Extracto
El cáncer de hígado es una de las principales causas de muerte por cáncer. Una comprensión más profunda mecanicista de cáncer de hígado podría llevar al desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces. En nuestro trabajo anterior, que exhibió 646 miRNAs y se identificaron 11 que regulan la migración de células de cáncer de hígado. El presente estudio muestra que el miR-525-3p es con frecuencia hasta reguladas en tejidos de cáncer de hígado, y el aumento de la expresión de miR-525-3p puede promover la migración de células de cáncer de hígado y la invasión. proteína con dedos de zinc 395 (ZNF395) es el gen diana funcional directa de miR-525-3p, y con frecuencia es el regulado en tejidos de cáncer de hígado. La expresión alta de ZNF395 puede inhibir significativamente mientras desmontables de expresión ZNF395 puede mejorar notablemente la migración y la invasión de células de cáncer de hígado, lo que sugiere que ZNF395 suprime la metástasis en el cáncer de hígado. Baja regulación de ZNF395 puede mediar en la migración celular inducida por miR-525-3p cáncer de hígado y la invasión. En conclusión, el miR-525-3p promueve la migración de células de cáncer de hígado y la invasión atacando directamente a ZNF395, y el hecho de que el miR-525-3p y ZNF395 ambos juegan un papel importante en la progresión del cáncer de hígado que les convierte en posibles dianas terapéuticas.
Visto: Pang F, R Zha, Zhao Y, Wang Q, D Chen, Zhang Z, et al. (2014) miR-525-3p Mejora la migración y la invasión de las células del cáncer de hígado mediante la regulación negativa ZNF395. PLoS ONE 9 (3): e90867. doi: 10.1371 /journal.pone.0090867
Editor: Hong Wanjin, Instituto de Biología Molecular y Celular, Biopolis, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Agosto, 2013; Aceptó 7 de febrero de 2014; Publicado: 5 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Pang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por subvenciones del Programa Nacional 973 clave de Investigación básica (2013CB910504), Shanghai Oficina de Salud (XYQ2011047, XBR2011039) y el Proyecto Estado clave para el cáncer de hígado (2012ZX10002-009013). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las metástasis son la principal causa de muerte relacionada con el cáncer [1], [2]. Sistemáticamente el estudio de los mecanismos moleculares de la metástasis del cáncer de hígado es especialmente importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. metástasis tumoral es un proceso complejo de múltiples etapas en el que las células tumorales se mueven a los tejidos circundantes o distantes después de romper con el tumor primario. Este proceso implica el tránsito de las células tumorales a través de la matriz extracelular (ECM) y la membrana basal del vaso sanguíneo local [3], [4], [5], [6], [7], seguido por el movimiento en el microambiente de acogida [ ,,,0],8], [9], [10]. Estudios recientes han encontrado que, además de los genes de proteínas de codificación, los ARN no codificantes, tales como miRNAs también juegan papeles reguladores importantes en el proceso de metástasis [11], [12], [13], [14], [15], [ ,,,0],dieciséis]. miRNAs son pequeños ARN de una sola hebra no codificante, y sus secuencias están muy conservadas en eucariotas [17]. miRNAs regulan la expresión génica a nivel post-transcripcional mediante la unión a ARNm diana [18], [19], [20], y por lo tanto participar en diversos procesos biológicos [21], [22]. Meng et al [23] informó por primera vez que la expresión aberrante de miR-21 puede mediar en la invasión de células de cáncer de hígado atacando directamente a PTEN. Recientemente, el miR-151 y miR-30d se encuentran a ubicarse en sitios frágiles genómicas y están asociados con la metástasis del cáncer [24], [25]. Inducible por hipoxia expresión de miR-210 regula mediada por VMP1 hígado metástasis de las células del cáncer inducido por hipoxia [26].
A la pantalla miRNAs implicados en la metástasis del cáncer de hígado, en un estudio previo, que exhibió 646 miRNAs utilizando la cicatrización de heridas ensayo con el sistema de imágenes de células vivas, y 11 miRNAs se encontraron para regular eficazmente la migración de células de cáncer de hígado [27]. En un informe anterior [28], hemos identificado algunas regiones de variación del número de copias en el ADN genómico de 58 pares de tejidos de cáncer de hígado utilizando una matriz SNP 6.0. En el presente estudio, encontramos que el gen miR-525-3p se encuentra en una región de número de copias amplificadas y podría facilitar la migración de células de cáncer de hígado en el ensayo transwell. Además, el miR-525-3p es con frecuencia hasta reguladas en tejidos de cáncer de hígado y regula la migración de células de cáncer de hígado y la invasión por abajo de la regulación de la expresión de ZNF395. Estos hallazgos sugieren que el miR-525-3p y ZNF395 representan objetivos potenciales para el tratamiento del cáncer de hígado.
Materiales y Métodos
hígado humano muestras de tumor /Ética Declaración
cáncer de hígado humano y los tejidos adyacentes nontumorous se obtuvieron de los archivos de la pieza quirúrgica de cáncer de hígado Instituto Qidong, provincia de Jiangsu, china. Todas estas muestras se obtuvieron con consentimiento informado por escrito, y los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética del Centro Colaborador de la OMS para la Investigación en Producción humano autorizados por el Gobierno Municipal de Shanghai. Las muestras específicos utilizados en este estudio se han descrito en la publicación anterior [29].
Cell Cultura
HEK-293T, NCI-H1299, BxPC-3, PANC-1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, SK-HEP-1, MCF7, A549, NCI-H460, Tera-1 y Tera-2 fueron adquiridos de ATCC; Huh-7 fue adquirido de la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (JCRB), SMMC-7721 y BEL-7402 fueron adquiridos de banco de células Comisión de Preservación de la cultura típica, Academia China de Ciencias (BCN); MHCC-97L y LM3 fueron regalos de Zhongshan Hospital de la Universidad de Fudan (Shanghai, China); SMMC-7721, BEL-7402, MHCC-97L y LM3 utilizada en este estudio se han descrito en la publicación anterior [24], [30], [31], [32].
HEK-293T, NCI -H1299, BxPC3, Panc1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, Huh-7, HepG2, SK-HEP-1, SMMC-7721, 97L, LM3, BEL-7402 y MCF7 células fueron cultivadas en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). las células A549 y NCI-H460 se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% FBS. células Tera1 y Tera2 se cultivaron en medio 5a de McCoy suplementado con 15% FBS. Todas las líneas celulares se cultivaron en presencia de antibióticos a 37 ° C con 5% de CO
2
La extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total fue extraído por medio de reactivo TRIzol. (Invitrogen). cDNA fue sintetizado con el kit de reactivos Prime-Script RT (Takara). PCR en tiempo real se realizó con SYBR Premezcla Ex Taq (Takara). miRNAs maduros eran transcritas inversa y se cuantificaron utilizando ensayos TaqMan miARN (Applied Biosystems). Las sondas y cebadores usados para los genes miARN y la detección de ARNm se enumeran en la Tabla S1 y S2.
plásmido construcciones de vectores
La secuencia primaria miR-525 se amplificó a partir del ADN genómico de los tejidos normales y se ligó en un vector PGIPZ (Open Biosystems). La secuencia de ZNF395 ORF se amplificó a partir del vector ZNF395 (FulenGen) y se ligó en el vector pWPXL (un regalo del profesor Didier Trono). El ZNF395 3'UTR se amplificó a partir del ADN genómico de las células HK-293T y se subclonó directamente aguas abajo del codón de parada del gen de la luciferasa en el vector indicador de luciferasa. Mutant 3'UTR se obtuvo del clonado ZNF395 3'UTR utilizando el rayo kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Agilent). Tanto el tipo salvaje y secuencias 3'UTR mutantes se confirmaron por secuenciación (Invitrogen). El primer secuencias se presentan en la Tabla S3.
Lentivirus Producción y Transducción Celular
El plásmido psPAX2 envasado y el plásmido de la cubierta pMD2.G fueron un regalo del profesor Didier Trono. O bien el vector pGIPZ-miR-525 o pWPXL-ZNF395 se cotransfectó con psPAX2 y pMD2.G en células HEK293T utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los virus se cosecharon 48 h después de la transfección y se determinaron los títulos virales. células SK-HEP-1 y SMMC-7721 se infectaron con 1 x 10
6 unidades de transducción de lentivirus recombinantes en presencia de 6 mg /ml de polibreno (Sigma, MO). SMMC-7721-525, SK-HEP-1-525 y SK-HEP-1-ZNF395 son grupos de células estables, que infectaron utilizando lentivirus con GFP, líneas celulares estables utilizados en los ensayos con & gt;. 95% fluorescencia verde
El oligonucleótido transfección
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos. Después de 24 h, 100 pmol de miRNA mimic (Genepharma), inhibidor (Ribobio) o siRNA se transfectó usando 5 l de lipofectamina reactivo RNAiMax (Invitrogen). Las células se recogieron 48 h más tarde para los ensayos Transwell o ensayos de reportero de luciferasa. Las secuencias de siRNA se proporcionan en la Tabla S4.
Detección de la eficacia de transfección
Las células fueron transfectadas en placas de 6 pocillos usando 100 pmol de siRNA con FAM (Genepharma) y reactivo RNAiMax (Invitrogen), tras 20 a 24 h, la eficiencia de transfección se detectó utilizando citometría de flujo (FCM).
celulares Ensayos de proliferación
la proliferación celular se evaluó por el Cell Counting kit-8 kit de ensayo (CCK-8 Dojindo Corp ). 1 × 10
3 Las células se sembraron en placa cada pocillo de 96 pocillos y se cultivaron con 90 l de medio, se añadió 10 l CCK-8 en cada pocillo. Después se incubaron a 37 ° C durante 2 h, se detectó la absorbancia a 450 nm, y el valor OD450 se correlaciona con el número de células vivas.
migración y la invasión ensayos
ensayo de migración de la célula : 5 × 10
4 se suspendieron las células en 200 l de medio DMEM libre de suero y se sembraron en la cámara superior de cada inserción. Después, se añadieron 800 l de DMEM que contiene 10% de FBS a una placa de 24 pocillos. Después de incubación a 37 ° C (SK-HEP-1:6-8 h; SMMC-7721:12-16 h), las células que migraron se fijaron y tiñeron durante 30 minutos en una solución de colorante que contiene 0,2% de cristal violeta y 20 % de metanol. ensayo de invasión de la célula: Cámaras estaban cubiertos uniformemente con 40 a 80 l de Matrigel (BD Biosciences) diluido con DMEM a un cierto porcentaje y se incubaron a 37 ° C durante 2-4 h. A continuación, 1 × 10
5 células se suspendieron en 200 l de DMEM y se sembraron en las cámaras superiores, y 800 l DMEM que contenía FBS al 10% se añadió a la cámara inferior. Después de la incubación a 37 ° C (SK-HEP-1 14-16 h; SMMC-7721 16-18 h), las células fueron fijadas y teñidas
luciferasa reportero de ensayo
células HEK293T. se cultivaron en una placa de 96 pocillos y se transfectaron con 50 ng pluc-3'UTR, 10 ng de plásmido de luciferasa de Renilla y control imitan o negativo 5 pmol miR-525-3p. Después de 48 h de incubación, se detectó la actividad de luciferasa usando el sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase (Promega).
Western Blot Ensayo
Los lisados celulares se separaron por 10% SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad), se bloquearon con solución salina tamponada con fosfato que contiene Tween-20 y 5% de leche descremada durante 1 h, y se incubó con ZNF395 anticuerpo policlonal (Santa Cruz) (1:1000) o β-actina (Sigma) ( 1:10000). El complejo anticuerpo se detectó mediante quimioluminiscencia mejorada (Pierce).
Análisis estadístico
Todos los resultados se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM). Se analizaron las diferencias entre los grupos utilizando la prueba t de Student (dos colas, p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo).
Resultados
alta expresión de miR-525-3p mejora la migración y la invasión de las células de cáncer de hígado
Para explorar el papel de miR-525-3p en el desarrollo del cáncer de hígado, el nivel de expresión de miR-525-3p se detectó en 136 cáncer de hígado y vinculado tejidos adyacentes no cancerosos del hígado (NT). miR-525-3p fue significativamente hasta reguladas en tejidos de cáncer de hígado (Figura 1A), con regulación observada en el 60% de los tejidos de cáncer de hígado (Figura 1B). Además, hemos examinado la expresión de miR-525-3p en varias líneas celulares de cáncer. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de miR-525-3p es relativamente alta en las líneas celulares de cáncer de hígado (Figura S1 en File S1). Para examinar la función biológica de miR-525 en el CHC, las líneas celulares estables que expresan el miR-525 se construyó y se nombran SMMC-7721-525 y SK-HEP-1-525 (Figura S2A en S1 Archivo). CCK-8 ensayos sugieren que miR-525 no influyó en el crecimiento celular HCC (Figura S3 en File S1), mientras que transwell ensayos indicaron que la sobre expresión de miR-525 promueve SK-HEP-1 y la migración y la invasión SMMC-7721 (Figura 1C, D)
.
(a) la expresión de miR-525-3p se determinó mediante TaqMan PCR en tiempo real en el cáncer de hígado y muestras de tejido hepático no cancerosas adyacentes (NT) (n = 136). El nivel de expresión de miR-525-3p se normalizó a U6b snRNA. La expresión relativa de miR-525-3p se informó en un gráfico de caja con un registro
10 escala del eje. Los extremos de las cajas definen la 25
º y 75
º percentiles, y la línea indica la mediana. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t pareada, y las estrellas indican resultados estadísticamente significativas a P & lt; 0,05 (*). (B) El gráfico muestra las proporciones de tejidos de cáncer de hígado en los que la expresión de miR-525-3p fue hasta reguladas (60%), las reguladas (5%) y sin cambios (35%). (C) los ensayos de migración Transwell de SMMC-7721 y las células SK-HEP-1 que expresa el miR-525 o el vector de control. (D) los ensayos de invasión Transwell de SMMC-7721 y las células SK-HEP-1 que expresa el miR-525 o el vector de control. Se muestran imágenes representativas de la izquierda, y 3 campos seleccionados al azar, se cuantifican en la derecha. Los valores que se muestran aquí representan la media ± SEM, y las estrellas indican resultados estadísticamente significativas a P & lt; 0,01, ** o P. & Lt; 0,001, ***
miR-525-3p post-transcripcionalmente down-regula la expresión ZNF395 atacando directamente a su 3'UTR
A continuación trató de determinar los genes diana de miR-525-3p. genes diana potenciales se prevé utilizar la predicción miRNA algoritmos TargetScan, Miranda y Diana. predicciones conjuntos de cada dos software se combinaron y se encontraron 30 genes candidatos (Figura 2A). Se detectaron los niveles de expresión de estos genes después imita miR-525-3p se introdujeron en SK-HEP-1 y SMMC-7721. RANBP10, NACC1, IRF1, ZNF395 y mLST8 se inhibieron en más de un 40% (Figura S4 en File S1). Para entender si estos cinco genes están relacionados con el cáncer de hígado, se detectaron los niveles de expresión de estos genes en 12 pares de muestras de tejido de cáncer de hígado. RANBP10, IRF1 y ZNF395 resultaron ser las reguladas en tejidos de cáncer de hígado, mientras que los niveles de expresión de NACC1 y mLST8 se mantuvo sin cambios (Figura S5 en S1 Archivo).
(A) Esquema de los genes candidatos producido por diferentes algoritmos de predicción. Cada círculo representa un algoritmo de predicción y el número de genes que se predijo, y los números que se indican en las regiones donde los círculos se superponen representar el número de genes predichos por ambos algoritmos. (B) ensayos de Western blot de los niveles de proteína en ZNF395 SMMC-7721 y las células SK-HEP-1 infectadas con miR525 o el control de vectores. (C) secuencias de unión potenciales para miR525-3p dentro de la 3'UTR de ZNF395 humana (HSA), el chimpancé (PTR), rhesus (MML), perro (CFA) y conejo (Ocu). secuencias de semillas están subrayados. (D) plásmidos informadores de luciferasa se construyeron insertando el ZNF395 3'UTR y fragmentos correspondientes a la región aguas abajo del gen de la luciferasa. Se muestran las secuencias de unión predichos para miR-525-3p, incluyendo la de tipo salvaje UTR de longitud completa (WT) o mutante (MT, subrayados) sitios de unión. (E) la actividad de luciferasa relativa se ensayó después de las células HEK-293T fueron co-transfectadas con plásmidos informadores WT o MT ZNF395 3'UTR y miR-525-3p. Los valores se expresan como la media ± SEM, y las estrellas indican la significación estadística de p. & Lt; 0,01, **
Para saber si RANBP10, IRF1 y ZNF395 son posibles genes diana funcional de miR-525 -3P, estos genes se desmontables utilizando siRNA. Los resultados mostraron que la interferencia con la expresión IRF1 podría inhibir la migración de células SMMC-7721 y SK-HEP-1, un fenotipo que es incompatible con el fenotipo de miR-525-3p sobre-expresión. Desmontables de RANBP10 endógena y la expresión ZNF395 fue capaz de promover la migración de SMMC-7721 y las células SK-HEP-1. Este fenotipo es coherente con el fenotipo de miR-525-3p sobre-expresión. (Figura S6 en Archivo S1). A continuación, el RANBP10 y ZNF395 los niveles de proteína se analizaron por SK-HEP-1-525 y SMMC-7721-525 células para determinar si miR-525 sobre-expresión podría inhibir la expresión de estas proteínas. Los resultados mostraron que el nivel de proteína ZNF395 fue significativamente menor en SMMC-7721-525 y SK-HEP-1-525 células (Figura 2B). Considerando que el nivel de proteína RANBP10 no se vio afectada significativamente (Figura S7 en S1 Archivo). Por lo tanto, ZNF395 fue seleccionado para su posterior estudio.
El ZNF395 3'UTR contiene un sitio de unión para el miR-525-3p (predicho por TargetScan), y la secuencia de unión es muy conservadas en diversas especies tales como seres humanos, chimpancé, mono rhesus, perro y conejo (Figura 2C). Para determinar si el miR-525-3p regula directamente por la orientación ZNF395 su 3'UTR, se construyó un vector de luciferasa 3'UTR reportero ZNF395 de larga duración. La actividad de luciferasa disminuyó significativamente después de la co-transfección con las construcciones 3'UTR mímicos y luciferasa miR-525-3p. Por el contrario, la actividad de luciferasa relativa no cambió significativamente cuando se introdujeron sitios de unión de mutantes (figura 2D, E), lo que sugiere que miR-525-3p podría regular ZNF395 expresión mediante la unión directamente a su 3'UTR.
ZNF395 es frecuentes abajo-regulada en el cáncer de hígado y puede inhibir la migración celular y la invasión del cáncer de hígado
proteína con dedos de zinc 395 es un miembro de la familia de proteínas con dedos de zinc de tipo C2H2 Krüppel, y la mayoría de las proteínas en esta función como la familia activadores de la transcripción o inhibidores. ZNF395 no se ha informado anteriormente de estar involucrados en el cáncer de hígado o de la metástasis tumoral. Por lo tanto, los efectos de ZNF395 en el desarrollo y progresión de cáncer de hígado y el mecanismo que subyace a estos efectos se deben investigar. ZNF395 fue significativamente las reguladas en tejidos de cáncer de hígado (Figura 3A), con regulación a la baja observada en el 62% de los tejidos de cáncer de hígado (Figura 3B). Para aclarar el efecto de ZNF395 en la migración de células de cáncer de hígado y la invasión, la línea celular estable SK-HEP-1-ZNF395 fue establecida (Figura S2 B en S1 de archivos) y siRNAs contra ZNF395 recibieron la orden, se determinó la eficiencia desmontables de ZNF395-siRNAs por -tiempo real PCR (Figura S2C en S1 de archivos), y la eficacia de transfección de SK-HEP-1 y SMMC-7721 fueron 89,5% y 97,0% (Figura S2 D, e, F, G en S1 archivo).
(A) los niveles de expresión relativa de ZNF395 en HCC tejidos o tejidos no cancerosos emparejados (NT) se determinaron mediante ensayos de PCR de transcripción inversa-cuantitativos. (B) El gráfico muestra las proporciones de las muestras de cáncer de hígado en el que se había reducido regulado ZNF395 (62%), sin cambios (32%), y hasta reguladas (6%). ZNF395 expresión se determinó mediante PCR en tiempo real TaqMan en el cáncer de hígado y tejidos de hígado no cancerosos adyacentes (NT) (n = 136), y ZNF395 niveles de expresión se normalizaron a GAPDH. La expresión relativa de ZNF395 se presenta en un gráfico de caja. El análisis estadístico se realizó con una prueba t pareada. (C, D) Lentivirus mediada se detectó un exceso de expresión o knockdown siRNA inducida de expresión ZNF395 por Western blot en SK-HEP-1. ((E) niveles relativos de expresión de miR-madura 525-3p en ZNF395 sobreexpresión o células SK-HEP-1 desmontables. (F) de migración e invasión Transwell ensayos de SK-HEP-1cells que expresan de forma estable ZNF395 o el control de vectores. ( .. G) Transwell migración y la invasión ensayos de células SK-HEP-1 después de la caída de ZNF395 endógena imágenes representativas se muestran a la izquierda, y 3 campos seleccionados al azar se cuantifican a la derecha las barras de error representan el SEM; asteriscos indican significancia estadística en P & lt; 0,05, *; p & lt; 0,01, **; o P & lt;.. 0,001, ***
El nivel de expresión ZNF395 se detectó mediante un ensayo de western blot (Figura 3C, D) y niveles relativos de expresión de miR-madura 525-3p no se ha cambiado, obviamente, en ZNF395 sobreexpresión o desmontables células (Figura 3E) 1 SK-HEP-, de manera que se puede descartar la posibilidad de una cruz de regulación de miR-525 por ZNF395 . Este ensayo mostró que la sobre expresión de ZNF395 podría inhibir significativamente SK-HEP-1 migración y la invasión (Figura 3F), mientras que la interferencia con la expresión ZNF395 endógeno podría promover significativamente la migración y la invasión de SK-HEP-1 en las células (Figura 3G) .
Restauración de ZNF395 inhibe la migración y la célula del cáncer de hígado inducida por el miR-525 invasión
En un intento de probar si ZNF395 es el mediador funcional directa de la migración y la invasión inducida por el miR-525, una ZNF395 vector lentiviral que contiene el ORF de longitud completa pero con exclusión de la 3'UTR se introdujo en la línea celular estable SK-Hep1-525 (Figura 4A). Niveles relativos de expresión de miR-madura 525-3p no cambiaron obviamente en SK-HEP-1-525 y SK-HEP-1-525-ZNF395 células (Figura 4B). Los resultados mostraron que la expresión de alto ZNF395 fue capaz de compensar los cambios inducidos-miR-525 en SK-HEP-1 migración y la invasión (Figura 4C, D). Estos hallazgos indican que ZNF395 es un gen diana funcional directa de miR-525-3p.
(A) ensayos de Western blot para SK-HEP-1-vector o células SK-HEP-1-525 con o sin la reintroducción de ZNF395. (B) los niveles de expresión de miR-madura 525-3p en ZNF395 sobre-expresión o desmontables células SK-HEP-1. la migración (C, D) Transwell, ensayos de invasión de SK-HEP-1-vector o SK-HEP-1-525 células con o sin la reintroducción de ZNF395. Estos resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con la prueba t de estudiante. Las barras de error representan E.E.M, y las estrellas indican la significación estadística de P & lt; 0,05, *; y P & lt;. 0,001, ***
Discusión
miR-525 se encuentra en el cromosoma 19q13.42 sin un gen huésped. El nivel de expresión de miR-525-3p aumentó 6,8-8 veces en dos líneas de células tumorales de células germinales resistentes al cisplatino [33]. Wang et al [34] detectó la expresión de los genes miARN utilizando microarrays miARN y se encontró que el miR-525-3p fue hasta reguladas en tres pares de tejidos de cáncer de hígado. No hay informes sobre la función y el mecanismo de miR-525-3p en el cáncer. En este estudio, por primera vez, se encontró que la expresión elevada de miR-525-3p promueve la migración de células de cáncer de hígado y la invasión. ZNF395 es identificado como un gen diana funcional directa de miR-525-3p.
ZNF395 es un miembro de la familia de proteínas tipo de zinc dedo Krüppel C2H2. Se expresa ampliamente y se identificó originalmente como un factor de transcripción que regula el virus del papiloma humano (HPV) de expresión; Por lo tanto, también se conoce como factor de unión VPH-(PBF) y se puede unir a la región promotora HPV [35]. ZNF395 se expresa en líneas celulares de glioblastoma hipoxia inducida y en los vasos sanguíneos de los tejidos de glioblastoma adultos [36]. Tsukahara et al [37] encontró que ZNF395 es un antígeno asociado a tumor. ZNF395 También se demostró que regulan la ruta de PI3K /Akt para inhibir el crecimiento celular [38] mediante la activación de la caspasa-3 para promover la apoptosis [39]. No hay informes de ZNF395 estar involucrados en la metástasis tumoral.
Se presenta por primera vez que ZNF395 es con frecuencia las reguladas en tejidos de cáncer de hígado y que el miR-525-3p puede dirigirse específicamente a la ZNF395 3'UTR . La sobreexpresión de la ZNF395 puede inhibir la migración de células de cáncer de hígado y la invasión, mientras que la restauración de ZNF395 inhibe miR-525 mediada por la migración de células de cáncer de hígado y la invasión. La sobreexpresión de ZNF395 y miR-525 no tendrá ningún efecto en la NF-kB, vía MAPK, pero puede regular la vía de la PI3-K /Akt través de la alteración del estado de p-Akt (Figura 5, Figura S8 en S1 Archivo).
Western blot de PI3-K /Akt en las células SK-HEP-1-525 y SK-HEP-1-ZNF395.
en resumen, este estudio muestra que el alto la expresión de miR-525-3p promueve la migración celular y la invasión del cáncer de hígado. ZNF395 es un gen diana funcional directa de miR-525-3p; miR-525-3p promueve la migración de células de cáncer de hígado y la invasión por abajo de la regulación de la expresión de ZNF395. Este hallazgo revela un nuevo mecanismo de la metástasis del cáncer de hígado y nuevos objetivos para el tratamiento de cáncer de hígado.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Empresas El secuencias de sondas miARN
doi: 10.1371. /journal.pone.0090867.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2. Francia El tiempo real PCR para potenciales candidatos de genes diana predichos
doi: 10.1371. /journal.pone.0090867.s002 gratis (DOCX) sobre Table S3.
Los cebadores para el miR-525, ZNF395, ZNF395 3'UTR y la clonación 3'UTR mutante
doi: 10.1371. /journal.pone.0090867.s003 gratis (DOCX) sobre Table S4. secuencias
SiRNA contra IRF1, RANBP10 y ZNF395
doi: 10.1371. /journal.pone.0090867.s004 gratis (DOCX)
archivo S1.
Información de apoyo en los resultados obtenidos, que contiene la Figura S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 y S8. Figura S1. Los niveles de expresión de miR-525-3p en varias líneas celulares de cáncer. miR-525-3p expresión se determinaron mediante TaqMan PCR en tiempo real en líneas celulares de cáncer. Los niveles de expresión se normalizaron a U6 snRNA. Figura S2. Los niveles de expresión de líneas celulares estables que expresan altamente miR-525 y ZNF395. (A) los niveles de expresión de miR-525 madura en SMMC-7721-525 y SK-HEP-1 a 525, se utilizaron ensayos TaqMan ABI miARN y los datos se normalizaron por U6b snRNA. (B) El nivel de expresión relativa de ZNF395 en SK-HEP-1 o el vector de control, los datos se normalizó por GAPDH. (C) Derribo eficiencia de ZNF395-siRNAs. La mezcla de ZNF393-siRNA-1, ZNF393-siRNA-2, y ZNF393-siRNA-3 fue nombrado ZNF393-siRNA-1 + 2 + 3. (D, E, F, G) La eficacia de transfección de FAM-siRNA en las células SK-HEP-1 y SMMC-7721. Estrellas se indican para mostrar significado, P & lt; 0,01, **; P & lt; 0,001, ***. Figura S3. miR-525 no tiene efectos significativos sobre el crecimiento celular HCC. Ensayos de proliferación celular para SMMC-7721 (A) y células infectadas con miR525 que expresan lentivirus o control de vector SK-HEP-1 (B). Recuento de células kit-8 (CCK-8) de ensayo se utilizó para evaluar la proliferación celular. La media de los valores se representan gráficamente como se muestra, y las barras indican S.E.M. por triplicado. P = ns (no significativo) por el estudiante de
t-test
. Figura S4. Los niveles de expresión de genes diana potenciales candidatos pronosticados. Los datos se normalizó por GAPDH, y presentan como media ± E.E.M. Figura S5. Los niveles de expresión de genes candidatos en tejidos de cáncer de hígado. La expresión de (A) RANBP10, (B) IRF1, (C) ZNF395, (D) NACC1 y (E) mLST8 se determinaron mediante ensayos cuantitativos en tiempo real de la PCR en el cáncer de hígado y tejidos de hígado no cancerosos adyacentes (NT) (n = 12 ). Los datos se normalizó por GAPDH, estrellas están indicados para mostrar significado, P & lt; 0,05, *; P & lt; 0,001, ***. Figura S6. IRF1 interferencia, RANBP10 y expresión ZNF395 puede inhibir o promover SMMC-7721 y SK-HEP-1 células migración. (A) la expresión IRF1 interferencia podría inhibir SMMC-7721 y SK-HEP-1 células migración. RANBP10 interferencia (B) y ZNF395 expresión (C) podrían promover SMMC-7721 y SK-HEP-1 células migración. Figura S7. RANBP10 expresión no se cambia, obviamente, en el miR-525 sobreexpresado células. ensayos de Western blot de la expresión RANBP10 en las células SK-HEP-1 y SMMC-7721 infectados con miR525 o el control de vectores. Figura S8. La sobreexpresión de miR-525 y ZNF395 no tienen ningún efecto en la NF-kB, la vía MAPK o marcadores de EMT. Western blot de NF-kappa B (A), (B) MAPK vía y marcadores de EMT (C) en las células SK-HEP-1-525 y SK-HEP-1-ZNF395
doi:. 10.1371 /journal.pone .0090867.s005 gratis (DOC)
Reconocimientos
agradecemos al profesor Didier Trono (Facultad de Ciencias de la vida, Escuela Politécnica de Lausanne Fe'de'rale, 1015 Lausanne, Suiza) durante los generosos regalos de los plásmidos pWPXL, psPAX2 y pMD2.G.