Extracto
Antecedentes
Las bases moleculares y las características de la no familiar cáncer medular de tiroides son poco conocidos. En este estudio, hemos realizado microARN (miARN) de perfiles de muestras tumorales cáncer papilar de tiroides familiar y esporádica.
Metodología /Principales conclusiones
Genoma perfiles de miARN amplia de cáncer papilar de tiroides esporádico y familiar se llevó a cabo . miRNAs expresados diferencialmente fueron validados por RT-PCR cuantitativa. La expresión ectópica de miR-886-3p en líneas de cáncer de tiroides se realizó para identificar las vías dirigidas por el miARN, así como, para determinar su efecto en la biología de las células tumorales. Encontramos cuatro miRNAs expresados diferencialmente entre las muestras tumorales de cáncer de tiroides papilar familiares y esporádicos. MIR-886-3p y miR-20a fueron validados que se expresó diferencialmente por los de 3 y 4 veces, respectivamente. la vía de análisis de datos de expresión de todo el genoma de las células que sobreexpresan el análisis de miR-886-3p y predicción de destino mostró genes implicados en la replicación del ADN y vías de adhesión focal estaban regulados por miR-886-3p. La sobreexpresión de miR-886-3p en líneas celulares de cáncer de tiroides proliferación celular significativamente inhibido, el número y tamaño de esferoides y la migración celular. Además, la sobreexpresión de miR-886-3p aumentó el número de células en la fase S.
Conclusiones /Importancia
Nuestros hallazgos por primera vez sugieren que el miR-886-3p juega un papel importante en tiroides biología de las células tumorales del cáncer y regula genes implicados en la replicación del ADN y la adhesión focal. Por lo tanto, el miR-886-3p puede jugar un papel en el inicio y el o progresión del cáncer papilar de tiroides
Visto:. Xiong Y, Zhang L, Holloway AK, Wu X, Su L, Kebebew E (2011) MIR-886-3p regula la proliferación celular y la migración, y está desregulada en familiar para no cáncer de tiroides medular. PLoS ONE 6 (10): e24717. doi: 10.1371 /journal.pone.0024717
Editor: Marian Ludgate, la Universidad de Cardiff, Reino Unido
Recibido: 10 Junio, 2011; Aceptado: August 17, 2011; Publicado: 5 de Octubre, 2011
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Financiación:. Este estudio fue financiado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de tiroides es uno de los de más rápido crecimiento diagnósticos de cáncer en los Estados Unidos con más de 44.000 nuevos casos estimados que se produzca en el año 2011 [1]. cáncer de tiroides no medular familiar (FNMTC) se puede producir como un componente menor de los síndromes de cáncer familiar (, enfermedad de Cowden, Carney complejo de tipo 1, síndrome de Werner, McCune-Albright síndrome de Gardner) o como la característica predominante [2]. La mayoría de los casos de FNMTC son el cáncer papilar de tiroides y tienen un patrón de herencia autosómico dominante con penetrancia incompleta. FNMTC cuentas de hasta un 8% de todos los casos de cáncer de tiroides [2], [3], [4], [5], [6]. En los síndromes de cáncer familiar mencionados anteriormente, se sabe que los pacientes presentan lesiones extratiroidea distintos y los genes de susceptibilidad responsables de estos síndromes. Sin embargo, la mayoría (& gt; 95%) de los casos se producen como FNMTC familiar aislado de los casos de cáncer de tiroides nonmedullary para los que se desconoce el gen (s) de susceptibilidad
FNMTC se define como cuando dos o más familiares de primer grado. se ven afectados con cáncer de tiroides no medular. La base genética de FNMTC es poco conocida. En los estudios de ligamiento, varios grupos han identificado loci cromosómicos asociados con FNMTC: 1q21, 2q21, 6q22, 8p23.1-p22, y 19p13.2 [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. El análisis de mutaciones ha demostrado que los linajes con FNMTC no tienen mutaciones en la línea germinal
BRAF
,
RAS
, y
RET /PTC
genes que están mutados somáticamente comúnmente en los cánceres de tiroides de origen folicular de células [2]. Además, el análisis de mutaciones somáticas (
BRAF
,
RAS
, y
RET /PTC
) en muestras de tumores cáncer papilar de tiroides esporádico y familiar no mostró diferencias en la velocidad y tipo de mutaciones en estas histologías [2], [6], [14]. Por lo tanto, se desconoce si el perfil molecular de esporádica frente a cáncer de tiroides familiar es diferente. Por otra parte, tampoco se sabe si hay una base molecular para la edad más temprana de inicio y el comportamiento de una enfermedad más agresiva observada en FNMTC en comparación con enfermedad esporádica [6], [15], [16].
Los microARN ( miRNAs) son pequeños (~21-nucleótidos de longitud) RNAs no codificantes, que regulan la expresión de genes y juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, incluyendo la tumorigénesis [1] - [2]. A miRNA específico puede funcionar como un oncogén o como un supresor de tumores mediante la regulación de la expresión de oncogenes (s) diana y el gen (s) supresor de tumor, respectivamente. En la mayoría de los casos, los miRNAs se unen a las regiones 3 'no traducidas (3'-UTRs) de ARNm diana, dando lugar a la degradación del ARNm o la represión de la traducción. En el cáncer de tiroides, un polimorfismo de nucleótido único común en pre-miR-146a se ha informado para inhibir la expresión de los genes miARN maduro y aumentar el riesgo de desarrollar cáncer papilar de tiroides [17]. Hasta donde sabemos, no se han realizado estudios comparando los perfiles de miARN de cánceres familiares y esporádicos en general y específicamente para el cáncer de tiroides.
En este estudio, hemos realizado perfiles de miARN de muestras tumorales de cáncer papilar de tiroides familiar y esporádica. Encontramos que el miR-886-3p se downregulated en el cáncer papilar de tiroides en comparación a la normalidad y diferencialmente expresado en el cáncer papilar de tiroides familiar que en el cáncer papilar de tiroides esporádico. la vía de análisis de datos de expresión de todo el genoma de las células que sobreexpresan el análisis de miR-886-3p y predicción de destino mostró genes implicados en la vía de la replicación del ADN y la adhesión focal fueron regulados por miR-886-3p. De hecho, la sobreexpresión de miR-886-3p en líneas celulares de cáncer de tiroides, inhibió la proliferación celular, el número y tamaño de los esferoides y la migración.
Materiales y Métodos
Muestras de tejido tiroideo
muestras de tejido tiroideo se congelaron en nitrógeno líquido en el momento de la tiroidectomía. La junta de revisión Instituto Nacional del Cáncer aprobado este protocolo de investigación después de consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes. Todas las muestras de tejido se sometieron a examen histológico adicional por un patólogo endocrino para confirmar el diagnóstico e identificar las muestras con células tumorales mayor que 80%. Se utilizó 28 muestras de tumores papilares convencionales cáncer de tiroides (21 esporádica, 7 familiares) y 10 muestras de tejidos normales de tiroides para la matriz de perfiles de miARN. Un cuestionario de antecedentes familiares se utilizó para determinar si los tumores deben ser categorizados como esporádica o familiar. FNMTC se definió cuando 2 o más familiares de primer grado se vieron afectados con cáncer de tiroides folicular de células de origen. Los casos de cáncer de tiroides se confirmaron en los miembros de la familia afectados. Todas las muestras tumorales FNMTC eran de diferentes familias. En 5 de 7 muestras de tumores de FNMTC había tres familiares de primer grado afectados y en 2 de 7 había dos familiares de primer grado afectados. Las muestras tumorales fueron agrupados por edad (+/- 2 años), el sexo y el estadio TNM del cáncer (en una proporción 03:01 de casos esporádicos-a-familiar).
Mirna microarrays
un total de 28 microarrays (Exiqon ™) se realizaron comparando los dos tipos de cáncer de tiroides papilar familiares y esporádicos a una piscina de tejido tiroideo normal. La
2 log ratio de Cy5 a Cy3 señales de intensidad se calculó para cada miARN en cada array (sin sustracción de fondo) y los datos se normalizó por la impresión punta loess normalización [18], [19]. Desde miRNAs individuales fueron representados por cuatro sondas en la matriz, el registro normalizado mediana
2 relación de las sondas replicadas (para los que tienen más de una sonda sin marcar) se utilizó como valor para el miARN. El registro se resume
2 ratios para cada experimento se usaron entonces en las estadísticas t moderados y cálculo de valor de p utilizando el paquete de limma en R /Bioconductor [20], [21] con el ajuste de la tasa de falso descubrimiento utilizando el Benjamini-Hochberg método [22]. MiRNA datos de microarrays, que es compatible con MIAME, ha sido depositado en la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
Líneas celulares y condiciones de cultivo
líneas celulares de cáncer de la tiroides humana FTC-133 (cáncer de tiroides folicular) y TPC-1 (cáncer papilar de tiroides) se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) con 4,500 mg /L D-glucosa, L-glutamina, y 110 mg /piruvato de sodio L) suplementado con 10% de suero, estimulante de la tiroides hormonal (TSH) (10 mU /ml), penicilina (10.000 U /ml), estreptomicina (10.000 U /ml), Fungizone (250 mg /mL) e insulina ( líneas 10 (g /ml) en un incubador humidificado estándar a 37 ° C en un 5% de CO
2 y el 95% de O
2 atmósfera. Ambas líneas celulares se establecen y autentificada tiroides celulares de cáncer [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. La línea celular TPC-1 fue proporcionado por el Dr. Nabuo Satoh (Japón) y la línea celular FTC-133 fue proporcionada por el Dr. Peter Goretzki (Alemania). El suero medios de comunicación libres (DMEM- medios F12) suplementado con 4 hormonas (insulina [10 mg /ml], la somatostatina [10 ng /ml], transferrina [5 mg /ml], y la hidrocortisona se utilizó [0,36 ng /ml]) para los estudios funcionales.
mirna transfección
precursor de miARN maduro (pre-miR-886-3p, Applied Biosystems, Foster City, CA) se transfectaron en células usando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante . Una secuencia aleatoria pre-MIR (Control de pre-miR-Negativo) (Applied Biosystems) se utilizó como control negativo (miR-NC).
El aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
el ARN total se extrajo mediante el uso de reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los ensayos TaqMan Mirna (Applied Biosystems) se utilizaron para medir el nivel de expresión de los genes miARN. El ARN total se transcribió de forma inversa con un cebador-miARN específico, seguido por PCR en tiempo real con sondas TaqMan. U6 se utilizó como control endógeno. La cantidad relativa de ARNm se determinó mediante ensayo TaqMan (Applied Biosystems) en un sistema ABI 7900 HT, usando GAPDH humano como control endógeno. El método ΔΔ Ct se utilizó para calcular los niveles de expresión.
Ensayo de proliferación
La proliferación celular se determinó utilizando CyQUANT Ensayo de proliferación celular (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La intensidad de fluorescencia se midió utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
ensayo de migración
La capacidad migratoria de las células del cáncer de tiroides se evaluó mediante el ensayo de la herida de cero en las células cultivadas en monocapa. Aproximadamente 150.000 células fueron transfectadas con pre-miR-886-3p (25 nM) o miR-NC (25 nM) después se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran y crecer durante 44 horas. A partir de entonces, tres heridas verticales se hicieron con una punta de pipeta de 10 l estéril y una línea horizontal se hizo a través de las tres líneas para permitir la observación de las células en el mismo punto. Las células fueron inspeccionados cada 6 horas y las mediciones realizadas hasta 22 horas de la herida inicial.
Genoma toda la expresión de mRNA de microarrays
TPC-1 células fueron transfectadas con pre-miR-886- 3p y pre-miR-NC. Setenta y dos horas después de la transfección, las células se lavaron tres veces con PBS. El ARN total se preparó a partir de cultivos celulares por triplicado utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Se aseguró la calidad del ARN, antes de su etiquetado, usando el kit 6000 Nano RNA Agilent Bioanalyzer y el 2100. Ciento cincuenta se utilizó ng de ARN total para llevar a cabo la transcripción inversa de ADNc, síntesis, amplificación, de fragmentación y marcaje terminal con el Labeling GeneChip WT Sense Target y control de Reactivos (Affymetrix, Santa Clara, CA). Aproximadamente 25 ng /l de ADNc se hibridó a la Affymetrix Human Gene 1,0 ST GeneChip matriz. Los arreglos fueron lavados y teñidos utilizando el protocolo de fluidos FS450_0007 procedimiento en una estación de fluidos Affymetrix 450. Las intensidades de la sonda fueron escaneados por el escáner GeneChip 3000. Los datos en bruto se normalizó y se analizaron usando Partek Genómica Suite (Partek Inc., St. Louis, MO , ESTADOS UNIDOS). Se utilizó el análisis de varianza para determinar los conjuntos de sonda significativamente diferentes entre los dos grupos. La lista de genes se filtró con un factor de cambio de corte de 2. Esto resultó en la producción de la lista de genes con genes que tienen expresión diferencial significativa en p≤0.001 y las diferencias de 2 veces o más. Pathway análisis se realizó utilizando los recursos de bioinformática DAVID.
flujo del ciclo celular análisis de citometría de
Los efectos de la sobreexpresión de miR-886-3p sobre la progresión del ciclo celular se evaluaron utilizando yoduro de propidio citometría de flujo. Brevemente, las células TPC-1 y FTC-133 se transfectaron con pre-miR-886-3p o pre-miR-NC durante 72 horas a 120 horas. Las células se lavaron con PBS, se recogieron, y se fijaron en 70% de etanol. A continuación, las células se trataron con (500 U /ml) de RNasa libre de DNasa y se tiñeron con yoduro de propidio. Las muestras de células se analizaron en un citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA), y G
0G
1, S y G
fracciones de fase 2M se determinaron utilizando el software ModFitLT (Topsham, ME).
La apoptosis análisis de citometría de flujo
Los efectos de la sobreexpresión de miR-886-3p sobre la muerte celular fueron evaluadas por Anexina V-FITC y yoduro de propidio flujo citometría utilizando el kit ApoAlert Anexina V (Clontech, Mountain View, CALIFORNIA). TPC-1 y células de FTC-133 se transfectaron con pre-miR-886-3p o pre-miR-NC durante 72 horas a 120 horas. Se recogieron las células y se tiñeron con Anexina V-FITC y yoduro de propidio de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras de células se analizaron en un citómetro, y se determinaron las fracciones apoptóticas.
reportero de ensayo de luciferasa
El par de base 1160 3'-UTR de
CDC6
se clonó en el vacío luciferasa vector reportero pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), generando un tipo salvaje
CDC6
constructo informador de luciferasa UTR (pEZX-WT-UTR). Las mutaciones en el 3'-UTR de
CDC6
fue diseñada para los primeros cuatro nucleótidos (CACC para GTGG) o los últimos tres nucleótidos (CGC a GCG) de la región de semilla de 7-mer del sitio de unión putativo de miR-886-3p, generando dos mutantes denominado como pEZX-Mut-UTR-01 y pEZX-Mut-UTR-02, respectivamente. Todas las construcciones se secuencia verificada por secuenciación del ADN. Para el ensayo de luciferasa dual, células TPC-1 se sembraron por triplicado en placas de 12 pocillos y se co-transfectaron con 0,25 g del constructo reportero y 15 pmol de pre-miR-886-3p o pre-miR-NC usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A las 24 horas, las células se lisaron y se ensayaron para tanto luciérnaga y luciferasa de Renilla utilizando Luc-Pair ™ de miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) en un lector de microplacas SpectraMax M5e (Molecular Device, Sunnyvale, CA) de acuerdo con los fabricantes 'instrucciones.
Análisis de datos
los datos se presentan como la media ± error estándar de la media. Para determinar la significación estadística, se utilizaron la prueba, la prueba t de Mann-Whitney U y el análisis de la varianza, según sea apropiado. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Resultados
Mirna perfiles de cáncer papilar de tiroides esporádico y familiar
Se comparó el perfil de expresión de miRNA de cáncer papilar de tiroides familiar y esporádico muestras tumorales utilizando todo el genoma análisis de microarrays miARN. Las muestras fueron agrupados según la edad y el sexo de los pacientes, y el estadio tumoral TNM. miARN expresión en muestras de tumor se comparó con muestras normales de tejido de la tiroides. Había 232 miRNAs en esporádicos y 135 miRNAs en el cáncer papilar de tiroides familiar que se dysregulated en comparación con muestras normales de tejido de la tiroides (Figura 1A) (p & lt; 0,05). El cien por nueve de los miRNAs disregulados eran únicos para esporádica, 13 eran únicos a otros familiares y los cuatro miRNAs se expresaron significativamente diferente entre el cáncer papilar de tiroides esporádico y familiar (Figura 1A y 1B). Dos de los cuatro miRNAs fueron validados para ser significativamente expresados diferencialmente entre familiar y cáncer papilar de tiroides esporádico por cuantitativa en tiempo real RT-PCR (Figura 2). Tanto miR-20a y miR-886-3p también se downregulated significativamente en el cáncer de tiroides papilar esporádico comparación con el tejido normal de la tiroides (p = 0,032 y p = 0,0032, respectivamente) (Figura 1B).
A) Comparación de las diferencialmente expresado miRNAs en el cáncer papilar de tiroides esporádico y familiar en comparación con el tejido normal de la tiroides. El círculo indica esporádica comparación de este grupo con el tejido normal de la tiroides, el círculo familiar indica la comparación de este grupo con el tejido normal de la tiroides, y el círculo familiar esporádica-indica la comparación entre los tumores familiares y esporádicos. B) por ciento de los genes miARN expresión diferencia relativa entre los tumores familiares y esporádicos normalizados para muestras de tejido normal. * Valor de p. & Lt; 0,05
miR-20a era de 4 veces y miR-886-3p fue 3 veces mayor en el cáncer papilar de tiroides familiar en comparación con esporádicos (p = 0,025 para el miR-20a , p = 0,028 para el miR-886-3p, p = 0,37 para el miR-195, p = 0,46 para el miR-29c). Los valores son más expresión media y menos el error estándar de la media. El eje Y representa la proporción de ARN miARN y U6 utilizando el método 2
-ΔΔCt, y el valor más bajo de la muestra fue ajustado a 1.0.
Los genes diana y las vías de miR-886- 3p en las células del cáncer de tiroides
Dada la función de miR-886-3p en la biología de las células tumorales es desconocida, fuimos los primeros interesados en determinar el gen diana (s) y la vía (s) que pueden ser regulados por el MIR -886-3p. Se han utilizado dos enfoques para determinar los objetivos de miR-886-3p: miARN objetivo de predicción y análisis de la expresión de ARNm de todo el genoma en células que sobreexpresan el miR-886-3p (Figura 3). Encontramos 730 predice genes diana de miR-866-3p utilizando las bases de datos de predicción de destino (Miranda, miRBase, las exploraciones de destino). Mediante la realización de KEGG vía de análisis de los ARNm dysregulated en el miR-886-3p menos bajo las células expresadas, encontramos genes implicados en la replicación del ADN y vías de adhesión focal fueron misexpressed a la sobreexpresión de miR-886-3p en líneas celulares de cáncer de tiroides. La integración de estos enfoques de la bioinformática identificado seis genes en común entre los análisis. Por lo tanto, estos genes se prevé que sean los objetivos de miR-886-3p.
Para hacer frente a esta hipótesis, se seleccionaron cuatro de estos genes para la validación a la sobreexpresión de miR-886-3p. Encontramos regulación a la baja significativa de los cuatro genes a la sobreexpresión de miR-886-3p por RT-PCR cuantitativa (Figura 4). De estos genes, se interesa en particular
CDC6
ya que este gen codifica un potente regulador de la replicación del ADN y la oncogénesis [27]. Curiosamente, el análisis de transferencia Western mostró regulación a la baja de
CDC6
expresión de la proteína dentro de las 72 horas de la sobreexpresión de miR-886-3p (Figura 5). A fin de evaluar si
CDC6
es un objetivo directo de la regulación de miR-886-3p, la transfección de la 3'UTR
CDC6
salvaje vector de tipo en las células de cáncer de tiroides con la sobreexpresión de miR-886-3p mostró regulación a la baja significativa de la actividad luciferasa lo que sugiere que
CDC6
era un objetivo directo de miR-886-3p (Figura 6). Las mutaciones en la región de semillas predicho para miR-886-3p en el 3'UTR de
CDC6
abolió este efecto, sugiriendo además que el miR-886-3p regula directamente
expresión CDC6 gratis (Figura 6 ).
la transfección de pre-miR-886-3p disminuido significativamente los niveles de mRNA de cuatro genes diana (
CDC6
,
PIP5K1C
,
PXN
,
ZYX
) en a) TPC-1 y la línea celular B) línea celular FTC-133 (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01). El eje Y representa la relación entre el gen diana específico y GAPDH utilizando 2 método
-ΔΔCt, y el valor del grupo de miR-NC se fijó en 1,0 para permitir la comparación de las diferencias de plegado entre las diferentes líneas celulares y genes.
a) Representante de imagen de transferencia de Western de
CDC6
expresión de la proteína a las 72 horas después de la transfección con pre-miR-886-3p en comparación con el control negativo (miR-NC). B) Banda densitometría cuantificación de
CDC6
expresión de la proteína. Se utilizó el software ImageJ (Maryland, EE.UU.) para el análisis densitométrico de transferencias Western.
A) vectores pEZX-WT-UTR tanto con la luciferasa de Renilla (hRLuc) se utilizó como control interno y la luciferasa de luciérnaga (hLuc) fue aguas arriba de la construcción de 3'-UTR. B) putativo sitio de unión de miR-886-3p en el
CDC6 página 3 'UTR, junto con las mutaciones en la región de semillas predicho. C) Izquierda figura muestra la actividad de luciferasa de pEZX-WT-UTR en células TPC-1 cuando se co-transfectadas con pre-miR-886-3p o pre-miR-NC, p & lt; 0,05. cifras central y derecha showluciferase actividad de pEZX-Mut-UTR-01 y pEZX-Mut-UTR-02 en TPC-1 células cuando se co-transfectadas con pre-miR-886-3p o pre-miR-NC, respectivamente. Todas las mediciones de luciferasa se realizaron por triplicado y se realizaron lecturas a las 24 horas después de la transfección.
miR-886-3p regula el ciclo celular y la proliferación, y la formación de esferoides y la migración
Debido encontramos miR-886-3p regula genes implicados en la replicación del ADN y vías de adhesión focal, estábamos interesados en determinar el papel de miR-886-3p el ciclo celular y la proliferación celular, así como, la formación de esferoides y la migración. Se determinó primero la expresión basal de miR-886-3p en cuatro bien caracterizado y autenticado líneas celulares de cáncer de tiroides y encontrado que FTC-133 y TPC-1 tenían alto y más bajo nivel de expresión de miR-886-3p, respectivamente (Figura 7A ). Se han utilizado estas líneas celulares para analizar el efecto de miR-886-3p sobre la proliferación celular. La sobreexpresión de 886-3p miR-proliferación celular significativamente inhibida por 79% en células de FTC-133 a las 144 horas (p & lt; 0,001) y 77% en las células TPC-1 a 120 horas (p & lt; 0,001) en comparación con pre-miR Carolina del Norte (Figura 7B).
a) línea de Base expresión de miR-886-3p en cuatro líneas de cáncer de tiroides. B) Efecto de la sobreexpresión de miR-886-3p sobre la proliferación celular del cáncer de tiroides. Pre-miR-886-3p inhibió significativamente la proliferación de células de cáncer de tiroides. Las barras de error representan el error estándar de la media. * P≤0.001.
Dado el profundo efecto de la sobreexpresión de miR-886-3p sobre la proliferación celular, que queríamos explorar junto al mecanismo de inhibición del crecimiento mediada-886-3p MIR. Nosotros, por lo tanto, realizó citometría de flujo y la anexina V ensayos para determinar el efecto de miR-886-3p en la progresión del ciclo celular y la apoptosis, respectivamente. La sobreexpresión de miR-886-3p aumentó significativamente el número de células en fase S (12-16%) mientras que disminuye el número de células en G
0 /G
1 (11-22%) (p & lt; 0,001 ). Nosotros, sin embargo, encontramos un aumento significativo en el número de células en apoptosis con y sin sobreexpresión de miR-886-3p. Estos datos indican que el miR-886-3p regula el ciclo celular y la proliferación consistente con nuestra vía MIR-886-3p y objetivo análisis de predicción
.
Debido vía MIR-886-3p y objetivo análisis de los genes que regulan la adhesión focal eran mostraron misexpressed, también se determinó el efecto de la sobreexpresión de miR-886-3p en la formación de esferoides línea celular de cáncer de tiroides y la migración celular. La línea celular FTC-133 forma esferoides cuando se cultiva en frascos de cultivo adherentes ultra bajas dentro de las 72 horas. Consistente con el efecto de la sobreexpresión de miR-886-3p en monocapa de células, se observó una disminución en el número y tamaño de esferoides en la línea celular de cáncer de tiroides FTC-133 que se mantuvo durante hasta 2 semanas en cultivo (Figura 8). Además, la sobreexpresión de miR-886-3p disminuyó las múltiples estructuras ramificadas de celular observada en las células de control negativo. Se determinó el siguiente efecto de la sobreexpresión de miR-886-3p sobre la migración celular utilizando el ensayo cero herida. La sobreexpresión de miR-886-3p inhibió significativamente la migración del TPC-1 línea celular (p & lt; 0,001) (Figura 9)
Pre-miR-886-3p disminuyó el tamaño y el número de esferoides en la FTC. -133 línea celular. A) Imagen Representante de esferoides en cultivo con sobreexpresión de miR-886-3p. B) La cuantificación de la diferencia esferoide con sobreexpresión de miR-886-3p. La superficie total ocupada por esferoides dentro de una imagen se midió circunscribiendo el perímetro de cada esferoide, que marca toda la zona, y el cálculo del número de píxeles utilizando el software ImageJ (Maryland, EE.UU.). Los experimentos se repitieron tres veces, y se observaron resultados similares. (*** Indica p & lt; 0,001).
Pre-miR-886-3p disminuido significativamente la migración de células a las 22 horas (p & lt; 0,001). A) imagen representativa de ensayo de la herida en el tiempo 0 y 22 horas después de cero. B) Cuantificación de cierre ancho de la herida con la sobreexpresión de miR-886-3p. Seis lugares diferentes se visualizaron y fotografiaron bajo un microscopio invertido de contraste de fases (aumento de 10x) en cada placa a diferentes puntos de tiempo, y tres placas se utilizaron para cada grupo. La anchura de la herida en los 10 × imágenes se midió usando un calibrador estándar. Los experimentos se repitieron tres veces, y se observaron resultados similares. (*** Indica p & lt; 0,001).
Discusión
En este estudio, hemos realizado perfiles de miARN de muestras tumorales de cáncer papilar de tiroides familiar y esporádica. Encontramos cuatro miRNAs se expresan diferencialmente entre estos grupos, dos de los cuales, el miR-886-3p y miR-20a, se validaron que se expresó diferencialmente por los de 3 y 4 veces, respectivamente. Ambos de estos miRNAs se downregulated en el cáncer de tiroides papilar, en comparación con el tejido normal de la tiroides por 3,5-4 veces. vía de la expresión de genes en todo el genoma y la predicción de destino análisis demostraron genes implicados en la replicación del ADN y vías de adhesión focal fueron blanco de miR-886-3p. La sobreexpresión de miR-886-3p en líneas celulares de cáncer de tiroides inhibe significativamente la proliferación celular, el número y tamaño de esferoides, y migración celular. Por otra parte, la sobreexpresión de miR-886-3p aumentó el número de células en fase S y la disminución del número de células en G
0G
1 fase con ningún efecto sobre la apoptosis.
No tenemos conocimiento de cualesquiera otros estudios que han comparado el perfil miARN de tumores asociados con síndromes de cáncer familiar con sus homólogos de aparición esporádica. Dicho análisis proporciona información importante sobre las vías genéticas que pueden ser diferentes en los tumores histológicamente similares, los objetivos importantes de los cambios genéticos que predisponen y, en el caso de FNMTC, la base molecular. Aunque la mayoría de los investigadores han sugerido que FNMTC es un síndrome hereditario distinto, argumentos en contra de esto incluyen que, 1) el mismo gen de susceptibilidad (s) y el o los loci no han sido observadas en varios estudios de ligamiento, 2) los tumores tiroideos malignos son comunes y por lo tanto una diagnóstico de cáncer de tiroides puede ser un efecto fundador o incidentalmente descubierta, y 3) la expresividad es variable [2]. Por otra parte, varios estudios apoyan FNMTC como un síndrome hereditario distinto porque, 1) múltiples linajes han informado que tienen ocurrencia de varias generaciones de FNMTC, 2) hay una mayor tasa de cáncer de tiroides en los hombres y los niños dentro de las genealogías FNMTC, 3 ) hay una edad más temprana de presentación, y 4) no-macho a macho de transmisión. Por último, los estudios epidemiológicos demuestran que el riesgo de cáncer de tiroides en un pariente de primer grado de un paciente diagnosticado con cáncer de tiroides es 5 veces mayor [28]. Ante esta controversia, nos dispusimos a determinar si los perfiles de expresión de cáncer papilar de tiroides familiar y esporádico eran diferentes. Un gran número de miRNAs se dysregulated tanto en el cáncer de tiroides papilar familiar y esporádica comparación con el tejido normal de la tiroides. Se realizó la elaboración de perfiles de miARN en muestras tumorales de pacientes que fueron agrupados por edad, género y etapa del cáncer de TNM. Tal enfoque se utilizó para minimizar los factores de confusión que podría dar lugar a diferentes perfiles de expresión de miARN debido a la diferente extensión de la enfermedad, los subtipos histológicos del tumor y el estado de diferenciación de los tumores [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Por lo tanto, creemos que nuestro diseño cuidadoso estudio y análisis proporcionan datos que, por primera vez, soportan una diferencia molecular en el cáncer papilar de tiroides familiar y esporádico
.
Entre los miRNAs expresados diferencialmente entre el cáncer papilar de tiroides familiar como esporádica, dos miRNAs fueron validados que se expresó diferencialmente por RT-PCR cuantitativa. Tanto el miR-20a (13q31.3) y miR-886-3p (5q31.2) no se encuentran en loci cromosómicos previamente identificados como loci de susceptibilidad por los estudios de ligamiento en linajes con FNMTC. Dadas las pequeñas longitudes de nucleótidos de miRNAs, no es de extrañar que las alteraciones genéticas en el cromosoma loci de codificación de miR-20a y miR-886-3p pueden haberse perdido en estos estudios, incluso con el uso de SNP arrays de alta resolución [13]. En el futuro, análisis de la secuencia de la línea germinal se puede utilizar para determinar si estos miRNAs son genes de susceptibilidad candidatos para FNMTC. Además, será importante determinar en futuros estudios del mecanismo de la regulación a la baja general de miR-886-3p en el cáncer de tiroides se debe a la variación del número de copia, la inactivación de mutaciones o eliminación.
Estábamos interesados en estudiar el papel de miR-886-3p en la carcinogénesis de tiroides por varias razones. Principalmente, la función de miR-886-3p es desconocida, la localización cromosómica del gen de miR-886 en 5q31 se comparte con la transformación β1 factor de crecimiento, un regulador importante en la carcinogénesis epitelial, y el nivel de expresión diferencia miR-886-3p entre familial y el cáncer papilar de tiroides esporádico era grande (3 veces). De acuerdo con nuestros resultados, un estudio reciente mostró miR-886-3p se downregulated en el cáncer de pulmón de células escamosas en comparación con el tejido pulmonar normal, lo que sugiere un posible papel supresor de tumores para este miARN [5]. El uso de dos líneas celulares de cáncer de tiroides bien caracterizados con diferentes niveles de expresión basal miR-866-3p, hemos demostrado que miR-886-3p juega un papel crítico en la proliferación celular y la migración, y regula genes implicados en la replicación del ADN y de adhesión focal vías. Seleccionamos
CDC6
, un potente regulador de la replicación del ADN y la oncogénesis [27], para su posterior análisis y encontramos que
CDC6
era un objetivo directo de miR-886-3p. Aunque nuestros estudios funcionales se realizaron en líneas de cáncer de tiroides, nuestros datos sugieren que miR-886-3p es un regulador importante de la biología de las células tumorales en el cáncer de tiroides [26].
La sobreexpresión de miR-886-3p causada dramático cambios en la expresión de genes que regulan la replicación del ADN y la adhesión focal. Cuatro genes (
CDC6
,
PIP5K1C
,
PXN
,
ZYX
) tuvieron & gt; caída de 4 veces con un aumento de la expresión de miR-886-3p .
CDC6
codifica una proteína esencial para la replicación del ADN y la mitosis, y por lo tanto las cuentas probables para el aumento del número de células en fase S después de la sobreexpresión de miR-886-3p [36].