Extracto
TH-302 es un profármaco activado por la hipoxia se sabe que activa selectivamente en las condiciones hipóxicas comúnmente encontrado en los tumores sólidos. Se está evaluando actualmente en ensayos clínicos, incluyendo dos ensayos en adenocarcinomas de páncreas ductal (PDAC). Se realizó el presente estudio para evaluar los biomarcadores de imagen para la predicción y el control de la respuesta de TH-302 eficacia en modelos de xenoinjertos de PDAC. Dinámica contraste (DCE) y difusión ponderada (DW) de formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) se utilizaron para vigilar los efectos agudos en la vasculatura del tumor y la celularidad, respectivamente. Tres xenoinjertos humanos PDAC con respuestas diferenciales conocidas para TH-302 se obtuvieron imágenes de antes y las 24 y las 48 horas después de una sola dosis de TH-302 o el vehículo para determinar si los cambios de imagen presagiaban cambios en los volúmenes tumorales. DW-RM se realizó en cinco valores b para generar coeficiente de difusión aparente de mapas agua (ADC). Para DCE-MRI, un reactivo de contraste clínicamente disponible estándar, Gd-DTPA, se utilizó para determinar el flujo de sangre en la región del tumor de interés. TH-302 indujo una disminución dramática en la constante de transferencia de DCE (K
trans) dentro de las 48 horas después del tratamiento en los tumores sensibles, Hs766T y Mia PaCa-2, mientras que TH-302 no tuvo efecto sobre el comportamiento de perfusión de SU resistente .86.86 tumores. celularidad tumoral, estimada a partir de ADC, se aumentó significativamente 24 y 48 horas después del tratamiento en Hs766T, pero no se observó en los grupos Mia PaCa-2 y SU.86.86. En particular, se observó inhibición del crecimiento de Hs766T inmediatamente (día 3) después de la iniciación del tratamiento, pero no se observó en MiaPaCa-2 tumores hasta 8 días después de la iniciación del tratamiento. Sobre la base de estos hallazgos preclínicos, medidas DCE-MRI de perfusión vascular dinámica y medidas de ADC de densidad celular se sugieren como posibles TH-302 biomarcadores de respuesta en ensayos clínicos
Visto:. Zhang X, Wojtkowiak JW, Martínez GV, Cornnell HH, Hart CP, Baker AF, et al. (2016) MR biomarcadores de imagen para controlar la respuesta temprana a la hipoxia-Activado profármaco TH-302 en xenoinjertos de cáncer de páncreas. PLoS ONE 11 (5): e0155289. doi: 10.1371 /journal.pone.0155289
Editor: Roger Chammas, Universidad de Sao Paulo, Brasil |
Recibido: 11 Junio, 2014; Aceptado 27 de abril de 2016; Publicado: 26 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel, y sus archivos de soporte de información están disponibles a través Figshare (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3179140)
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por: EE.UU. Institutos nacionales de la Salud: R01CA125627, R01CA077575 y U54CA143970; www.nih.gov; los fondos anteriormente se utilizó en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos; Laboratorio de Imagen Moffitt Cancer Center de Pequeños Animales, una instalación central financiado CCSG, CCSG el número de concesión: P30-CA76292; www.moffitt.org; por encima de los fondos se utilizó para una parte de la imagen de pequeños animales. Threshold Pharmaceuticals prestado apoyo en forma de un salario para el autor CPH, pero no tienen ninguna función adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses.: Charles P. Hart y es empleado por un accionista de Threshold Pharmaceuticals. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La tasa de supervivencia a cinco años de páncreas adenocarcinoma (PDAC) es menor que 6% y la mayoría de los supervivientes son aquellos pacientes con una opción quirúrgica. [1-5] por lo tanto, la mayoría de los cánceres de páncreas son tratados sistémicamente con quimioterapia, generalmente gemcitabina (GEM), en combinación con otros agentes. En particular, las terapias dirigidas específicas y productos biológicos como cetuximab, bevacizumab o trastuzumab han demostrado poco efecto contra PDAC. Un régimen de combinación de 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán y oxaliplatino (FOLFIRINOX) aumentó mediana de supervivencia global (OS) a 11,1 meses, en comparación con 6,8 meses para GEM sola [6] Recientemente, nab-paclitaxel (ABI-007;. Nanopartículas de albúmina -paclitaxel; Abraxane) ha mostrado un beneficio significativo de supervivencia en combinación con GEM, y está siendo considerado para el estado de primera línea [7, 8] a pesar de ello, la respuesta sigue siendo única fugaz y, por lo tanto, se necesitan enfoques terapéuticos alternativos.. Una vía prometedora es apuntar el fenotipo del cáncer, tales como la hipoxia, que se observa a menudo en los cánceres de páncreas [9] Esto se investigó en Fase I /II (NCT01833546; NCT02047500). Ensayos de TH-302 en combinación con GEM, que son un ensayo de fase III (NCT01746979) del doblete TH-302 + GEM completa y está en marcha. Además, un estudio de fase I /II de prueba dosis escalada de TH-302 + + GEM Abraxane se ha abierto recientemente combinación triplete (NCT02047500).
La hipoxia tumoral, que se caracteriza por concentraciones de oxígeno reducido, está impulsando un factor significativo fisiología del tumor y la resistencia al tratamiento del cáncer. [10] la principal diferencia con el tejido normal es la matriz de la vasculatura estructurado irregular que se encuentra en los tumores sólidos. La microvasculatura se caracteriza por grandes aberturas en el endotelio y en ausencia de capa de músculo liso, lo que lleva a la permeabilidad mejorada y retención (EPR) de macromoléculas. Estos factores dan como resultado un suministro desequilibrada de oxígeno y nutrientes. Esto exacerba la germinación y el crecimiento ineficiente de nuevos vasos, lo que conduce a una oxigenación del tumor reducida. [11, 12] Aunque varios tipos de cáncer son conocidos por ser hipóxico, los cánceres de páncreas son conocidos por ser profundamente de modo [13] y la hipoxia intratumoral se relaciona con un mal resultado. [14-16] Esto puede ser debido al aumento de los niveles del factor de supervivencia, HIF-1α [15-18], o la selección de los defectos en la maquinaria apoptótica. [17] Además, el efecto de la hipoxia puede no estar mediado exclusivamente por las células cancerosas, pero también puede implicar el estroma. El cáncer de páncreas se caracteriza por los fibroblastos excesivas desmoplásico (células estrelladas), cuya migración, colágeno de tipo I de expresión, y la producción de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) son todos inducida por la hipoxia. [18] Fundamentalmente, los resultados de la hipoxia de un desequilibrio entre el suministro de oxígeno y demanda. regiones tumorales hipóxicas son generalmente resistentes a la quimioterapia citotóxica. En parte, esto se debe a los efectos directos de la hipoxia en la regulación positiva de las vías de supervivencia celular, pero también puede ser debido a déficit de perfusión regional, que dan como resultado tanto la hipoxia y la administración de fármacos sub-terapéutica. [14-16, 19, 20] Además, las células tumorales hipóxicas tienden a ser de reposo, que también conduce a la resistencia a las terapias que se dirigen a la división celular. [21] Debido a la relación entre la hipoxia y la mala respuesta, una solución para la hipoxia -relacionado cáncer es la introducción de profármacos activados por hipoxia (HAP), que se activan selectivamente en condiciones de hipoxia extrema y administrar la quimioterapia de dosis alta en las regiones hipóxicas del tumor con un daño mínimo en el tejido sano.
la preponderancia de la hipoxia en PDAC hace que sea un objetivo atractivo para HAPs [22], que se han desarrollado como una familia de compuestos en los últimos dos decenios. [23] HAPs se convierten en una forma activa en condiciones de oxígeno reducido, ya que están diseñados para someterse a 1 -e
- o 2-e
- bio-reducciones que son reversibles en presencia de oxígeno. Estos pueden ser de forma no específica catalizada por una variedad de oxoreductases, tales como la reductasa de NADPH citocromo p450, POR, o inducible de óxido nítrico sintasa, iNOS. [24] La clase más común de HAP se basa en 2-nitroimidazoles, ejemplificada por TH 302. TH-302 es un HAP de segunda generación que actualmente está siendo probado en 12 ensayos clínicos diferentes de la Fase I-Fase III. TH-302 libera bromo-isofosforamida mostaza (Br-IPM) en condiciones de hipoxia, la inducción de alquilación de DNA y la reticulación. Br-IPM también puede difundirse en las regiones cercanas oxigenados para prevenir la progresión del tumor a través de "efectos espectador". Tanto in vitro e in vivo han demostrado que TH-302 se activa selectivamente en las regiones hipóxicas de tumores y también está presente en el tejido circundante, pero menos que en los tejidos sanos [25]. Los estudios preclínicos sugieren que la TH-302 tiene significativo efecto anti-cáncer cuando se combina con las terapias anti-angiogénicas. [26]
regiones
hipóxicas se caracterizan a menudo por los buques altamente desorganizadas, dilatados y tortuosos. [27] Este patrón caótico puede ser resultado de desequilibrios de mediadores angiogénicos tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiopoyetinas. los vasos del tumor altamente permeable pueden afectar citoquinas y factores angiogénicos, que puede alterar dinámicamente la estructura de las paredes de microvasos. [28] La acumulación de pruebas ya ha demostrado que la permeabilidad vascular es más probable elevada en regiones hipóxicas. [27] Por lo tanto, probatorio y concordancia empírica entre permeabilidad de los vasos y la hipoxia se establece. DCE-MRI utiliza el modelado cinético de reactivos de contraste inyectados para caracterizar la perfusión. [29] Se puede obtener información sobre el flujo, el volumen, y lo más importante la permeabilidad de los vasos. Por lo tanto, es conveniente asumir que DCE-MRI podría ser un biomarcador sustituto útil de hipoxia. [30]
Difusión ponderado MRI (DW-MRI) detecta cambios relativamente pequeños en la estructura del tejido a nivel celular basan en la aplicación de gradientes de detección del movimiento que puede rastrear el movimiento de los protones del agua. Muchos estudios preclínicos han demostrado que DW-RM tiene un enorme potencial para el seguimiento de los cambios tempranos en la celularidad del tumor que pueden relacionarse con la respuesta al tratamiento. [31] La combinación de DCE y DW-RMN puede proporcionar una información más precisa para el diagnóstico precoz y la detección de la respuesta terapéutica temprana . [32] Por otra parte, estos dos métodos de imagen se despliegan fácilmente en los protocolos clínicos diarios. Como tal, es muy probable que los resultados de este estudio podrían traducirse fácilmente a ensayos clínicos adicionales.
Los estudios anteriores han demostrado xenoinjertos de tumores derivados de la línea celular de cáncer pancreático humano SU.86.86 son altamente vascularizado y bienestar perfundido en comparación con tumores derivados de la línea celular Hs766T. [33] por lo tanto, las regiones hipóxicas observados en los tumores Hs766T son más grandes que los observados en SU.86.86, mientras que los tumores derivados de Mia línea celular PaCa-2 son hipóxico a un nivel medio. Como hipoxia se considera que es un factor limitante para TH-302 de actividad, se ha demostrado experimentalmente que los tumores derivados de Hs766T son muy sensibles a TH-302 y que los tumores SU.86.86 derivados son altamente resistentes, con Mia PaCa-2 exhibición . sensibilidad intermedia [34] el presente estudio comparó la eficacia de TH-302 en estos modelos de xenoinjertos de cáncer de páncreas con las mediciones de la perfusión del tumor y la celularidad mediante el uso de dos métodos de imagen:. DW-RM y RM-RT
Materiales Métodos y
cultivo de células
p>
2.
xenoinjertos
Todos los procedimientos fueron realizados de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de Recursos (1996 ), Consejo Superior de Investigaciones Científicas, y aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Florida del Sur bajo el protocolo aprobado R4033. ratones inmunodeficientes fueron alojados en una instalación limpia, con condiciones especiales que incluyen filtrado HEPA sistemas de jaulas ventiladas, ropa de cama en autoclave, la vivienda, el agua tratada en autoclave autoclave, irradiado procedimientos especiales de la jaula cambiando la Alimentación. Los ratones fueron manipulados en condiciones asépticas, como el uso de guantes, batas y cubiertas para zapatos. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO
2 de un tanque a presión en una cámara de ratón.
ratones hembra SCID de edad 5-6 semanas se inocularon con SU.86.86, Hs766T o células Mia-PaCa2 (5x10
6) por vía subcutánea en la pata trasera izquierda. Los tumores se dejaron crecer durante un promedio de tres semanas a un tamaño medio de ~ 150 mm
3, como se estima usando calibradores electrónicos y volúmenes de los tumores se calculan como π /6 [(eje corto en mm)
2 x ( eje largo en mm)]. Los ratones fueron aleatorizados y se colocan en cohortes y se trataron con solución salina (control) o TH-302 (50 mg /kg) inyectados por vía intraperitoneal. Los ratones se obtuvieron imágenes como se describe en la sección de métodos de formación de imágenes por resonancia magnética. Un total de 34 ratones se sometieron a estudios de imagen de RM. El grupo constaba de 5 SU.86.86 TH-302 tratada y 5 animales de control; Mia-PaCa2 constaba de 6 animales tratados y de control 5-302 TH; Hs766T consistía en 7 TH-302 tratado y 6 animales de control. No se observó ninguna pérdida significativa de peso de los animales durante este estudio. Los animales fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron 2000 mm
3.
Imaging
Tanto RM-RT y DW-RMN se llevaron a cabo 24 horas antes de la (TH-302 o vehículo) de tratamiento, DW-RM fue programado 24 horas y 48 horas después del tratamiento. Con el fin de garantizar el tiempo necesario para el agente de contraste de lavado y recuperación fisiológica, DCE-MRI se realizó sólo 48 horas después del tratamiento. Todos los experimentos de MRI se realizaron con un escáner de Varian 7 T MRI equipado con una amplitud máxima de gradiente de 400 mT /m. Todos los animales fueron anestesiados por inhalación de isoflurano (1,5% en O2) en 2,0 LPM y se canuló en la vena de la cola. Un globo de presión-transductor pegado en el pecho del animal se utiliza para supervisar continuamente su tasa de respiración. Las temperaturas corporales fueron controlados continuamente usando un termómetro rectal fluoróptico (® SAII
, SA Instruments, Stony Brook, Nueva York). Un calentador externo se utilizó para mantener la temperatura corporal a 37,0 ± 0,2 ° C y la frecuencia respiratoria se monitorizó a una gama de 60-90 respiraciones minutos pre durante el curso de los experimentos de formación de imágenes. El animal fue asegurado suavemente en un soporte de plástico y se carga en un 35-mm-ID de imagen de pequeños animales Litz bobina (Doty Scientific, Columbia, SC, EE.UU.). sesión de MRI, tanto para la exploración DCE- y DW-RM fue de 1,5 horas aproximadas; 0,5 horas por sólo DW-RM sección.
protocolo RM-RT incluye T
2-ponderados imágenes de vista anatómico del tumor, mapas paramétricos de endógena T
1 tiempo de relajación y una serie de T imágenes
1-ponderado que traza el cambio dinámico de agente de contraste incluyendo FIA y lavar de entrada y salida privado en el sitio del tumor. imágenes T
2-ponderados fueron adquiridas mediante una secuencia de pulso rápido spin eco (FSE) con un factor de eco de 4, dando una efectiva TE de 72 ms. método de recuperación de saturación para T
1 mapeo con cinco tiempo de recuperación diferentes valores (TR) fue adquirido antes de la inyección del agente de contraste (TR = 5000, 2000, 800, 300, 150 ms, TE = 7,2 ms, FOV = 35 x 70 mm, matriz = 128 x 256, la resolución espacial = 273 x 273 micras). Nueve 1 mm de espesor cortes coronales se orientaron sobre el tumor y la arteria para asegurar una función de entrada arterial válido (AIF). El animal fue fijado firmemente con cinta adhesiva para evitar artefactos de movimiento. Antes, durante y después de la administración en bolo de una dosis única de CA (0,15 mmol /kg de Gd-DTPA), una serie dinámica de eco de espín imágenes
1 ponderados-T (TR = 150 ms, TE = 7,2 ms) fueron adquiridos por 35 minutos. datos de DCE-MRI se procesaron utilizando un modelo cinético general que se describe por Tofts et al. Una descripción completa de estos métodos se ha descrito anteriormente. [29, 35]
DW-RM se realizó para medir los valores de ADC con cuantitativos misma geometría que la RM-RT. parámetros de la secuencia incluyen cinco valores b: 12, 50, 500, 800, 1500 s /mm
2 con TR = 1500 ms y TE = 35; Seis promedio se utiliza para reducir los artefactos de movimiento. ADC mapas fueron generados por un programa hecho en casa Matlab que se ajuste a valores b de la ecuación Stejskal-Tanner, S = S
0 * EXP (-b * ADC), donde S
0 es la amplitud de la señal sin ponderación de difusión y S es la amplitud de la señal con ponderación de difusión.
las regiones de interés (ROI) se determinaron por T imágenes
2w con exactamente el mismo geometría de DCE- y DW-RM de adquisición. Estas regiones de interés se superponen en los datos DCE- y DW-MRI para minimizar la variación del factor antrópico. Se obtuvieron histogramas de distribución para cada ROI tumorales de DCE- o DW-RM. Los datos se presentan como la media y su error estándar. pruebas t de Student, ANOVA se utilizaron en su caso. P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
La inmunohistoquímica
Tras la finalización de los protocolos terapéuticos y de formación de imágenes de resonancia magnética, clorhidrato pimonidazole. (60 mg /kg; Hypoxyprobe Inc.) se inyectó I.P. una hora antes de la extirpación del tumor, posteriormente fijado en formalina al 10%, embebidos en parafina, y además procesados para inmunohistoquímica. Tumorales secciones transversales se tiñeron con un anticuerpo primario de conejo contra la gamma-H2AX (Novus Productos Biológicos, Littleton, CO) y el anti-anticuerpo secundario de conejo Ventana OmniMap (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). tejido pimonidazole positivo se detectó usando antisuero de conejo contra clorhidrato pimonidazole (2627; Hypoxyprobe Inc.). El sistema de detección utilizado fue el ChromoMap Kit Ventana. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina & amp; eosina y analizar con la Aperio ScanScope XT.
Resultados
Los parámetros cinéticos de la RM-RT para cuantificar la perfusión del tumor se calcularon sobre una base de pixel-sabia aplicando el modelo Tofts como se describe en [ ,,,0],35]. Representativos K
mapas trans para cada tipo de tumor se muestran en la figura 1. Las regiones de interés tumorales (regiones de interés) se identificaron con T
2-imágenes ponderadas en todos los cortes, y se utiliza para delinear píxeles para los análisis de histograma. Como se muestra por los histogramas, la K
trans generados a partir de Hs766T representativa y Mia-PaCa-2 tumores se redujeron dramáticamente 48 h después del tratamiento TH-302, en comparación con los valores pre-tratamiento. No hubo cambios significativos observados por unos tumores SU.86.86 en el mismo punto de tiempo (figura 1). Aunque un individuo en el grupo de SU.86.86 tuvo una disminución significativa después del tratamiento TH-302 (48 h), los cambios de medias entre los grupos de comparación no fueron estadísticamente significativas. Cursos temporales de medios K
trans valores normalizados se muestran en la figura 2 (a). Los valores medios de normalizado K
trans disminuyeron 69,2% para los ratones tratados con TH-302 en los tumores Hs766T, disminución de 46,1% para Mia PaCa-2 tumores y el aumento de 4,9% en SU.86.86 tumores. Ambos cambios para Hs766T y Paca-2 grupos de tratamiento Mia fueron estadísticamente significativas (
P Hotel & lt; 0,01) en comparación con su propio grupo de control. Por el contrario, el aumento del valor medio para el grupo SU.86.86 no fue estadísticamente significativa (
P
= 0,15). Estos cambios en la perfusión vascular correlacionados con cada respuesta terapéutica líneas celulares de TH-302 [36].
Como se ha demostrado en el histograma, K
trans generada a partir de Hs766T y Mia-Paca-2 tumores se redujeron drásticamente 48 horas después del tratamiento TH-302 en comparación con los valores pre-tratamiento. No hubo cambios significativos observados para un ratón SU.86.86 en el mismo punto de tiempo.
A) cursos temporales de medios K
trans valores normalizados. Los valores medios de normalizado K
trans disminuyeron 69% para los ratones tratados TH-302 en los tumores Hs766T, disminución de 46% para Mia PaCa-2 tumores y el aumento de 5% en SU.86.86 tumores. B) Los cambios en los valores de ADC tumoral medio normalizado a través del tiempo. Se observó un aumento sustancial en ADCs medios relativos para el grupo tratado TH-302 en posteriores 24 y 48 horas (29% cada vez durante 24 h, p & lt; 0,01; 17% aumentando durante 48 h, p & lt; 0,01). MIA PaCa-2 no es estadísticamente diferente significativa entre los grupos realizados (8% cada vez mayor de 24 horas,
P
& gt; 0,05; 4% aumentando durante 48 h, p & gt; 0,05). Para SU.86.86, ningún cambio significativo fue detectado por DW-MRI, tanto para TH-302 y el grupo de control (3% disminuyendo durante 24 h, p & gt; 0,05; 0,5% aumentando durante 48 h, p & gt; 0,05). La normalización se calcula el promedio de la diferencia de tratamiento previo y posterior en relación al grupo Th302 promedio de la diferencia de tratamiento previo y posterior en el grupo de control. Las barras de error representan la desviación estándar.
DW-RM se utilizó para cuantificar la celularidad, y también se utilizó para detectar la respuesta de los tres xenoinjertos tumorales para TH-302. Seis promedios de DW-adquisiciones se utilizaron en este estudio para reducir el potencial de un artefacto de movimiento. mapas de ADC de animales representativos en diferentes puntos de tiempo de tratamiento previo y posterior se muestran en la figura 3. Al igual que con los datos de DCE, imágenes T2 se utilizaron para delinear ROI tumor, y los píxeles circunscritos a continuación, utilizados para generar histogramas. Los cambios en los valores de ADC tumor medio normalizado a través del tiempo se presentan en la figura 2 (b). Se observó un aumento sustancial en los ADC medias relativas de los tumores Hs766T tratados TH-302 a las 24 hy 48 h post-tratamiento (aumento del 29% durante 24 h, p & lt; 0,01; aumento del 17% durante 48 h, p & lt; 0,01). Para SU.86.86, no hay cambios significativos se detectaron por DW-MRI, tanto para los grupos de control TH-302 y (3% de disminución durante 24 h, p & gt; 0,05; aumento de 0,5% durante 48 h, p & gt; 0,05). Aunque parecía que había un aumento de la ADC de MiaPaCa-2 a las 24 h en comparación con el subgrupo vehículo (8%, P & gt; 0,05), estos cambios no fueron estadísticamente significativamente diferentes de los controles del vehículo
A de forma espectacular. el aumento de los ADCs observados en Hs766T, pero no en los otros dos tipos de tumores.
los cambios estadísticamente significativos en K
trans se observaron en Hs766T y Mia Paca-22 tumores tratados con TH-302 para 48 h post-tratamiento según lo determinado por RM-RT. K
trans se mantuvo sin cambios en SU.86.86 tumores (figura 1). El efector activa de TH-302 es un agente de reticulación de ADN previamente demostrado que aumenta nuclear γ-H2AX, un biomarcador clave para las vías de respuesta al daño del ADN, in vivo después de tan poco como 6 horas TH-302 terapia mensaje en modelos de tumores de páncreas [ ,,,0],37], lo que implica primeros cambios en la permeabilidad vascular observados en este estudio pueden ser una consecuencia de TH-302 citotoxicidad. Para dibujar una relación entre los cambios de permeabilidad y la actividad TH-302, secciones transversales tumorales de los tres grupos de tumores fueron evaluados por inmunohistoquímica para la expresión H2AX γ (Figura 4A). -H2AX Γ Nuclear se incrementó en TH-302 tratadas PaCa-2 tumores Hs766T y Mia en comparación con el control de solución salina. No se observó ningún cambio detectable en la tinción de γ-H2AX entre Su.86.86 tratados y los tumores tratados con solución salina. El principal determinante de la activación TH-302 y eficacia es la hipoxia tumoral. Detección inmunohistoquímica de pimonidazole, un marcador de hipoxia física, mostró una mayor tinción en TH-302 Hs776t sensible y Mia PaCa-2 tumores en comparación con TH-302 tumores SU.86.86 resistentes (Fig 4B) de apoyo patrones de expresión de γ-H2AX siguiente TH-302 tratamiento. Estos datos apoyan los cambios tempranos en Hs766T y Mia Paca-2 de la perfusión del tumor a las 48 horas, posiblemente, podría ser debido a los efectos citotóxicos de TH-302.
(A) tinción histológica de γ-H2AX, un marcador de ADN mecanismos de respuesta a daños en los tumores, PDAC antes y 48 h post-TH-302 de tratamiento (50 mg /kg). Expresión de -H2AX γ se incrementó en TH-302 tratadas PaCa-2 tumores Hs766T y Mia en comparación con el control de solución salina. No se observó ningún cambio detectable en la tinción de γ-H2AX entre Su.86.86 tratados y los tumores de solución salina. (B) tinción pimonidazole como biomarcador de la hipoxia tumoral física. Pimonidazole Clorhidrato se inyectó 2 horas antes de la extirpación del tumor. El grado de hipoxia fue mayor en los tumores Hs766T y menos en SU.86.86 con Mia Paca-2 tumores moderadamente hipóxica. Estas imágenes son imágenes representativas de cada tipo de tumor. Las barras de escala = 200 mM.
Discusión
La eficacia de TH-302 está influenciada por múltiples factores, tales como la permeabilidad del vaso y el nivel de la hipoxia en una región determinada. [38] Tener la capacidad de medir los cambios en estos parámetros con el tiempo en respuesta a activado TH-302, es crítico. Tales cambios se pueden utilizar para evaluar la respuesta terapéutica. no de imagen actuales o métodos invasivos se limitan para su uso in vitro, mientras que biomarcadores de imagen pueden dar mediciones cuantitativas de la progresión o regresión del tumor, sin alterar significativamente el microambiente. Las dos modalidades de resonancia magnética utilizados en este estudio, RM-RT y DW-MRI, pueden satisfacer tanto por separado estos requisitos basados en mapas paramétricos observables, que proporcionan información sobre la vasculatura y celularidad, respectivamente. Además, la mayoría de los tumores son conocidos por ser heterogéneo, y especialmente en el cáncer de páncreas. Por lo tanto, de gran interés que la información espacial se puede evaluar cuantitativamente sobre una base de pixel por pixel es. [39] hipoxia del tumor es el factor de predicción más fuerte de respuesta tumoral a HAP y se puede medir en los pacientes utilizando imágenes de PET de 18 F marcado con 2 trazadores -nitroimidazole (F-mISO, FAZA, HX4). Sin embargo, las imágenes de PET hipoxia es todavía experimental. Por el contrario, las medidas de RM de perfusión desajuste de difusión pueden ser cuantitativamente relacionadas con la hipoxia. [24]
Este estudio se centró en la identificación y comparación de biomarcadores de imágenes de RM para la detección de la respuesta temprana a TH-302 en la terapia sensibles y resistentes modelos de tumores PDAC. El trabajo previo de nuestro grupo había demostrado que MiaPaCa-2 tumores respondieron a TH-302 con una ligera pero significativa disminución de K
trans, sin efecto sobre la ADC [30]. Estos resultados fueron confirmados aquí. Los resultados de la RM-RT mostraron una clara disminución de K
trans en ambos Paca-2 modelos Hs766T y Mia, que son significativamente más hipóxica, en comparación con SU.86.86 tumores, que no respondieron a TH-302 con un cambio en volumen o un cambio en K
trans. En consonancia con el trabajo previo, Hs766T fue confirmado por inmunohistoquímica pimonidazole (figura 4) para tener la mayor fracción hipóxica entre estos tres modelos; Mia PaCa-2 fue intermedia hipóxico y SU.86.86 tiene hipoxia mínimo en comparación con los otros dos. [40] Por lo tanto la reducción de la permeabilidad puede ser la consecuencia de la activación TH-302 en las condiciones de bajo oxígeno que resulta en la inhibición de la señalización de VEGF. Esto es lo opuesto como se ve en los tejidos tumorales no hipóxicas. El grado de cambios en la permeabilidad puede directamente estar relacionado con el grado de región hipóxica. Este resultado corrobora los resultados anteriores indican que TH-302 es más eficaz en tumores hipóxicos [36]
Los dos métodos de formación de imágenes MR utilizados en este estudio son fundamentalmente diferentes:. Parámetros cinéticos evaluados de DCE-MRI evaluar los cambios vasculatura, mientras que los valores de ADC provistos por DW-RM reflejan cambios en la densidad celular. El DCE-MRI refleja la permeabilidad (o flujo) los cambios que pueden resultar de los efectos citotóxicos sobre las células tumorales hipóxicas y la reducción de la producción de VEGF por la activación de TH-302, mientras que DW-RM es una medida indirecta de las consecuencias celulares que presumiblemente se producen siguiente el cambio vasculatura. [30] Curiosamente, se observó que el cambio ADC sólo fue significativa en los tumores Hs766T más sensibles, pero no en los otros dos modelos. La falta de cambio en la ADC en SU.86.86 es consistente con la falta de efecto de TH-302 sobre el crecimiento tumoral, y la relativa falta de hipoxia en este modelo. Curiosamente, Mia Paca-2 también no mostraron una respuesta de difusión a TH-302, a pesar del hecho de que el crecimiento tumoral fue inhibido. Esto era consistente con las observaciones anteriores que utilizan esta línea de tumor. [30] En particular, el efecto de la terapia TH-302 sobre el crecimiento tumoral MiaPaCa-2 no fue aparente hasta el día 8 de tratamiento, mientras que el efecto sobre Hs766T fue inmediata. Por lo tanto, el cambio en el ADC puede ser capaz de presagiar cambios de volumen del tumor que se producen uno o dos días más tarde, pero no cambia 6 días más tarde.
La selección de una función de entrada arterial (FIA) afecta directamente a los parámetros cinéticos generada por el modelo Tofts. Factores para la estimación FIA pueden inducir a errores, incluidos los efectos de volumen parcial, de baja resolución temporal y espacial, bajo contraste a ruido (CNR) y en muchos casos de DCE-MRI, una mala elección de las arterias principales en el campo de visión y de movimiento artefactos. En este estudio, la medición directa de la sangre arterial era un reto, dado el movimiento respiratorio durante la adquisición MR. A pesar de que los artefactos de movimiento y baja SNR podrían reducirse mediante la aplicación de una función de ajuste de spline temporal y un núcleo de Gauss espacial para suavizar los datos de los análisis de pixel-sabia, la selección de la FIA retorno de la inversión juega un papel importante para el resultado final, como se discute en [ ,,,0],35]. Este ha sido el tema más común que afecta a la reproducibilidad de DCE-MRI, por lo tanto gran barra de error observado en los resultados de DCE-MRI. A pesar de estas limitaciones, RM-RT fue capaz de discernir las diferencias en la respuesta TH-302, entre los tres tipos de tumores, de manera que fue consistente con los hallazgos histológicos.
vasculatura tumoral es siempre cambiante en parte como respuesta a la alta las concentraciones de VEGF tumorales causando aberrante neo-vascularización [41] y el estrés en fase sólida resultante en la compresión de la vasculatura frágil [42], los cuales contribuyen a la reducción del flujo sanguíneo. En este estudio, que mide los cambios tempranos en la perfusión del tumor después del tratamiento TH-302. Para eliminar la posibilidad de que los cambios en la perfusión del tumor después TH-302 son el resultado de la naturaleza dinámica normal de la vasculatura del tumor, secciones transversales tumorales fueron teñidas histológicamente para -H2AX γ nuclear, una proteína implicada en las vías de respuesta al daño de ADN [43], una medida de TH-302 citotoxicidad. Como era de esperar, TH-302 tumores sensibles, Hs766T y Mia PaCa-2, presentado con un aumento de -H2AX γ nuclear comparación con el control de tumores. No se observó ningún cambio significativo en la perfusión del tumor o γ nuclear -H2AX en SU.86.86 tumores, TH-302 resistente. Estos cambios de soporte de datos en la perfusión tumoral medida por RM-RT puede ser utilizado como un biomarcador de respuesta temprana para el tratamiento TH-302.
En conclusión, nuestros estudios sugieren que los cambios en la perfusión del tumor medido por RM-RT puede tener potencial como un biomarcador precoz del TH-302 farmacodinámica y que DW RM es un biomarcador potencial para la respuesta del volumen tumoral final.