis de correlación de Spearman. Todos los valores de probabilidad se analizaron mediante una prueba de dos colas, y la significación estadística se concluyó a
* P & lt; 0,05,
** P & lt; 0,01,
*** P & lt; 0,001;#Representa ninguna significación estadística. Los análisis se realizaron con el programa SPSS (versión 17.0) software (SPSS Inc., EE.UU.). Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar (SD).
Resultados
Regulación al alza de miR-371-5p en tejidos de cáncer de páncreas se asocia con una supervivencia
Para determinar el los niveles de expresión de miR-371-5p en pacientes con cáncer de páncreas, se detectó el miR-371-5p en todos los 15 pares de tejidos de cáncer de páncreas y sus tejidos pancreáticos no cancerosos emparejados utilizando un método QRT-PCR. Como se muestra en la figura 1A, los tejidos de PC mostraron significativamente mayor expresión de miR-371-5p en comparación con la de los tejidos NP (
P
& lt; 0,05). Por otra parte, el análisis de supervivencia Kapan-Meier reveló que los pacientes con una expresión positiva de miR-371-5p (figura 1B) tenían un pronóstico significativamente peor que aquellos con una expresión negativa (figura 1C). El análisis de regresión de Cox indicó que la expresión de miR-371-5p (cociente de riesgos [HR] = 2,748, 95% intervalo de confianza [IC] = 1,211 a 5,914, P = 0,03), fue factores pronósticos independientes para la supervivencia global.
(a) nivel medio de expresión de miR-371-5p en especímenes humanos PDAC (
n
= 15) y tejidos pancreáticos normales (
n
= 15). miARN abundancia se evaluó mediante qRT-PCR y normalizado a ARN U6. Los valores se presentan como la media ± S.D. (B y C) miR-371-5p niveles de expresión y la supervivencia global después de la resección del cáncer pancreático con el miR-371-5p -negativo frente a los grupos -positivas miR-371-5p. El MIR-371-5p - positiva del grupo tuvieron una supervivencia significativamente más corto que el miR-371-5p -. Grupo negativo (n = 30 /grupo,
P = 0,021
) guía empresas
MIR-371-5p promovió la proliferación celular tanto
in vitro
y
in vivo
Para explorar el efecto de miR-371-5p el páncreas crecimiento de células cancerosas, el PDAC líneas celulares con diferentes grados SW-1990 y Panc-1 fueron transfectadas transitoriamente con una mímica o inhibidor (anti-miR-371-5p) miR-317-5p y sus respectivos Comités Nacionales. El análisis qRT-PCR mostró que los imita miR-371-5p causaron un aumento 14,42 y 6,47 veces en la expresión de miR-371-5p en PANC-1 y las células SW-1990, respectivamente (figura 2A). Mientras tanto, el anti-miR-371-5p disminuyó la expresión de miR-371-5p por 3.14 y 3.28 pliegues en células SW-1990 PANC-1 y, respectivamente, en comparación con las líneas de células de control (figura 2b). El ensayo de proliferación de MTT se realizó en SW-1990 y Panc-1 en las células que fueron transfectadas transitoriamente con una mímica o el inhibidor de miR-371-5p. Los resultados mostraron que -mimics miR-371-5p promueven el crecimiento de células tumorales, mientras que el crecimiento de células tumorales inhibidas anti-miR-371-5p (P & lt; 0,01, Fig.2C y D) Para investigar el mecanismo por el cual anti-miR 371-5 inhibe la proliferación celular, se analizó la distribución del ciclo celular de las células Panc-1 y SW-1990 que fueron transfectadas con anti-miR-371-5p y el control. Una mayor proporción de células transfectadas con el anti-miR-371-5p acumulado en la fase G1, mientras que la población fase S disminuyó (Fig.2E). Sin embargo, se observó un resultado contrario en las células transfectadas con el miR-371-5p (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la inhibición de proliferación de anti-miR-371-5p fue en parte debido a una interrupción de la fase G1 de las dos líneas celulares de cáncer de páncreas.
(A y B) El nivel de expresión de miR-371 -5p se puso a prueba durante 48 h en células de cáncer de páncreas transfectadas con imita el miR-371-5p, anti-miR-371-5p y su respectivo control (Carolina del Norte, 40 nM) por QRT-PCR. (C y D) La proliferación de líneas celulares transfectadas transitoriamente con PDAC imita el miR-371-5p, miR-371-5p inhibidor o de control se analizó mediante el ensayo de proliferación de MTT. (E) anti-miR-371-5p aumenta la proporción de células en G1 según lo estimado por citometría de flujo (panel de la izquierda, **
P Hotel & lt; 0,01, n = 4). Y Histografías representante del ciclo celular (anti-miR-NC vs anti-miR-371-5p) se presentan (panel derecho). (F) Los ratones desnudos fueron inoculados por vía subcutánea con células Panc-1 transfectadas con el miR-371-5p plásmido o miR-NC plásmido de control, en sus flancos. La imagen puede no coincidir con tumores formados en 10 ratones. (G) Curvas de crecimiento de los volúmenes tumorales. La gráfica es representativa del crecimiento del tumor, 5 semanas después de la inoculación. El volumen del tumor se calculó y todos los datos se muestran como la media ± S. D. (
n
= 10).
A fin de determinar si el miR-371-5p estuvo implicado en la génesis tumoral, una línea celular de la línea celular -overexpression miR-371-5p y un control estable se inyectaron por vía subcutánea en los ratones desnudos, y a su vez, se midió la actividad de crecimiento de tumor. Cuando se recogieron los tumores, el volumen medio de los tumores derivados del grupo miR-371-5p era más grande en comparación con el grupo control (Fig.2F y G,
P
& lt; 0,05). Estos resultados fueron consistentes con los efectos de la sobreexpresión de miR-371-5p in vitro y sugiere fuertemente que el miR-371-5p podría promover la proliferación de células PDAC.
ING1 es un objetivo directo de miR-371-5p y que participan en la inducción de miR-371-5p promoción de la proliferación de células PDAC
para explorar el potencial objetivo por el que el miR-371-5p promueve la proliferación de células de cáncer de páncreas, nos aprovechamos de la bioinformática para predecir el putativo objetivos de miR-371-5p. Ambos sistemas de escaneo y Miranda prevista del blanco ING1, un supresor tumoral clave, siendo un objetivo putativo de miR-371-5p. Para verificar si el miR-371-5p destinadas directamente ARNm miR-371-5p en tumores PDAC y líneas celulares, in vitro e in silico análisis se llevaron a cabo. En primer lugar, el control anti-miR-371-5p o se transfectó en células SW-1990 y Panc-1, y se encontró que inhibe la expresión de miR-371-5p aumentó los niveles de proteína ING1 en ambas líneas (Fig. 3A). Entonces, el miR-371-5p mímica o el control se transfectó en las líneas celulares anteriores 2. Se encontró que la expresión forzada de miR-371-5p disminución de los niveles de proteína ING1 en ambas líneas celulares consistentemente (Fig. 3A). Estos resultados indicaron que el miR-371-5p podría promover la proliferación de células PDAC con la disminución de la expresión ING1 in vitro.
(A) expresión ING1 en SW-1990 y células Panc-1 después de la transfección con anticuerpos anti-MIR imita -371-5p, o miR-371-5p, o el control detectada por Western Blot. (B-I) ING1 fue detectado por QRTPCR en tejidos de cáncer de páncreas 50 (PC) y fue emparejado los tejidos pancreáticos no cancerosas adyacentes (NP). La abundancia ING1 se normalizó en contra GAPDH. (B-II) La relación entre ING1 y la expresión de miR-371-5p fue explorada por la correlación de Spearman en 50 tejidos PDAC. ING1 expresión se correlacionó negativamente con el miR-50 371-5p en los tejidos tumorales PDAC. (C) pronosticó el emparejamiento consecuencia de la meta región 3'-UTR de ING1 (de tipo salvaje o mutado) y la secuencia madura de miR-371-5p. La actividad de luciferasa en la presencia de ambos de tipo salvaje ING1 3'-UTR o mutante y miR-371-5p se comparó con el control. (D) de transferencia de Western se realizó para analizar la expresión ING1 en si ING1 transfectadas células Panc-1. β-actina se utilizó como control interno cuantitativo. (E) Efecto de siING1 sobre la proliferación celular se midió por el ensayo de MTS. (F) Panc-1 células fueron transfectadas con NC, miR-371-5p inhibidor o inhibidores se llevó a cabo el miR-371-5p y siING1, y luego ensayo MTS.
Para confirmar aún más la relación regulatoria entre miR-371-5p y ING1, se analizó la expresión de ING1 en PDAC muestras (PC) y sus correspondientes tejidos normales (NP). Uso de QRT-PCR, se encontró que el nivel medio de expresión ING1 fue significativamente menor en los tejidos de PC en comparación con la de los tejidos NP (Fig. 3B-I). Se observó una correlación inversa significativa entre ING1 y expresiones miR-371-5p en tejidos de cáncer de páncreas (correlación de Spearman, r = -0.4802) y los tejidos no cancerosos adyacentes (r = -0.4103, datos no mostrados) (Fig. 3B-II).
para evaluar la capacidad de unirse a la 3'UTR de ING1 miR-371-5p, se realizó un ensayo indicador de luciferasa y se observó una disminución significativa en la actividad de la luciferasa en presencia de miR-371-5p - ING1 en células SW-1990, en comparación con los controles (Fig. 3C). Para validar si ING1 era un objetivo directo de miR-371-5p, la mutación de los sitios en el 3'UTR de ING1 unión de miR-371-5p y observamos la pérdida de la represión (Fig. 3C). Tomados en conjunto, los datos sugieren que ING1 era un objetivo directo de miR-371-5p.
Para dilucidar si el efecto promotor del crecimiento de miR-371-5p fue mediada por la represión de ING1 en las células PDAC, la se examinó el efecto de ING1 sobre el crecimiento celular. En primer lugar, las células Panc-1 fueron transfectadas con siRNA contra ING1 o su control, y luego examinaron el crecimiento celular mediante el ensayo de MTT (Fig. 3D). los resultados del ensayo MTT demostraron que el silenciamiento de genes de ING1 promovió la proliferación de células de Panc-1 células (Fig.3E). Por otra parte, el efecto inhibidor del inhibidor de miR-371-5p sobre el crecimiento celular se invirtió cuando la expresión ING1 se desmontables (Fig.3F). Tomados en conjunto, estos resultados indican que ING1 es un objetivo importante funcionalmente de miR-371-5p que está implicado en la proliferación de células PDAC.
ING1b regula la expresión de miR-371-5p
La ING familia de tipo II supresores de tumores servir como lectores '' epigenéticos y el objetivo de la histona acetil transferasa (HAT) y la histona deacetilasa (HDAC) "escritores" del código de histonas epigenética [11]. La proteína ING1 también ha sido implicado en la regulación de los niveles de miARN [12]. Para identificar si ING1 regula la expresión de miR-371-5p, las células Panc-1 fueron infectadas con adenovirus que expresan GFP solo o con adenovirus que expresan tanto GFP y ING1. MIR-371-5p se confirmó a disminuir de manera significativa y reproducible en respuesta a la sobreexpresión ING1 (figura 4A). Además, como se muestra en la figura 4B, suberoilanilida del ácido hidroxámico (SAHA), una histona desacetilasa (HDAC) inhibidor, el aumento de expresión de miR-371-5p significativamente en células Panc-1, que es coherente con la regulación epigenética por ING1 como parte de HDAC1 y HDAC2 complejos. Sin embargo, SAHA no cambió la expresión ING1. Chip análisis de ING1 mostró que ING1 une a la región del promotor de miR-371-5p (figura 4c), lo que indica que ING1 regula directamente la expresión de miR-371-5p. Por lo tanto, ING1 regula la expresión de miR-epigenetically 371-5p en PDAC.
(A) La expresión de miR-371-5p en células Panc-1 en respuesta a la sobreexpresión ING1 durante 48 hs, se determinó mediante real para la cuantificación los ensayos de PCR. -time (panel superior barras representan la media ± SD (**
P Hotel & lt;.. 0,01, n = 5) (panel inferior) Western blot se realizó para analizar la expresión ING1 (B) MIR nivel -371-5p se determinó utilizando en tiempo real RT-PCR en células Panc-1 en respuesta al tratamiento con el ácido hidroxámico suberoilanilida inhibidor de HDAC (SAHA). las barras representan la media ± SD (panel superior, *
P
& lt; 0,05, n = 5) (panel inferior) de transferencia de Western se realizó para analizar la expresión ING1 (C) las células infectadas con adenovirus de control GFP o con el mismo virus que también codifica ING1 se recogieron 24 h más tarde y se preparó para el chip.. análisis utilizando anticuerpos de control o ING1. PCR de los productos de inmunoprecipitación mostraron que ING1 une a la región aguas arriba de miR-371-5p.
Discusión
Una completa comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen la iniciación del tumor de páncreas y la progresión es importante que los enfoques pronósticas y terapéuticas novedosas dirigidas a mejorar el resultado de pacientes con cáncer. En los últimos años, los miRNAs están emergiendo como una nueva clase de reguladores de genes implicados en diferentes tumores [13]. Aquí, nos proporcionan la primera evidencia de que el miR-371-5p juega un papel crítico en la tumorigénesis pancreática. Con frecuencia está regulada positivamente en PDAC. Por ello, la sobreexpresión de miR-371-5p se asocia fuertemente con la supervivencia de los pacientes negativos, lo que sugiere que se trata de un factor de mal pronóstico. La relación positiva entre los niveles de miR-371-5p con la proliferación apoya la noción de que actúa como un onco-miARN.
Las características observadas en los pacientes con PDAC se recapitulan en modelos de xenoinjertos de ratón. células miR-371-5p sobreexpresan desarrollan tumores de gran tamaño, que son revertidos mediante inyecciones de un inhibidor específico contra ella. Un comportamiento opuesto se observó con las células que expresan bajos-miR-371-5p y la inyección del ARN mímica correspondiente. Hasta la fecha, el miR-371-5p se ha mostrado de participar sólo en los carcinomas hepatocelulares, lo que indica que su sobreexpresión se asocia con tumores más agresivos y un peor resultado [14], de acuerdo con los datos obtenidos en PDAC. Sin embargo, la contribución de miR-371-5p a este proceso necesita más investigaciones.
Nuestra comprensión de las funciones biológicas de los genes miARN se basa en la identificación de genes diana pertinentes. Sin embargo, la predicción de genes miARN objetivos sigue siendo un área de investigación desafiante. La mayoría de los genes miARN-secuencia diana correspondiente se basa en la complementariedad imperfecta del miRNA con el extremo 3 'UTRs de los ARNm diana. El requisito de complementariedad de sólo siete u ocho nucleótidos podría resultar en cientos de posibles objetivos [15]. Hasta ahora, muy pocos genes diana de miR-371-5p han sido confirmados en diferentes sistemas biológicos.
Aquí, validar ING1 como un objetivo funcional directa de miR-371-5p en PDAC, añadiendo información previamente tipos de células informado [16]. La familia de tipo II ING supresores de tumores contribuye al crecimiento de diversos tumores [17]. Esta familia está bien conservada e incluye cinco genes. Entre ellos,
ING1
es el miembro mejor caracterizado y codifica cuatro isoformas de la proteína [18]. La familia de ING supresores de tumores actúa como lectores y escritores de la histona código epigenético, que afectan a la reparación del ADN, remodelación de la cromatina, la senescencia celular, la regulación del ciclo celular y la apoptosis [18]. La sobreexpresión de ING1 causó la detención del ciclo celular en la fase G1 con subsiguiente apoptosis, mientras que la supresión de su formación de colonias foco aumento de la expresión y el crecimiento
vitro
y tumor formación en
in vivo
[19]. Sin embargo, los mecanismos moleculares detallados por el cual ING1 actúa como un supresor de tumores permanecen incompletamente definidas.
ING1 regula la expresión génica a través de la regulación de la acetilación de histonas y la metilación [20]. ING1 es el principal objetivo del inhibidor de HDAC SAHA, y parece regular principalmente compactación de la cromatina y, posteriormente, la expresión de subconjuntos de genes a través de mecanismos epigenéticos. Además, se ha informado de muchos miRNAs estar regulada por mecanismos epigenéticos [21]. Por lo tanto, nos preguntamos si el miR-371-5p está regulada por ING1. En el presente estudio, mostramos que la expresión de miR-371-5p está regulada por epigenetically ING1 y que el miR-371-5p invierte una proporción significativa de los efectos inhibitorios de ING1 sobre la proliferación celular. Además, los cambios en la expresión ING1 afectan a la proliferación celular y la apoptosis, la reproducción en un modo inverso los efectos debidos a miR-371-5p, como se demuestra más en muestras de tumores. Las variaciones recíprocas e inversas de los niveles siguientes ING1 modulación de miR-371-5p demuestran claramente que están mecánicamente vinculados. La interacción estrecha entre ING1 y miR-371-5p se demuestra además por su silenciamiento concomitante: caída ING1 invierte por completo los efectos sobre la proliferación celular y la apoptosis debido a la inhibición de miR-371-5p, identificándolo como un importante efector aguas abajo de este miARN.