Resumen
Las metaloproteinasas de matriz (MMP) estimular la invasión tumoral y la metástasis mediante la degradación de la matriz extracelular. Aquí revelamos un papel inesperado para MMP10 (estromelisina 2) en el mantenimiento y la tumorigenicidad de las células madre, como el cáncer de pulmón de ratón (CSC). MMP10 se expresa altamente en cultivos oncosferas enriquecidas en células madre cancerosas y caída mediada por ARNi de
MMP10
conduce a una pérdida de la expresión de genes marcadores de células madre y la inhibición del crecimiento oncósfera, la expansión clonal, y el crecimiento transformado
in vitro
. Curiosamente, la expansión clonal de
MMP10
oncosferas deficientes puede ser restaurada mediante la adición de proteína exógena MMP10 al medio de cultivo, lo que demuestra un papel directo para MMP10 en la proliferación de estas células. Oncosferas actividad de iniciación de tumor metastásico y mejorada de exposiciones cuando se inyecta ortotópicamente en ratones singénicos, mientras que los cultivos MMP10 deficientes muestran un defecto grave en la iniciación del tumor. A la inversa, oncosferas implantado en singénico no transgénico o
MMP10
- /- ratones no muestran diferencias significativas en el tumor de la iniciación, el crecimiento o la metástasis, lo que demuestra la importancia de
MMP10
producido por el cáncer las células en lugar de el microambiente tumoral en la iniciación del tumor de pulmón y de mantenimiento. El análisis de datos de expresión génica de los cánceres humanos revela una fuerte correlación positiva entre la expresión de MMP10 tumor y el comportamiento metastásico en muchos tipos de tumores humanos. Por lo tanto,
MMP10
se requiere para el mantenimiento de una, iniciadoras del cáncer altamente tumorigénicas, la población de células madre-como en el cáncer de pulmón metastásico. Nuestros datos demuestran por primera vez que
MMP10
es un cáncer de pulmón de células madre gen crítico y nueva diana terapéutica para el cáncer de pulmón de células madre
Visto:. Justilien V, Regala RP, Tseng IC, Walsh MP, Batra J, Radisky ES, et al. (2012) metaloproteinasas de la matriz-10 se requiere para el cáncer de pulmón Tallo Mantenimiento Celular Tumoral Iniciación y potencial metastásico. PLoS ONE 7 (4): e35040. doi: 10.1371 /journal.pone.0035040
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 31 Enero, 2012; Aceptado: March 8, 2012; Publicado: 24 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Justilien et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de /Instituto de Salud Nacional del cáncer (R01 y R21 CA081436-13 CA151250-01), la Fundación V para la Investigación del cáncer y el Programa de Investigación de James y Esther king Biomedical (1kg-05-33971) a APF ; una beca posdoctoral del Instituto Nacional del Cáncer Ruth A. Kirschstein (CA115160) a RPR; y los Institutos Nacionales de la Salud Suplemento de Investigación para promover la diversidad en el Premio de investigación relacionada con la salud del Instituto Nacional del Cáncer (VJ). APF es la Profesora Mónica Flynn Jacoby de Investigación del Cáncer, un fondo de dotación que proporciona soporte parcial para el programa de investigación del investigador. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. El resultado en los pacientes con CPNM sigue siendo pobre, lo que subraya la necesidad de identificar los medios más eficaces de prevención, diagnóstico y tratamiento. Los tumores contienen subpoblaciones de células madre que presentan características similares que impulsan la patogénesis [2], [3], [4]. Estas células iniciadoras del cáncer o cáncer madre (células madre cancerosas) exhibición de auto-renovación, la actividad iniciadoras del tumor, la expansión clonal como "oncosferas", la capacidad de soportar el mantenimiento del tumor y la metástasis, y de diferenciarse en las células transitoriamente-amplificación que comprenden el tumor mayor [2], [4], [5], [6]. CSC compartir las características moleculares con las células madre embrionarias, incluyendo la expresión de aldehído deshidrogenasa (ALDH) [7], y marcadores de células tales como CD133 tallo [8], [9], Nanog [10], Oct4 [10], Sox2 [11] y receptores Notch [12]. Los CSC se han descrito en muchas formas de cáncer humano incluyendo los cánceres de pulmón [9], [13]. El papel central de los CAC en la tumorigénesis indica que estas células deben dirigirse terapéuticamente para lograr un tratamiento eficaz del cáncer.
MMPs han sido implicados en la proliferación de pulmón tumor, invasión y metástasis [14]. La estromelisina subfamilia [estromelisina 1 (MMP 3), 2 (MMP10) y 3 (MMP11)] a menudo se sobreexpresa en NSCLC [15],. Curiosamente, MMP10 es altamente expresado en tumores de NSCLC pero no las células estromales asociadas a tumores, mientras que MMP3 MMP11 y se expresan predominantemente en el estroma [17],. Recientemente hemos demostrado que se requiere para el crecimiento transformado MMP10 y la invasión de células de NSCLC humano
in vitro
[19], se induce en las células madre bronquio-alveolar (BASCs) transformado por oncogénico
Kras
[ ,,,0],20], y promueve
Kras
tumorigénesis de pulmón mediada in vivo [21].
MMP10
ratones deficientes exhiben un bloque en
Kras
la formación de tumores de uretano inducida -y, un efecto que se correlaciona con una incapacidad de BASCs MMP10 deficientes para ampliar y sufrir una transformación en respuesta a uretano o
Kras
[21]. Por lo tanto, MMP10 media la iniciación del tumor mediante el control de la expansión de células (BASC) iniciadoras del tumor.
A continuación, evaluamos el papel de MMP10 en el mantenimiento y el potencial tumorigénico de las células madre cancerosas de pulmón de ratón transformado totalmente. Cultivos enriquecidos en células madre cancerosas de las células de adenocarcinoma de pulmón de ratón expresan elevados MMP10, Nanog, ALDH1, CD133, Notch3, Notch4, HEY1 y hey2. Estos cultivos presentan una mayor crecimiento independiente de anclaje in vitro, y mejorar la iniciación del tumor, el crecimiento y la diseminación metastásica como tumores ortotópico en ratones singénicos. Estas propiedades madre-como requieren la expresión de MMP10 en células tumorales pero no en el estroma asociado al tumor. Nuestros resultados indican que MMP10 es un candidato atractivo para el desarrollo de la terapia basada en células madre cancerosas de pulmón mecanismo de selección altamente tumorigénicas.
Resultados
oncosferas pulmón de ratón expresan elevados MMP10 y propiedades madre-como MMP10-dependientes
MMP10
se induce en las células madre pulmonares bronquio-alveolar iniciadoras del tumor (BASCs) tras la activación oncogénica
Kras
[20]. Por otra parte,
disminuyó MMP10
exhibición ratones deficientes
Kras
la formación de tumores de pulmón y mediada por una pérdida de
Kras
mediada por la expansión BASC in vitro e in vivo [21]. Para explorar directamente la importancia de MMP10 en los pulmones CSC biología, se analizaron las células CMT167 ratón, una línea celular altamente tumorigénicas, metastásico derivado de un adenocarcinoma pulmonar alveolar espontánea en un ratón C57BL /6 [22], [23]. La secuenciación del ADN reveló que las células CMT167 albergan una activación
Kras
G12V
mutación (Figura 1), lo que es un modelo celular ideal para estudiar MMP10 en mutantes
Kras
células madre cancerosas de pulmón. En contraste con las células CMT167 cultivadas en cultivo adherente (Figura 1B, a la izquierda), las células cultivadas en medio de células madre se definen en placas de baja adherencia crecer como oncosferas (Figura 1B, medio) recuerdan culturas CSC de líneas celulares de cáncer de pulmón humano [13] . Estos oncosferas redifferentiate cuando se devuelva al cultivo adherente, que presenta morfología similar a las células parentales (Figura 1B, derecha). CMT167 oncosfera culturas exhiben un aumento ~ 8 veces en la formación de colonias independiente del anclaje en comparación con células parentales (Figura 1C), en consonancia con las propiedades tumorigénicas mejoradas de CSC [13]. la formación de colonias mejorada se pierde en gran medida cuando se permite que estas células para redifferentiate devolviéndolos al cultivo adherente (Figura 1C). Se obtuvieron resultados similares utilizando una segunda línea de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón, el carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) (Figura S1A y B). células LLC cultivan como oncosferas en exhibición cultivo de células madre mejora de la formación de colonias de anclaje independiente, pero pierden estas propiedades cuando se devuelva al cultivo adherente. Estos resultados demuestran que nuestras culturas oncosferas se enriquecen en células madre, como el cáncer.
células A) CMT167 albergan una activación
Kras
G12V
mutación. secuencia de ADN cromatograma de
Kras
alelo en células CMT167 revela un codón de 12 mutación de glicina a valina (
Kras
G12V
) (flecha roja). B) microfotografías de contraste de fase de células adherentes CMT167 parentales (
panel izquierdo
), oncosferas CMT167 en cultivo de células madre (
El panel medio
) y re-diferenciada células oncosferas después del retorno a la cultura adherente (
panel de la derecha). C) CMT167 oncósfera culturas exhiben un mayor crecimiento independiente de anclaje. La media de veces de cambio a partir de células parentales CMT167 +/- SEM. n = 5, * p & lt; 0,00001; ** P & lt;.
0,00001
Para caracterizar mejor nuestras culturas oncosferas, que evaluaron la expresión de genes asociados a células madre bien caracterizados. QPCR reveló que CMT167 oncosfera culturas expresan elevados de ARNm para muchos genes asociados con el fenotipo de células madre [24] incluyendo Nanog, ALDH1, CD133, Notch3, Notch4, HEY1 y hey2 (Figura 2A). Sorprendentemente, estos cultivos también expresan elevados MMP10 mRNA (Figura 2A), pero sin aumento de MMP2, MMP7, MMP9, MMP11, MMP12 o MMP14, otras especies Mmp comúnmente relacionados con el cáncer de pulmón (Figura 2A). Como era de esperar, los cultivos de oncosfera exhiben una pérdida de marcadores de células madre y la expresión de MMP10 cuando se les permite redifferentiate en cultivo adherente (Figura 2B). Se observó un patrón similar de expresión de marcadores de células madre en cultivos de oncosfera de células LLC, incluyendo un aumento dramático en MMP10, lo que indica que estos cambios no son exclusivos de CMT167 oncosferas (Figura S1c). CMT167 oncósfera culturas secretan proteínas elevadas MMP10 en el medio en comparación con cultivos parentales o re-diferenciada (Figura 2C), lo que demuestra la importancia funcional de elevada expresión MMP10 en estos cultivos. CD133 y Notch4 son dos marcadores de superficie altamente selectivos expresadas en otros células madre cancerosas de pulmón [9],. Por lo tanto, se evaluó la expresión de estos marcadores en CMT167 parentales, oncósfera y re-diferenciada culturas oncosferas por citometría de flujo (Figura 2D). cultivos de células parentales contienen ~ 8% CD133
+ /Notch4
+ células. Por el contrario, las culturas oncosferas contienen ~38% CD133
+ /Notch4
+ células y culturas re-diferenciada ~ 6% CD133
+ /Notch4
+ células. Estos resultados son consistentes con la prevalencia de los CAC en otras líneas celulares de cáncer de pulmón [9], lo que indica que estos son marcadores selectivos para cultivos enriquecidos-CSC.
A) Expresión de marcadores de células madre de cáncer en CMT167 parental y culturas oncosferas. QPCR de los genes asociados a las células madre del cáncer; * P & lt; 0,05. B) QPCR para marcadores de células madre en cultivos parentales, oncosferas y re-diferenciada oncosferas. Doblar de células parentales +/- SEM, n = 3; * P & lt; 0,05. C) CMT167 oncósfera culturas secretan proteínas elevadas MMP10. ELISA de sobrenadantes de cultivo de los padres CMT167, oncósfera y re-diferenciada oncósfera culturas. La media +/- SEM. n = 3, * p & lt; 1 × 10
-8 oncosferas frente a los padres; ** P & lt; 2 × 10
-8 oncosferas vs. oncosferas re-diferenciada. D) La citometría de flujo de CMT167 padres, oncósfera y re-diferenciada culturas oncosferas para CD133 y Notch4.
Desde oncosferas expresan elevados MMP10, el próximo evaluó si MMP10 es importante para su mantenimiento y crecimiento. Se identificaron tres lentivirus de ARNi dirigidos ratón RNA MMP10 que inhiben la expresión MMP10 (Figura S2A y B). Cada virus knockdown MMP10 causó una inhibición conmensurable de crecimiento independiente de anclaje en comparación con las células control (NT) RNAi no objetivo (Figura S2C). El constructo MMP10 RNAi más eficaz (# 3) se utilizó para obtener la precipitación eficaz de MMP10 mRNA en ambos cultivos parentales y de oncosfera (Figura 3A). knockdown MMP10 causó una inhibición de crecimiento transformado (Figura 3B), y una pérdida en la expresión de Nanog, ALDH1, CD133, Notch3 y 4, HEY1 y 2, y MMP10 (Figura 3C). Resultados similares fueron obtenidos en oncósfera LLC culturas en las que MMP10 fue derribado por RNAi (Figura S3 A-C). MMP10 RNAi culturas oncosferas también mostraron una disminución de CD133
+ /Notch4
+ células en comparación con NT RNAi culturas oncosferas (Figura 3D). Curiosamente, MMP10 desmontables también causó una disminución en CD133
+ /Notch4
+ células en los cultivos parentales (de ~ 11% a ~ 5%) (Figura 3D), indicando que MMP10 es importante para el mantenimiento de un CSC población dentro de las culturas de los padres. QPCR
a) que muestra la precipitación mediada por ARNi de MMP10 en CMT167 de los padres y las culturas oncosferas. En relación con células parentales NT; Media ± S.D., n = 3. * p & lt;. 0,0002 y ** p = 0,01 frente a control parental NT. B) Efecto de la MMP10 RNAi en el crecimiento independiente de anclaje de los padres y CMT167 oncósfera culturas. En relación con células parentales NT +/- SEM, n = 5; * P & lt; 0,05 vs, NT; ** P & lt; 0,05 vs. NT parental. C) QPCR para marcadores de células madre en NT de los padres, y NT y MMP10 RNAi CMT167 oncósfera células. Pliegue de NT padres +/- SEM, n = 3; * P & lt; 0,05. D) La citometría de flujo de células de los padres y oncosferas NT y MMP10 RNAi para CD133 y Notch4.
A continuación se determinó si MMP10 es importante para la expansión clonal de oncosferas, una característica bien definida de células madre cancerosas. células de oncosfera individuales MMP10 RNAi- y NT RNAi se sembraron en pocillos individuales de placas de cultivo de tejidos de bajo adherentes y se dejaron expandir por clonación. Prácticamente todas las células NT RNAi se expanden en grandes oncosferas durante un período de 15 días (Figura 4A, superior), mientras que la mayoría de las células MMP10 RNAi permanecen como células individuales (Figura 4A, inferior). Se obtuvieron resultados similares en cultivos de LLC de oncosfera (Figura S3D). La disminución de la expansión clonal de oncosferas CMT167 era debido a la pérdida genética de MMP10 puesto que la adición de MMP10 recombinante al medio de cultivo la expansión clonal de las células restaurado MMP10 RNAi (Figura 4A, inferior). La cuantificación confirmó que oncosferas NT RNAi crecen significativamente más grande que oncosferas MMP10 RNAi, y la adición de MMP10 recombinante restaura el crecimiento de las células MMP10 RNAi para que comparable a las células NT RNAi mientras que no tiene efecto significativo sobre las células NT RNAi (Figura 4B). Exógena MMP10 también llevó a re-expresión de CD133 y Notch4 sobre las células MMP10 RNAi (Figura 4C), y la re-expresión de marcadores de células madre (Nanog, ALDH1, CD133, Notch3, Notch4 y hey2) (Figura S4A). La disminución del crecimiento clonal de oncosferas MMP10 RNAi no se debe a una pérdida de la viabilidad celular, ya que estas células proliferan a una velocidad indistinguible de oncosferas NT RNAi cuando se coloca de nuevo en cultivo adherente (Figura S4B)
.
A) Las fotomicrografías de la expansión clonal de una sola NT y MMP10 RNAi CMT167 oncosfera células en presencia o ausencia o MMP10 recombinante. diámetro B) de colonias derivadas de células individuales CMT167 NT y MMP10 RNAi. La media +/- SEM; n = 10, * p & lt; 0,05 vs. día 1 de cada tratamiento; ** P & lt; 0,05 vs. día 15 NT RNAi sin MMP10. C) La citometría de flujo de NT y MMP10 RNAi CMT167 oncósfera culturas +/- MMP10 para CD133 y Notch4.
actividad iniciadoras de tumores dependientes de MMP10 culturas oncósfera exposición
in vivo
Seguidamente, evaluó la actividad iniciadoras de tumores de las culturas y de los padres oncosferas por inyección ortotópico en el lóbulo izquierdo del pulmón de los ratones singénicos. Los experimentos iniciales determinaron que la inyección de 100.000 células CMT167 /luc parentales que se requería para establecer tumores ortotópico mientras que la inyección de tan sólo 1.000 luc NT RNAi CMT167 /de culturas oncosferas rutinariamente dio tumores. La inyección de 1.000 células de oncosfera luc NT RNAi CMT167 /condujo a tumores grandes mientras que la inyección de 1.000 células luc parentales NT RNAi CMT167 /o células de oncosfera luc MMP10 RNAi CMT167 /fracasado para producir grandes tumores como se determina por formación de imágenes en vivo de la bioluminiscencia (Figura 5A). El examen patológico de los tejidos del pulmón en el momento del sacrificio demostró que la toma del tumor fue de 100% para las células NT RNAi CMT167 /luc de oncosfera (9/9) con un tamaño medio de tumor de 3,63 +/-. 35 mm
2, pero sólo 45% del tumor necesita para que los padres NT RNAi CMT167 /luc (5/11) con un tamaño medio de los tumores de 0,42 +/-. 06 mm
2, y el 27% del tumor dan por MMP10 RNAi CMT167 /células oncosferas luc (3 /11), con un tamaño medio de los tumores de 0,36 +/-. 09 mm
2. Estos datos validan nuestras mediciones de bioluminiscencia in vivo y demuestran que MMP10 desempeña un papel crítico en la actividad y el crecimiento de las células de oncosfera luc CMT167 /iniciadoras de tumor. Curiosamente, MMP10 caída en células parentales también conduce a una pérdida de la formación de tumores in vivo (Figura S5A), lo que indica que MMP10 es importante para la actividad de iniciación de tumor de una población de células CSC-como presente en cultivos de células parentales. NT RNAi CMT167 /culturas oncosfera luc también generaron numerosas metástasis a los lóbulos derecho del pulmón mientras que los cultivos /célula luc RNAi CMT167 parental NT exhibido número mucho menor de metástasis y MMP10 RNAi CMT167 /culturas oncosfera luc menos aún (Figura S5B), lo que sugiere un papel para MMP10 en el potencial metastásico, una propiedad atribuida a células madre cancerosas de pulmón. Por lo tanto, MMP10 es importante para el potencial tumorigénico mejorada observada en los cultivos de oncosfera.
A, el crecimiento del tumor ortotópico después de la inyección de 1.000 células de NT adherente, NT RNAi oncosfera o MMP10 RNAi culturas oncosfera se controló por bioluminiscencia en el indicado puntos de tiempo; * P & lt; 0,05 (
panel izquierdo
). vistas laterales representativas de imágenes bioluminiscentes de ratones portadores de tumores de pulmón ortotópico (
panel de la derecha
). MMP10 función en los tumores de células oncosferas CMT167 es autónoma. B) Las imágenes bioluminiscentes representativos de NT RNAi CMT167 oncósfera ortotópico tumores implantados en Ntg y
MMP10
- ratones receptores - /. Análisis de C) el tamaño del tumor y D) metástasis en el GTN o
MMP10
- /- ratones. C-D, n = 10, media +/- SEM.
tumorigenicidad es independiente de MMP10 en el microambiente tumoral
Los efectos de MMP10 en células CMT167
in vitro
son células autónomas. Sin embargo, no podemos descartar un papel para MMP10 producido por epitelial asociada al tumor, estromales y /o células inmunes en nuestros estudios de tumores ortotópico. Para abordar esta cuestión, se inyecta 1.000 células de NT culturas oncosferas luc RNAi CMT167 /o en cualquiera Ntg
MMP10
- /- ratones. No se observaron diferencias significativas en el crecimiento del tumor (Figura 5B), el tamaño del tumor primario (Figura 5C) o metástasis (Figura 5D) en el GTN y
MMP10
- /- ratones receptores, lo que indica que MMP10 expresado por oncosferas, pero no de MMP10 producida por otras células asociadas a tumores, es crítico para la formación de tumores. Hemos demostrado anteriormente que MMP10 se expresa en niveles infinitamente bajos en el epitelio pulmonar, pero está altamente inducido en BASCs tras la activación de oncogénico
Kras
[20]. Por lo tanto, las células tumorales son la principal fuente de MMP10 en los pulmones de los ratones portadores de tumores.
oncósfera culturas se diferencian en células tumorales a granel después de la inyección ortotópico
Los CCC inician y mantienen los tumores mediante el mantenimiento de un CSC población y diferenciarse en células transitoriamente de amplificación que conforman el tumor mayor. Para evaluar el destino de oncosferas CMT167 después de la formación de tumores ortotrópico, se aislaron las células tumorales de los tumores ortotópico derivados de estos cultivos y las analizamos para CD133
+ /Notch4
+ células (Figura 6). En el momento de la inyección, las culturas oncosferas mostraron un enriquecimiento significativo de CD133
+ /Notch4
+ células (~36%) (Figura 6A). En contraste, las células tumorales aisladas de tumores ortotópico consistieron en ~ 11% CD133
+ /Notch4
+ células, de conformidad con las células CMT167 parentales (Figura 6B). Estos datos indican que los cultivos se propagan oncosferas una población de CD133
+ /Notch4
+ células madre similares, y también se diferencian en forma transitoria de amplificación de las células tumorales in vivo. También exploramos la distribución de CMT167 oncósfera células en los tumores ortotópico por inmunohistoquímica para MMP10 y Notch4 (Figura 6C). Los tumores primarios derivados de oncosferas exhibieron ligeramente elevados de tinción con MMP10 más oscuro tinción MMP10 en áreas donde el tumor interactúa con estroma circundante. estroma tumoral asociada y normal mancha epitelio pulmonar negativo para MMP10, en consonancia con la escasez de expresión MMP10 en el epitelio pulmonar normal [20]. tinción Notch4 exhibió un patrón similar, lo que indica la co-expresión de MMP10 y Notch4 en las células tumorales en la interfaz del tumor y estroma circundante (Figura 6C, parte superior).
análisis citométrico de flujo para la expresión CD133 y Notch4 en CMT167 oncosferas antes de la inyección ortotópica en ratones singénicos (a) y las células CMT167 aisladas de tumores ortotópico (B). C) MMP10 y Notch4 tinción en un tumor oncósfera CMT167 primaria (
paneles superiores
) y la lesión metastásica (
paneles inferiores
).
MMP10 expresión se asocia con metástasis de las células de cáncer de pulmón
La evidencia reciente indica que las CSC residen en nichos premetastásico responsables de la propagación del tumor metastásico. Dada la asociación del potencial metastásico y stemness, se evaluó la expresión de MMP10 y Notch4 en las lesiones metastásicas de tumores derivados de oncosferas. Curiosamente, tanto MMP10 y tinción Notch4 fue intenso y uniforme en las lesiones metastásicas (Figura 6C, inferior), lo que indica que estas lesiones están enriquecidas en células madre cancerosas positivas dobles MMP10-Notch4. Se observó una asociación similar de la expresión de MMP10 con lesiones metastásicas en los cánceres humanos cuando analizamos públicamente disponibles conjuntos de datos de expresión génica de los tumores humanos utilizando la herramienta bioinformática NextBio. El análisis reveló una fuerte correlación positiva entre la expresión de MMP10 y el potencial metastásico en NSCLC humano, el cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, carcinoma de células renales y cáncer de próstata (Tabla 1). Por lo tanto, MMP10 parece jugar un papel muy extendida en la malignidad humana.
Discusión
Una pequeña subpoblación de células madre similares a auto-renovación puede ser responsable de la iniciación, el mantenimiento, la progresión y la diseminación metastásica de los tumores. Sin embargo, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos moleculares implicados en el mantenimiento de CSC. CSC puede escapar la quimioterapia convencional, debido a su resistencia a los fármacos intrínseca y /o quiescencia relativa, lo que resulta en recurrencia de la enfermedad y la mala evolución del paciente. Por lo tanto, las estrategias terapéuticas dirigidas a la erradicación de células madre cancerosas pueden mejorar el resultado clínico de pacientes con cáncer.
Aunque MMPs durante mucho tiempo han sido implicados en la progresión tumoral y la metástasis, recientemente hemos demostrado que MMP10 se sobreexpresa en NSCLC humano y
Kras
-transformado células iniciadoras del cáncer de pulmón BASC [19], [20], y que se requiere para el crecimiento transformado MMP10 y la invasión de células de NSCLC humanos
in vitro
[19]. Además, MMP10
- /- ratones muestran una disminución significativa en uretano y
Kras
tumorigénesis de pulmón inducida debido a un defecto de MMP10-deficientes BASCs para expandirse en respuesta a oncogénico
Kras
[21]. Aquí, se presenta el sorprendente resultado de que MMP10 promueve la iniciación del tumor y la metástasis de pulmón a través del mantenimiento de una población CSC-como las células tumorales de pulmón.
Los CCC se definen por su capacidad para expandirse clonalmente, diferenciarse en células tumorales a granel , e iniciar los tumores en los animales receptores. Aquí nos muestran que MMP10 se sobreexpresa en cultivos enriquecidos oncosferas-CSC partir de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón de ratón de dos y es necesario para el crecimiento transformado mejorada y expansión clonal
in vitro
, y para la iniciación del tumor
in vivo
. La inhibición de
MMP10
expresión en oncosferas disminuye significativamente la expresión de células asociadas a factores de transcripción madre y marcadores de la superficie celular, lo que indica que MMP10 es fundamental para mantener la identidad de pulmón CSC. expresión MMP10 también es elevada en células madre cancerosas aisladas a partir de pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón de células humanas [27], lo que sugiere que MMP10 también puede funcionar en el mantenimiento de estas células madre cancerosas.
Una clave para la orientación efectiva NSCLC CSC será la de precisión identificar esta subpoblación dentro de los tumores. BASCs son las células iniciadoras del tumor putativo de la que
Kras
tumores de pulmón de ratón inducida por originan. expresión BASCs exhibición superficie de Sca1, SPC y CCSP, sin embargo hasta la fecha, las células madre broncoalveolar humanos que co-expresan SP-C y CCSP no se han aislado, y Sca1 no se expresa en células de pulmón humano [28]. Curiosamente, CMT167 oncosfera culturas no sólo se enriquecen en CCSP
+ /SPC
+ células (datos no presentados), pero también en CD133
+ /Notch4
+ células, dos marcadores implicados en humanos y células madre cancerosas de ratones de diferentes tipos de tumores incluyendo cáncer de pulmón [25], [29]. La inhibición de la señalización bloquea la capacidad de CSC neuroesferas derivadas de glioblastoma para propagar los tumores y Notch agota CD133
+ células madre como en neuroesferas [29]. Del mismo modo, los bloques de inhibición de la proliferación y la actividad Notch iniciadoras del tumor de células madre cancerosas de pulmón humano [25]. Hemos observado enriquecimiento significativo de Notch4
+ /CD133
+ células en CMT167 oncosferas con se requiere pocas células positivas individuales que sugieren que la co-expresión de estas moléculas para mantener CMT167 CSC. Por lo tanto, Notch4 y CD133 pueden ser útiles marcadores de células madre cancerosas de pulmón a través de especies
.
Nuestros datos proporcionan evidencia directa de que el papel de
MMP10 Hoteles en células madre cancerosas de pulmón de células es autónoma. Nuestro modelo de tumor ortotópico muestra la tinción MMP10 en células tumorales pero no estroma asociado al tumor o epitelio pulmonar morfológicamente normal. Más importante aún, no se observaron diferencias significativas en el número de tumores, tamaño o lesiones metastásicas formadas por las células de oncosfera ortotópicamente inyectado en Ntg singénico o MMP10
- /- ratones. Por lo tanto, mientras que muchas MMP producidas por juego estroma asociado al tumor papeles prominentes en las propiedades invasivas y metastásicas de las células tumorales de pulmón, MMP10 es producido principalmente por las células tumorales de pulmón para apoyar el crecimiento autónomo de células madre cancerosas. Nuestros datos son consistentes con numerosos informes de que MMP10 se expresa en células de NSCLC humanos y no tejidos circundantes pulmonares normales o asociados a tumores-[15], [17], [18]. Los estudios futuros se centrarán en la determinación de los mecanismos moleculares que contribuyen a la proliferación mediada por MMP10 CSC.
un peor pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón se debe a la diseminación metastásica y la resistencia de las células tumorales a la quimioterapia, dos características atribuidas a los CAC. En los tumores primarios derivados-oncosferas se observó el mejoramos MMP10 y Notch4 tinción en la interfase entre el tumor y el tejido circundante, lo que sugiere un papel para MMP10
+ /Notch4
+ células en la invasión tumoral. Estos datos son consistentes con nuestra financiación anterior que se requiere MMP10 para la invasión de células de NSCLC humanos
in vitro
[19], y nuestra conclusión de corriente que MMP10 contribuye al comportamiento metastásico de tumores CMT167 oncosfera derivados. Curiosamente, las células tumorales dentro de las lesiones metastásicas uniformemente expresa MMP10 y Notch4 lo que sugiere que se derivan de, y altamente enriquecidos en, células madre cancerosas. MMP10 caída conduce a una reducción significativa en las lesiones metastásicas que indican la importancia de MMP10 en el comportamiento metastásico.
Análisis de la expresión de datos de perfiles en NSCLC reveló una correlación significativa entre la expresión de MMP10 y la progresión tumoral, la invasión local y metástasis a distancia [30 ]. Hemos observado asociaciones similares entre la expresión de MMP10 y el comportamiento metastásico de cáncer humano de colon, melanoma, de mama, renal y cáncer de próstata (Tabla 1). Por lo tanto, MMP10 puede jugar un papel extendido en el comportamiento metastásico de muchos tipos de cánceres humanos. El uso de un enfoque de la bioinformática, hemos demostrado que la expresión de MMP10 en los tumores humanos se asocia con las dos firmas de genes de células madre embrionarias y el potencial metastásico [21]. Curiosamente, células madre cancerosas parecen promover la quimio-resistencia y un estudio reciente reveló que MMP10 se sobreexpresa en cisplatino-resistentes en comparación con las células cisplatino-sensibles de ovario humano adenocarcinoma [31]. Se requieren estudios adicionales para determinar si MMP10 promueve la metástasis y la quimio-resistencia en células tumorales humanas mediante el mantenimiento de un altamente metastásico, la población de células madre del cáncer quimioresistente, ya que nuestros datos presentes en células de adenocarcinoma de pulmón de ratón predeciría.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, enzimas y genes desmontables
células
CMT167 y LLC RNAi mediada lentiviral que expresan luciferasa de luciérnaga fueron un regalo del Dr. Rafael Nemenoff (Universidad de Colorado, Denver, CO) y eran caracterizado previamente [32]. En pocas palabras, estas células fueron transfectadas con pGL3 que contienen luciferasa de luciérnaga constitutivamente impulsado por un promotor de SV40 y las células que expresan altos de luciferasa fueron seleccionados mediante resistencia a la neomicina [32]. Recombinante dominio catalítico proMmp10 humano se expresó en la cepa de E. coli BL21 (DE3), aislado a partir de cuerpos de inclusión, purificada, replegada, y activado
in vitro
por tratamiento con acetato 4-aminofenilmercúrico, esencialmente como se describe anteriormente para MMP3 [33]. Los detalles de la construcción y los métodos se han presentado para su publicación en otra parte [34]. Las concentraciones de MMP10 activada se determinaron por absorbancia de UV a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado de 29.910 M
-1cm
-1. se determinó como se describe anteriormente [19]; actividad específica de MMP10 (1 U = 100 pmol /min a 37 ° C 43,75 U /mg). Se añadieron 100 U /ml de MMP10 como se indica en la figura de leyendas.
Los vectores lentivirales que contienen horquilla corta ARNi contra ratón MMP10 se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Un vector lentiviral control no diana que contiene un corto constructo horquilla de ARN que no reconoce ningún ratón o genes humanos (NT) se usó como un control negativo. Las células fueron transducidas con lentivirus recombinante y transfectantes estables seleccionados por resistencia a la puromicina como se ha descrito anteriormente [19]. secuencias de ARNi se proporcionan en la Figura S1 A. Eficiencia de MMP10 caída se evaluó mediante PCR cuantitativa (QPCR).
enriquecimiento, la expansión clonal y la rediferenciación de CSC pulmonares
CSC se enriquecieron a partir de células CMT167 y LLC mediante el cultivo de 10.000 células /ml en suero exento de DMEM-F12 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 50 mg /ml de insulina (Sigma-Aldrich), 0,4% de albúmina bovina fracción V (Sigma-Aldrich), N-2 Plus medios Suplemento (amp I +; D Systems , Minneapolis, MN), B-27 Suplemento (Gibco-Invitrogen), 20 mg /ml de EGF (PeproTech) y 10 mg /ml de bFGF (PeproTech) (medio CSC) en ultra bajo frascos de fijación (Corning, Corning, NY) para apoyar el crecimiento de oncosferas indiferenciadas. culturas oncosfera se ampliaron por tripsinización y disociación mecánica seguida por la re-enchapado de suspensiones de células individuales (10.000 células /ml) en medio fresco CSC. Oncosferas se recogieron para los experimentos después de 2 semanas de cultivo no adherente.