Extracto
quimiorradiación concurrente con 5-fluorouracilo (5-FU) es ampliamente aceptada para tratamiento para el cáncer. Sin embargo, las interacciones entre la radiación y 5-FU no están claros. A continuación, se evaluó la influencia de la irradiación local sobre la farmacocinética de 5-FU en ratas. La radiación de una sola fracción fue entregado a todo los campos de la pelvis de ratas Sprague-Dawley después de la planificación computarizado basado en tomografía. 5-FU a 100 mg /kg fue prescrito 24 horas después de la radiación. Un sistema de cromatografía líquida de alta resolución se utilizó para medir 5-FU en la sangre. Metaloproteinasas de matriz-8 (MMP-8) inhibidor I se administró a examinar si o no RT modulación de los parámetros farmacocinéticos de 5-FU podría ser bloqueado. En comparación con controles irradiados de, toda irradiación pélvica reduce el área bajo la curva de concentración frente al tiempo (AUC) de 5-FU en el plasma y, por el contrario, el aumento en la bilis con una forma dependiente de la dosis de radiación. Basado en el análisis conjunto de proteínas, la cantidad de plasma de MMP-8 se incrementó en toda irradiación pélvica (2,8 veces por 0,5 Gy y 5,3 veces por 2 Gy) en comparación con los controles. El pretratamiento con MMP-8 inhibidor invirtió el efecto de la irradiación en el AUC de 5-FU en el plasma. Nuestros resultados indican que la primera irradiación local modular la farmacocinética sistémica de 5-FU a través de la estimulación de la liberación de MMP-8. La farmacocinética de 5-FU durante la terapia concurrente chemoradiaiton debe comprobar de nuevo y la óptima dosis de 5-FU deben ser reevaluados, y ajustan si es necesario, durante el CCRT
Visto:. Hsieh CH, CY Liu, Hsieh YJ, Tai HC, Wang LY, Tsai TH, et al. (2011) metaloproteinasas de la matriz-8 sistémica media la desfavorable impacto de la irradiación local sobre la farmacocinética de Anti-Cancer Drug 5-fluorouracilo. PLoS ONE 6 (6): e21000. doi: 10.1371 /journal.pone.0021000
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 26 Diciembre, 2010; Aceptado: 18-may de 2011; Publicado: 9 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Hsieh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La radioterapia (RT) se utiliza como un eficaz. modalidad de tratamiento local para inhibir la proliferación celular, inducir la muerte celular y suprimir el crecimiento tumoral [1]. Para mejorar el resultado del tratamiento, tanto en términos de control locorregional y la supervivencia, el uso concurrente de la quimioterapia durante la radioterapia (CCRT) es ahora el tratamiento estándar para diversos tumores malignos, especialmente los cánceres localmente avanzados. Entre los medicamentos que se utilizan para aumentar el efecto de RT, 5-fluorouracilo (5-FU) es uno de los agentes quimioterapéuticos más comúnmente utilizados de CCRT [2], [3], [4], [5].
en el pasado, RT se utilizó únicamente como un tratamiento local y su efecto se estimó por modelo de efecto local [6]. Sin embargo, la evidencia creciente indica que la irradiación tiene efectos directos dañan el ADN dependiente, así como el envío de señales a las células vecinas. Las reacciones de las células no irradiadas que responden a las señales producidas por las células irradiadas vecino se denominan el efecto espectador [7], [8]. Por otra parte, también se reportan efectos de largo alcance que ocurren dentro o entre los tejidos y se denominan abscopal, fuera de campo o respuestas espectador distantes [9]. Varias moléculas juegan un papel en la señalización de espectador que implican respuestas de estrés y la señalización célula-célula, sin embargo, ninguno de ellos es específico de exposición a la radiación. Varios estudios muestran las alteraciones de los niveles de sustancias en plasma en respuesta a la radiación, tales como la interleuquina 6 (IL-6) [10], IL-8 [11], factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) [12], necrosis tumoral el factor α (TNF-α) [13], especies reactivas del oxígeno [14] y especies reactivas de nitrógeno [15]. Sin embargo, no se proporciona una fuerte evidencia de las relaciones causales de estas moléculas. Recientemente, se informó que la irradiación abdominal podría modular significativamente la farmacocinética sistémica de 5-FU a 0,5 Gy, el área fuera del objetivo en la práctica clínica, ya las 2 Gy, la dosis de tratamiento diario para el tratamiento diana en un modelo experimental en ratas [16]. Además, los resultados de una investigación clínica demostró que los pacientes con cáncer colorrectal con menor AUC de 5-FU durante la quimioterapia adyuvante tuvieron una menor supervivencia libre de enfermedad [17]. En conjunto, estas líneas de evidencia apoyan la importancia y necesidad de buscar los mediadores responsables del efecto inesperado de RT locales sobre la farmacocinética sistémica de agentes quimioterapéuticos, tales como 5-FU. En el presente estudio, se investigó posibles mediadores solubles que participan en el efecto de conjunto localizada RT pélvica, con preservación del hígado, sobre la farmacocinética de 5-FU en ratas.
Resultados
parámetros farmacocinéticos del plasma de 5-FU y radiación pélvica toda
Para verificar que la RT locales modula la farmacocinética sistémica de 5-FU, se estableció un modelo experimental utilizando la planificación basada en la TC y la irradiación pélvica en ratas, e integrado en un farmacocinético sistema de ensayo. Curiosamente, se encontró que la irradiación pélvica reduce notablemente el AUC de 5-FU en ratas en un 17,6% a 0,5 Gy (
P = 0,019
) y el 21,5% a los 2 Gy (
P = 0,008
) (Fig. 1A). De especial interés, la radiación a 2 Gy a la rata toda la pelvis simula la dosis diaria de tratamiento de un ser humano, mientras que la radiación de dosis baja (0,5 Gy) simuló la dosis depositada en el generoso, el área fuera del objetivo en la práctica clínica. Como se muestra en la Tabla 1, la irradiación de la pelvis disminuye significativamente el tiempo de residencia (MRT) significa, y por el contrario, aumentó el valor de aclaramiento de 5-FU en comparación con los controles no irradiados. No hubo diferencia significativa en los valores de vida media (T
1/2), la concentración plasmática máxima observada (Cmax) o el volumen de distribución en estado estacionario (Vss) dentro de los grupos probados.
el eje transversal ilustra tiempo en minutos y el eje vertical representa la concentración de 5-FU. (A) Plasma. (B) La bilis. Los datos de cada grupo se recogió de seis ratas.
La bilis parámetros farmacocinéticos de 5-FU y radiación pélvica toda
Se ha encontrado que la irradiación pélvica marcadamente aumentó el AUC de 5- FU en la bilis de ratas en un 25,1% a 0,5 Gy y 30,6% a los 2 Gy (fig. 1B). irradiación pélvica disminuyó significativamente la Cmax y el valor de aclaramiento, y en contraste, el aumento de MRT y Vss de 5-FU, en comparación con los controles no irradiados. De interés, 2-Gy de irradiación disminuyó Cmax, y por el contrario, aumentó MRT (
P
= 0,008) y Vss (
P
= 0,015) de 5-FU en una medida mayor que la de los tratados con 0,5 Gy. No hubo diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de 0,5 Gy y control para la Cmax y Vss. Por otra parte, no hubo diferencias significativas en la T
1/2 se observó entre los tres grupos (tabla 2).
La función hepática después del tratamiento RT o 5-FU
El suero las concentraciones de alanina aminotransferasa (ALT) hubo diferencias significativas entre los tratados con 5-FU, 2Gy tratados, 0,5 Gy seguido de 5-FU-tratada y 2 Gy seguido de 5-FU-grupos tratados y de control (Fig. 2 ).
Las concentraciones en suero de alanina aminotransferasa (ALT) no fueron significativamente diferentes entre todos los grupos analizados. N = 5 para cada grupo.
Las citoquinas responden a RT o 5-FU en el plasma
En comparación con el grupo control, no hubo diferencias significativas entre el RT 2Gy solo , 5-FU solo, RT 0,5 Gy seguido de 5-FU y RT 2 Gy seguido de 5-FU grupo en los niveles de factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) y α factor de necrosis tumoral (TNF-α) ( Fig. 3A y 3B).
(a) El nivel de factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) en el plasma. (B) El nivel de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en el plasma. Los datos de cada grupo se recogió de cinco ratas.
La alteración de factores solubles en el plasma causadas por toda la irradiación pélvica
Para evaluar los cambios en el perfil de factores solubles que participan con irradiación pélvica conjunto, muestras de plasma de rata se recogieron y se sometieron a un ensayo de matriz de anticuerpos de citoquinas (Fig. 4). En comparación con el grupo control (sin tratar) (Fig. 4A) y 5-FU solo grupo (Fig. 4C), los cambios dependientes de la dosis observables en los niveles plasmáticos de factores solubles incluyen la metaloproteinasa de matriz 8 (MMP-8), quimioatrayente de monocitos proteína 1 (MCP-1), factor quimiotáctico de neutrófilos inducida por citoquinas -1 (CINC-1) y el inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1). Entre estos factores, sólo el aumento en el nivel de MMP-8 fue consistente en los experimentos por triplicado. En comparación con los grupos de control, RT 2Gy por sí sola podría aumentar la expresión de MMP-8 por factores de 3,8 (Fig. 4B). Cuando se compara con 5-FU solo grupo, los niveles en plasma de MMP-8 aumentó tanto en la RT 0,5 Gy seguido de 5-FU (Fig. 4D) y RT 2 Gy seguido de 5-FU grupos (Fig. 4E) en una dependiente de la dosis manera por factores de 2,8 y 5,3, respectivamente.
la cantidad de metaloproteinasa de matriz 8 (MMP-8) aumentó en 0,5-Gy y 2-Gy grupos irradiados en comparación con el grupo control. Un mapa de las ubicaciones de los anticuerpos de citoquinas manchado en el chip de proteína se muestra en el lado plano de la figura. cuadrados de puntos indican la localización de MMP-8. Cada citoquina está representado por dos manchas en los lugares indicados. Citoquinas arrays de anticuerpos de ensayo de (A) Grupo de control sin tratar, (B) irradiación pélvica conjunto (RT) con 2 Gy solamente, (C) 5-fluorouracilo (5-FU) solo, (D) RT con 0,5 Gy seguido de 5- FU y (e) RT con 2 Gy seguido de 5-FU. La imagen de matriz de citoquinas representa los resultados de uno de los tres experimentos independientes, que muestran patrones similares de expresión.
Los niveles intracelulares de 5-FU, con o sin recombinante de MMP-8 por cromatografía líquida de alta resolución
Hemos examinado el papel de la MMP-8 recombinante en la concentración intracelular de 5-FU en HepG2 (células derivadas de tumores de hígado humano que poseen perfiles bioquímicos característicos de los hepatocitos normales) sin recibir radiación. No hubo efecto significativo en el AUC de 5-FU entre el 5-FU grupos solos (Fig. 5) recombinante MMP-8 más 5-FU y. Se encontró que la MMP-8 recombinante, no inducida por irradiación, no influir en la concentración intracelular de 5-FU en las células del hígado, imitando a los cambios farmacocinéticos a nivel celular.
Modulación de 5-FU por farmacocinético irradiación fue revertida por la MMP-8 inhibidor
a continuación examinó el papel de la MMP-8 sobre el efecto de la RT sobre la farmacocinética de 5-FU utilizando un inhibidor de MMP-8. Ni el inhibidor de MMP-8 solo ni su vehículo tuvieron un efecto significativo en el AUC de 5-FU en comparación con los controles (Fig. 6). Se encontró que el tratamiento previo con MMP-8 inhibidor atenuó significativamente la disminución de la AUC de 5-FU causada por la irradiación de la pelvis (AUC
irradiación frente a AUC
MMP-8 inhibidor + irradiación era de 3305 frente a 3963 min g /ml,
P Hotel & lt; 0,05). Por otra parte, el valor de aclaramiento disminuido MRT y el aumento causado por la irradiación se invierte completamente mediante el uso del inhibidor de la MMP-8 (Tabla 3).
El área bajo la curva de concentración plasmática frente al tiempo (AUC) de 5-FU 100 mg /kg administradas a las ratas del grupo de control sin solvente del grupo, control con disolvente, toda pélvica irradiación 2-Gy con disolvente, y todo pélvica irradiación 2-Gy con inhibidor de disolvente y MMP-8. El eje transversal ilustra tiempo en minutos y el eje vertical representa la concentración de 5-FU en el plasma. Los datos de cada grupo se recogió de cuatro ratas.
Discusión
Después de la prueba del concepto que la RT locales afectadas farmacocinética sistémica de agentes quimioterapéuticos usando 5-FU como modelo, nos siguiente proyectado para posibles factores solubles responsables de este efecto, que se identificó como MMP-8. MMP-8, también conocida como colagenasa-2 o de neutrófilos colagenasa, es un miembro del subgrupo de la colagenasa intersticial dependiente de cinc de la familia MMP de proteinasas neutras [18]. Hemos demostrado que la MMP-8 poseía bioactividad inesperada en la modulación de la farmacocinética de 5-FU.
Neutrófilos
polimorfonucleares (PMN) son la principal fuente de MMP-8 en humanos y ratones [19], [20]. MMP-8 se almacena en los gránulos de los PMN y se libera en la desgranulación de [21]. Fisher
et al
. [22] informó de que los niveles de proteína MMP-8 en la piel humana se aumentaron aproximadamente 4 veces dentro de las 8 h y permaneció elevada durante 24 h después de la irradiación ultravioleta. El tratamiento de radiación en los sitios portadores de tumores induce la inflamación en el campo irradiado y recluta a los linfocitos T, neutrófilos, linfocitos, macrófagos, células plasmáticas y células dendríticas [18], [23], [24]. Además, la irradiación induce sobre regulación de los genes de las principales quimiocinas proinflamatorias [25]. En el presente estudio, irradiamos toda la pelvis de las ratas, que podrían haber entregado una dosis de radiación a la que circulan los neutrófilos, macrófagos tisulares y de médula ósea y en la pelvis. En conjunto, esto plantea la posibilidad de que la irradiación pélvica podría estimular neutrófilos y /o la otra la ontogenia de células inflamatorias, inducir estrés inflamatorio, y mejorar la secreción de MMP-8 (Fig. 4), así como varios otros mediadores proinflamatorios. Además, varios estudios muestran las alteraciones de los niveles de sustancias en plasma en respuesta a la radiación, tales como TGF-β1 [12] y TNF-α [13]. Por otra parte, el TGF-β podría ser un objetivo para el 5-FU a través de c-Jun NH2-terminal quinasa /activador de la proteína-1 de activación en los fibroblastos humanos [26]. Además, TNF-α implica en la regulación de las enzimas fluoropirimidina de activación, uridina fosforilasa (UPasa), que induce la expresión de genes UPasa con la consiguiente mejora de 5-FU actividad antiproliferativa [27]. Sin embargo, en el presente estudio, los niveles de TGF-β1 y el TNF-α se no aumentaron en el RT sola, 5-FU solo o RT seguido de 5-FU grupos en comparación con el grupo control (Fig. 3A y 3B). Estos datos sugieren que la MMP-8 parece desempeñar un papel importante en la modulación local de inducido-RT de sistémicos farmacocinética 5-FU, pero no a través de estas citoquinas.
Harty MW et al. [28] informó de que MMP8 derivado de células polimorfonucleares juega un papel importante para la reparación de hígado en su modelo de obstrucción biliar reversible. El estudio actual demuestra que la aplicación de RT pélvica o 5-FU no causaría los daños de la función hepática. Por lo tanto, la respuesta de MMP-8 inducida por RT en los fenómenos RT-PK no sería el proceso de infiltración inflamatoria de hígado tales como graves daños causados por obstrucción biliar. Además, no hay diferencias de viabilidad (datos no muestran) y los niveles intracelulares de 5-FU (Fig. 5) para HepG2 5-FU tratada con o sin recombinante de MMP-8. células HepG2 mantienen muchas de las características morfológicas y bioquímicas de los hepatocitos normales, tales como la secreción de la mayoría de las proteínas plasmáticas que se esperan de las células del hígado, incluyendo la apolipoproteína B [29]. El resultado sugiere que la MMP-8 recombinante, no inducida por irradiación, no influirá en las PKs de 5-FU en las células hepáticas y no tiene ninguna toxicidad significativa a la línea celular de hepatoblastoma humano derivado, HepG2. Tomados en conjunto, MMP-8 no puede modular la función del hígado.
Otra cuestión importante es el efecto similar, pero menor medida, de las dosis bajas de RT en 5-FU farmacocinética (Fig. 1). distribución corporal de una dosis baja de RT (0,5 Gy, por ejemplo) en la práctica clínica hace enormemente generoso con las técnicas y modalidades de radioterapia avanzadas, como la radioterapia de intensidad modulada, TomoTherapy helicoidal, rápida radioterapia arco, la terapia de arco modulado volumétrica y otros, en comparación con RT convencional. Si bien acepta los beneficios de la orientación de los tumores y ahorradores de los órganos críticos mediante el uso de estas técnicas avanzadas [30], [31], que se mantiene prudente la generosa, la irradiación de baja dosis podría producir efectos biológicos inesperados o no deseados. Clínicamente, se observó previamente que la dosis baja, fuera del objetivo de radiación recibida por tomotherapy muy conformes podría causar toxicidad grave de los órganos críticos en torno a los objetivos, tales como los pulmones, y causar la radiación neumonitis [32]. Sin embargo, la comunidad médica no tiene conocimiento detallado sobre los efectos biológicos de las dosis bajas generosa RT. Esperamos que este estudio se incrementará nuestro conocimiento de estos efectos y proporcionar un modelo experimental para entender los efectos biológicos de las dosis bajas generosa RT en la era de muy conformes RT.
Cerca del 80% de 5-FU es catabolyzed por el hígado a través de la vía de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) para generar tóxico 5-fluoro-5,6-dihidro-uracilo, mientras que la vía anabólica, a través de fosforribosil transferasa orotato, produce metabolitos activos, incluyendo 5-fluorouridina-5'-monofosfato, 5-fluorouridina, y 5-fluoro-2 'desoxiuridina [33], [34]. La toxicidad global fue dos veces mayor en pacientes con deficiencias de DPD profundos (& lt; 45% de la actividad media DPD de una población de control) en comparación con pacientes con deficiencias DPD moderadas (entre 45% y 70% de la actividad media DPD de una control de la población), según ha informado Milano y los co-autores [35]. Debido a que 10% a 20% de 5-FU se excreta sin cambios en la orina [36], para los pacientes con disfunción renal, la concentración plasmática de 5-FU en no se haga diálisis día es significativamente mayor que en los días de diálisis, y esto puede ser debido a la eliminación de algunos de los factores del plasma por hemodiálisis, que inhiben la actividad de DPD [37]. Además, 5-FU tiene un índice terapéutico relativamente estrecho, se describe una fuerte correlación entre la exposición a 5-FU y ambos hematológica y toxicidad gastrointestinal [38]. Por lo tanto, si el hígado o los riñones caen en el volumen irradiado, [16] DPD, un paso limitante de la velocidad en el catabolismo de 5-FU [39], puede verse afectada por la lesión por radiación en el hígado o los riñones. Sin embargo, en el estudio actual, el hígado y los riñones son excluidos de todo el campo de irradiación de la pelvis (Fig. 7). Además, los niveles de ALT no fueron significativamente diferentes entre el control, 5-FU-tratadas, o grupos RT pélvica con o sin 5-FU. (Fig. 2) Por lo tanto, el efecto de la RT en el AUC de 5-FU observó en este estudio no pueden ser causados por la modulación directa de la función hepática mediante RT o 5-FU
.
El margen craneal se fijó en la parte superior de la cresta ilíaca bilateral para toda la zona pélvica. la radioterapia convencional se utiliza para administrar la dosis de radiación a través de la anterior-posterior (AP) y portales PA.
En comparación con el grupo control, toda la irradiación pélvica disminuyó el AUC de 5-FU en el plasma un nivel estadísticamente significativo (Fig. 1A). En contraste, la irradiación aumentó el AUC de 5-FU en la bilis de forma significativa (Fig. 1B). Esto fue acompañado por una reducción en MRT y el aumento en valor de aclaramiento en el plasma, pero un aumento en MRT y la reducción de valor de eliminación en la bilis. Con respecto a la farmacocinética, esto sugiere que la irradiación pélvica podría facilitar la excreción de 5-FU.
Dado que el uso concurrente de agentes quimioterapéuticos en combinación con conformal localizada RT mejora los resultados del tratamiento clínico para un número creciente de tumores malignos [2 ], [3], [4], [5], nuestros resultados muestran que tanto localizada diana y generosa irradiación-off podrían afectar a 5-FU farmacocinética, y proporciona una razón para considerar el ajuste de la administración de quimioterapia durante la RT curso. El efecto de la RT localizada en la farmacocinética sistémica de agentes quimioterapéuticos o los otros fármacos claramente necesita más evaluación clínica.
Materiales y Métodos
Materiales y reactivos
El 5-FU y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) -Grado metanol fueron adquiridos de Sigma Chemicals (St. Louis, MO, EE.UU.) y Tedia Company, Inc. (Fairfield, OH, EE.UU.), respectivamente. agua de calidad Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) se utilizó para la preparación de soluciones y fases móviles.
Animales y preparación de muestras
edad, ratas Sprague-Dawley macho (300 ± 20 g de peso corporal) fueron proporcionados por el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional Yang-Ming (Taipei, Taiwán). Ellos fueron alojados en un entorno libre de patógenos específicos y tuvieron libre acceso a los alimentos (Laboratorio de Dieta de roedores 5001, PMI Nutrition International, LLC, MO, EE.UU.) y agua. Todos los procedimientos de cirugía en animales experimentales fueron revisados y aprobados por el comité de ética animal de Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwán (MMH-AS-98011).
Las ratas fueron anestesiadas con uretano 1 g /ml y α-cloralose 0,1 g /ml (1 ml /kg por inyección intraperitoneal), y se inmovilizaron sobre un tablero cuando se someten a la tomografía computarizada para la simulación de todo el campo de la pelvis. El margen craneal se fijó en la parte superior de las crestas ilíacas bilaterales para todo el ámbito de la pelvis (Fig. 7). la radioterapia convencional se utiliza para administrar la dosis de radiación a través de la anterior-posterior (AP) y portales PA. Los animales experimentales fueron aleatorizados para el control, 2-Gy solo, 5-FU solo, 0,5-Gy seguido de 5-FU, y 2-Gy seguido de 5-FU grupos. Los datos de cada grupo se recogió de seis ratas.
alométrico escalado de las dosis de radiación (0,5 Gy y 2) entre seres humanos y ratas, respectivamente, era una consideración importante en el estudio. La razón para el uso de 0,5 y 2 Gy para las ratas fue simular el intervalo de dosis correspondiente para el tratamiento diario del torso humano, para la seguridad y facilidad de trabajo, como se informó anteriormente [16]. En pocas palabras, no había comparación directa de la escala alométrica mediante irradiación pélvica conjunto. Sin embargo, la escala alométrica de la dosis letal (LD50) (Gy) de irradiación total del cuerpo para los seres humanos y ratas es 4 Gy y 6,75 Gy, respectivamente [40]. Teniendo en cuenta que esta diferencia es moderado, se decidió utilizar el 0,5 y el 2 Gy para las ratas para simular el rango de dosis correspondiente para el tratamiento diario del torso humano.
Ambre
et al
. [41] estudiaron la eliminación de 5-FU y sus metabolitos después de la administración intravenosa de 5-FU a los 15 y 150 mg /kg a ratas. Los resultados de ese estudio sugieren que la saturación de la vía catabólica ocurrió después de la dosis más alta. Jarugula
et al
. [42] demostraron que el área normalizada de dosis bajo la curva (AUC) fue significativamente mayor después de la administración de 100 mg /kg (media ± desviación estándar, SD, 1,14 ± 0,55 mg · h /L /mg) que después de 50 mg /kg (media ± DE, 0,50 ± 0,16 mg · h /L /mg) o 10 mg /kg (media ± DE, 0,43 ± 0,11 mg · h /L /mg). Por lo tanto, elegimos 100 mg /kg como dosis factible 5-FU en ratas para el examen de los parámetros farmacocinéticos de 5-FU, basado en los informes anteriores [16], [41], [42].
Veinte horas después de RT, las ratas se les administró 100 mg /kg de 5-FU en 2 ml de solución salina normal por infusión intravenosa en la vena femoral durante un período de 2-min [42]. Una muestra de sangre de 150 l fue retirada de la vena yugular con un colector de fracciones de acuerdo con un horario programado en 5, 15, 30, 45, y 60 min, y 1,5, 2, 2,5, y 3 h después de la administración de drogas. Las muestras de sangre se centrifugaron inmediatamente a 3300 ×
g
para 10 min. Se añadió el plasma resultante (50 l) a 1 ml de acetato de etilo en un tubo limpio, vórtex durante 5 min, y se centrifuga a 5900 ×
g
para 10 min. Después de la centrifugación, la capa orgánica superior que contiene el acetato de etilo se transfirió a un nuevo tubo y se evapora a sequedad bajo corriente de nitrógeno. El residuo seco se reconstituyó con 50 l de agua Milli-Q (Millipore). Una parte alícuota de 20-l de la solución se inyecta a la cromatografía líquida-ultravioleta de alta resolución (HPLC-UV) sistema de detección.
alto rendimiento de cromatografía líquida de
se realizó un análisis
cromatográfica en un Modelo LC sistema de HPLC -20AT (Shimadzu, Tokio, Japón) equipado con un detector Modelo SPD-20A de longitud de onda UV, muestreador automático SIL-20AC, y un sistema de procesamiento de datos Solución LC. Una columna LiChroCART RP-18e (Purospher, 250 mm, 5 micras, Merck, Darmstadt, Alemania) con una columna de seguridad LiChroCART 4-4 se utilizó para la separación. La fase móvil compuesta por 10 mM de fosfato de potasio-metanol (99:1, v /v, pH 4,5 ajustado con ácido fosfórico 85%), y la tasa de flujo de la fase móvil fue de 1 ml /min. La longitud de onda de detección se fijó a 266 nm. En estas condiciones, el tiempo de retención de 5-FU fue 5,4 min. La linealidad de las curvas de calibración fue demostrado por los buenos coeficientes de determinación (
r
2) obtenido para la línea de regresión. Buena linealidad se logró en el rango de 0,01 a 5 g /ml, con todos los coeficientes de correlación mayor que 0.998. Todas las muestras estaban recién preparados, incluyendo las soluciones estándar, a partir de la misma solución madre (5 mg /ml). El 0,01-mg /ml límite de cuantificación se definió la concentración más baja de la curva de calibración que se podía medir rutinariamente con sesgo aceptable y SD relativa. La precisión media global, definida por la SD relativa, varió de 0,2% a 11,0%. precisión analítica se expresó como la diferencia porcentual de los valores observados de medias en comparación con concentraciones conocidas que varían de -10,0% a 14,0%. Los resultados de la recuperación de las concentraciones de 0,1-10 mg /ml fueron 92,0% -94,0%
Evaluación de las funciones hepáticas
Se midieron los niveles plasmáticos de alanina aminotransferasa (ALT) para comprobar la influencia de diferentes modalidades de la función hepática por un método colorimétrico estándar utilizando un espectrofotómetro Synchron LX20 (Beckman Coulter) y los reactivos suministrados por el fabricante.
análisis de citoquinas en suero
Los niveles plasmáticos de citoquinas (factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)) obtenido a partir de las muestras de sangre de ratón se analizaron mediante inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (R & amp;.; D Systems) según las instrucciones del fabricante
matriz de anticuerpos de citoquinas
la rata se analizaron muestras de plasma usando el anticuerpo una matriz de citoquinas (RayBio® ratón de citocinas anticuerpo Arrays II, RayBiotech, Inc., Norcross, Ga.) según las instrucciones del fabricante, y como anteriormente se describe [43] para detectar posibles mediadores de la interacción 5-FU-RT. Esta matriz particular, detecta simultáneamente 34 citoquinas murinas. (Fig. 4) Brevemente, las membranas de matriz de citoquinas fueron bloqueados en 2 ml de tampón de bloqueo 1 × para 30 min y después se incubó con 1 ml de muestra de plasma a temperatura ambiente durante 1-2 h. Las muestras fueron luego decantaron de cada recipiente, y las membranas se lavaron tres veces con 2 ml de l × tampón de lavado I, seguido de dos lavados con 2 ml de l × tampón de lavado II a temperatura ambiente con agitación. Las membranas fueron incubadas en 1:250 anticuerpos primarios conjugados con biotina diluido a temperatura ambiente durante 1-2 h y se lavaron como se describe anteriormente, antes de la incubación en 1:1000 diluida peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con estreptavidina. Después de la incubación en estreptavidina conjugada con HRP durante 30-60 minutos, las membranas se lavaron a fondo y se exponen a un sustrato de peróxido (buffers de detección C y D, RayBiotech, Inc.) durante 5 min en la oscuridad antes de formación de imágenes. Las membranas a continuación se expusieron a película de rayos X (película AR Kodak X-OMAT) a temperatura ambiente durante 1 minuto. intensidad de la señal se analizaron con Fuji Film V2.1 Multi Gauge. IgG conjugado con biotina sirve como control positivo a los seis puntos, en los que se utilizó para identificar la orientación de la membrana y para normalizar los resultados de diferentes membranas que estaban siendo comparadas. Para cada punto, la densidad óptica neta se determina restando la densidad óptica de fondo de la densidad óptica en bruto total y la densidad óptica de cada citoquina se representa como un porcentaje del control positivo.
Determinación de intracelular 5- niveles FU, con o sin recombinante de MMP-8 por un alto rendimiento de cromatografía líquida de
para examinar el efecto de la MMP-8 en las células normales del hígado, una línea celular de hepatoblastoma humano derivado, HepG2, se utilizó para simular las células normales del hígado en nuestros experimentos adicionales. Después del tratamiento con 10 mg /ml recombinante MMP-8, más 50 mM 5-FU o 50 mM 5-FU solo, se recogieron las células HepG2 (línea celular de carcinoma hepatocelular humano) cada 10 min hasta 60 min y se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido de centrifugación a 13.000 rpm durante 5 min. Para extraer intracelular 5-FU, una solución de extracción que contiene 0,1% de Triton X-100 en dimetilsulfóxido se añadió a los gránulos de células, y esta suspensión se agitó en vórtex y se centrifugó at13000 rpm durante 5 min. La solución resultante se mezcló con un volumen igual de acetonitrilo para la desproteinización. Los precipitados de proteínas se separaron por centrifugación (13000 rpm durante 5 min), y una alícuota de 20 l del sobrenadante se sometió a análisis de cromatografía líquida de alta resolución como se menciona antes.
Preparación de inhibidor Mediador y experimentar
MMP-8 inhibidor I (Calbiochem, la Jolla, CA) se administró a las ratas para examinar si o no RT modulación de los parámetros farmacocinéticos 5-FU podría ser bloqueado. Brevemente, MMP-8 inhibidor I se disolvió en PEG400 /etanol [04:01 (v /v)] solución, produciendo una final concentración de 5 mg /mL. Dos horas antes de la irradiación, 10 mg /kg de MMP-8 inhibidor I se infundió en la vena de la cola de la rata durante un período de 2 min. Después de eso, las ratas se anestesiaron con uretano 1 g /ml y α-cloralosa 0,1 g /ml (1 ml /kg por inyección intraperitoneal), y se inmovilizaron sobre un tablero de someterse a la tomografía computarizada para la simulación de todo el campo de la pelvis y recibieron irradiación, como se describe anteriormente. Los animales experimentales fueron aleatorizados para controlar sin PEG400 /etanol [(v /v) 04:01] solución (0 Gy), control con disolvente (0 Gy), irradiación pélvica conjunto (2 Gy) con irradiación pélvica disolvente y conjunto (2 Gy) con MMP-8 inhibidor y grupos de disolvente, respectivamente. Después de RT sham RT 20 horas, todas las ratas recibieron (/kg 100 mg) inyecciones y los parámetros farmacocinéticos de 5-FU 5-FU se analizaron. Se recogieron los datos de cada grupo de cuatro ratas.
Farmacocinética y análisis de datos
Los parámetros farmacocinéticos incluyendo las AUC para la concentración en función del tiempo, la eliminación terminal de fase t
1/2, Cmax, MRT, aclaramiento plasmático total y Vss se calcularon utilizando el software de cálculo de farmacocinética WinNonlin Standard Edition, versión 1.1 (Scientific Consulting, Apex, Carolina del Norte, EE.UU.), utilizando un método compartimental.
métodos estadísticos
los resultados se presentados como media ± desviación estándar. Las diferencias en los resultados entre los grupos actuariales se calcularon utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), con comparaciones múltiples post hoc. Todos los análisis se realizaron con el programa SPSS, versión 12.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).