Extracto
Tonterías mediada por mRNA decadencia (NMD) degrada mRNAs mutantes que contienen prematuro codón de terminación (PTC-ARNm ). Aquí se evalúa la consecuencia de la actividad NMD en los cánceres colorrectales (CRC) que muestran inestabilidad de microsatélites (MSI) cuya progresión está asociado con la acumulación de PTC-mRNAs que codifican proteínas inmunogénicas debido a mutaciones de desplazamiento del marco en la codificación de secuencias de repetición. La inhibición de UPF1, uno de los principales factores de NMD, se logró por siRNA en la línea celular MSI CRC HCT116 y los cambios resultantes en la expresión génica se estudió utilizando microarrays de expresión. El impacto de la actividad NMD también fue investigado en los CRC MSI primarias mediante la cuantificación de la expresión de varios ARNm relativos a su estado mutacional y a UPF1 endógena y la expresión UPF2. la inmunidad del huésped contra las células cancerosas desarrollado MSI fue apreciado por la cuantificación de la cantidad de linfocitos CD3ε-positivos infiltrantes de tumor (TIL). silenciamiento UPF1 llevó a la sobre regulación de 1251 genes en HCT116, entre los cuales una proporción de ellos (es decir, 38%) significativamente mayor de lo esperado por casualidad contenía un microsatélite de codificación (
P
& lt; 2 × 10
-16). En MSI CRC primarias, UPF1 se expresó en off significativamente en comparación con la mucosa normal adyacente (
P Hotel & lt; 0,002). Nuestros datos proporcionan evidencia de la descomposición del diferencial de PTC-ARNm en comparación con los de tipo salvaje que se correlaciona positivamente con UPF1 nivel de expresión endógena (
P
= 0,02). Se observó un efecto negativo de la expresión de UPF1 y UPF2 sobre la respuesta anti-tumor del huésped (
P
& lt; 0,01). En general, nuestros resultados muestran que NMD influye profundamente en la tumorigénesis MSI-impulsado a nivel molecular e indicar un impacto negativo funcional de este sistema sobre la inmunidad anti-tumor cuya intensidad se ha demostrado de forma recurrente a ser un factor independiente de resultado favorable en CRC.
Visto: El-Bchiri J, Guilloux A, Dartigues P, Loire E, D Mercier, Buhard O, et al. (2008) absurdo mediada por mRNA decadencia Impactos MSI-Driven carcinogénesis y la inmunidad antitumoral en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 3 (7): e2583. doi: 10.1371 /journal.pone.0002583
Editor: Cathal Seoighe, Universidad de Ciudad del Cabo, África del Sur Corea
Recibido: April 2, 2008; Aceptado 28 de mayo de 2008; Publicado: 9 Julio 2008
Derechos de Autor © 2008 El-Bchiri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Asociación para la Investigación del cáncer contre le (número de crédito 3946). JEB, EL y PDLG fueron receptores de una beca del Ministerio Francés de la Recherche (MRT)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Tonterías mediada por mRNA decadencia (NMD) es un mecanismo de vigilancia mRNA conservadas evolutivamente que reconoce y elimina mRNAs aberrantes que albergan los codones de terminación prematuros (PTC), evitando así la acumulación de proteínas truncadas potencialmente deletéreos en células eucariotas [1]. Después de pre-mRNA de empalme, NMD objetivos son reconocidos a través de un complejo de unión exón-multiproteicos (EJC) que se deposita 24 nucleótidos aguas arriba de cada exón-exón cruce. Como regla general, se ha establecido que los ARNm aberrantes que contienen PTC se encuentra ya sea de menos de 50-55 nucleótidos cadena arriba de la última unión exón-exón o en el último exón no son degradados por NMD (NMD-irrelevante) [2]. El núcleo de efectores NMD comprende las proteínas conservadas evolutivo de la UPF, UPF1 /arriendo1, UPF2 /rent2, y dos parálogos UPF3, UPF3 (también llamado UPF3a) y UPF3X (también llamado UPF3b). UPF1 es una helicasa de ARN cuya actividad está regulada por ciclos de fosforilación /desfosforilación. La fosforilación de UPF1 requiere UPF2 y UPF3 y es catalizada por SMG1, una proteína quinasa relacionada con la familia phosphoinositide-3-quinasa. fosforilación UPF1 por SMG1 se ha demostrado que es la etapa limitante de la velocidad en NMD [3], [4]. Es de destacar que la actividad SMG1 no sólo se dedica a NMD sino que también desempeña un papel en la señalización de daños en el ADN y la reparación, en particular mediante la fosforilación de p53 [5]. Desfosforilación de UPF1 está mediada por SMG5, SMG6 y SMG7, tres proteínas que actúan como adaptadores entre fosforilada 2A UPF1 y proteína fosfatasa [3]. función UPF1 es crucial en la NMD, mientras UPF3 y UPF3X son parcialmente redundantes [6] y UPF2 es prescindible en algunos casos que sugieren la existencia de una vía de NMD UPF2-independiente [7]. UPF1 actúa no sólo en la degradación mediada por NMD de transcritos aberrantes, sino también en la decadencia fisiológica de varios mRNAs, la regulación de la expresión de 3-10% del transcriptoma [8], [9]. El silenciamiento de UPF1 y en menor medida UPF2 se ha informado de modular el nivel de expresión de un número de sustratos fisiológicos de NMD, incluyendo transcripciones con marcos de lectura abierta aguas arriba de la región 5 'no traducida, transcripciones que contienen un intrón dentro de su extremo 3' región no traducida, así como transcripciones de derivado de transposón o retrovirus endógenos [8], [10]. NMD también se ha propuesto para desempeñar un papel en la regulación de eventos de empalme alternativos, ya que los análisis basados en la secuencia predicen que alrededor del 35% de eventos de empalme alternativos de mamíferos producen PTC que contienen variantes de corte y empalme. Sin embargo, recientemente se ha informado de que la mayoría de las variantes de empalme PTC que contienen se producen a bajos niveles en células humanas, con independencia de la acción de NMD, lo que sugiere que la mayoría de estos eventos PTC-introducción no están bajo presión de selección positiva y por lo tanto no son espera que contribuyan importantes roles funcionales [11].
hasta la fecha, las consecuencias de la actividad NMD se han investigado sobre todo en las enfermedades hereditarias monogénicas, incluyendo tumores hereditarios [12]. NMD ha informado para proteger a los portadores heterocigotos de los efectos perjudiciales de algunas PTC-mRNAs aberrantes que codifican proteínas truncadas con la actividad dominante negativo [12]. Por el contrario, se ha propuesto incapacidad NMD en la degradación de las transcripciones NMD-irrelevantes para favorecer la expresión fenotípica de las enfermedades hereditarias dominantes [12]. Debido a que las células cancerosas son genéticamente inestables y se acumulan numerosas mutaciones frameshift somáticas en los genes con un papel esperado en la transformación celular, se ha propuesto el sistema de NMD para jugar un papel en el desarrollo de tumores [12]. Sin embargo, la evaluación de su impacto global en este proceso no ha sido bien descrita y sigue siendo difícil de definir ya que depende de la naturaleza y el número de mutantes acumulados en las células cancerosas durante la progresión tumoral. Hasta la fecha, la inhibición NMD ha sido utilizado con éxito como un
in vitro
estrategia para descubrir nuevos genes relacionados con el cáncer que albergan truncando mutaciones, lo que sugiere que es cierto que puede tener un papel en favorecer la selección de algunos eventos mutacionales frecuentes en diversos tipos de tumores [13]. Es de destacar que la actividad NMD ha demostrado ser muy variable, lo que lleva a la descomposición incompleta y diferencial de mRNAs NMD-pertinentes supuestamente contienen un PTC (referido como NMD-escape) [14], [15], [16].
MSI tumores que albergan deficiencia en MMR (MMR) son frecuentes en los seres humanos. Ellos representan aproximadamente 15% de los colorrectal esporádico, gástrico y tumores de endometrio e incluyen neoplasias que surgen en el síndrome hereditario Polyposis cáncer no colorrectal (HNPCC). Decenas de mutaciones que afectan a genes que contienen la codificación secuencias de repetición se ha informado en estos tumores, la definición de la denominada vía de mutador cuyo papel se sospecha que es crucial en la tumorigénesis impulsado por MSI [17]. Hasta la fecha, un gran número de publicaciones han reportado mutaciones de cambio en los genes implicados en diversos procesos biológicos tales como la regulación del ciclo celular (por ejemplo,
TGFBR2
,
IGF2R
,
TCF4
,
AXIN2
,
PTEN
,
RIZ
), la apoptosis (por ejemplo,
BAX
,
CASP5
,
BCL10
,
APAF1
,
FAS
), reparar el daño del ADN (por ejemplo,
ATR
,
DNA-PKcs
,
RAD50
,
MSH3
,
MSH6
,
MBD4
,
MLH3
,
BLM
,
CHK1
) y otros [17]. Recientemente hemos informado de que la descomposición de ARNm de mutación derivada del marco de lectura después de
in vitro
silenciamiento de UPF1 y /o UPF2 en un panel de líneas celulares de CRC era MSI diferencial e incompleta [14]. Si no están degradados completamente, ARNm mutante de desplazamiento del marco codifican proteínas que contienen colas C-terminal aberrantes, entre los cuales algunos han sido mostrados para mostrar las propiedades inmunogénicas [18], [19]. Varios estudios han puesto de relieve el hecho de que, de acuerdo con este proceso, los tumores MSI fueron marcadamente infiltrados por linfocitos citotóxicos intra-epiteliales tumor infiltrante T (TIL) y que una respuesta inmune celular fue predictivo de un resultado relativamente favorable independientemente de la inicial estadio del tumor y otros factores clínicos [20]. Por lo tanto, la actividad NMD puede interferir con la inmunidad antitumoral mediante la limitación de la expresión de algunas de estas proteínas aberrantes. Usando el cáncer colorrectal MSI como modelo, nuestro objetivo aquí en investigar más a fondo el papel de NMD en la oncogénesis.
Resultados
transcriptoma cambios secundarios a UPF1 silenciamiento en las células HCT116 CRC y su relación con la inestabilidad de microsatélites
el uso de Affymetrix GeneChip ® Human exón 1,0 ST arrays de expresión génica, se encontró que la expresión de los genes 1363 para ser desregulado significativamente al silenciamiento UPF1 en la línea celular HCT116 (MSI) CRC, con un factor de cambio en comparación con ≥1.5 las células no tratadas (Tabla S1). Con otros 111, UPF1 fue, como era de esperar, uno de los genes a ser significativamente las reguladas. El nivel de inhibición fue significativa (& gt; 75%) y estuvo de acuerdo bien con nuestros datos obtenidos por cuantitativa en tiempo real RT-PCR (datos no mostrados). En general, 1251 genes fueron reguladas en el silenciamiento UPF1 (1251/1363, es decir, el 92% de todos los genes desregulados en estas condiciones), entre los cuales 472 (38%) contenía una secuencia de repetición de mononucleótido de al menos 7 pares de bases en la región codificante (Tabla S2). De interés, el número total de genes en el genoma humano con un ≥7N repetición tracto codificación es menor (4470/22218;. 20% Datos no mostrados), lo que hace significativamente más alto de lo esperado por casualidad el número total de tales genes diana arriba regulado en HCT116 al silenciamiento UPF1 (
P Hotel & lt; 2 × 10
-16; prueba de ji 2).
Entre los citados 472 genes en las células HCT116, 22 genes que contiene un mononucleótido codificación repetición de 7 a 10 nucleótidos fueron elegidos debido a su supuesto papel en la carcinogénesis colorrectal y pruebas de mutaciones de inserción /deleción en estas células (Tabla 1). Todos estos genes, sino 3 (
MBD4
,
MSH3
,
TGFBR2
) nunca había sido informado de que se mutado en MSI CRC (Tabla 1). El uso de este enfoque, se han detectado mutaciones homocigóticas o confirmados en el
SLC35F5
,
TGFBR2
,
ARV1
,
MSH3
,
SMAP1
los genes y las mutaciones heterocigotas en el
MBD4
,
EFHC1
,
TTC3
, y
WDR19
genes (Figura 1a). Todos los ARNm correspondientes mutantes albergaban un PTC se encuentra en las regiones que pueden ser propensos a NMD codificación. Además, se observó que otros 4 genes diana con anterioridad describen mutaciones de cambio de heterocigotos en HCT116 (
BAX
,
RECQL
,
RAD50
y
MSH6
) no fueron significativamente re-expresado siguiente UPF1 silenciamiento (Figura 1a). Las tarifas de re-expresión de PTC-mRNAs inducidos por UPF1 silenciar en HCT116 se muestran en la Figura 1a y ponen de relieve el hecho de que, tal como se describe [14], la decadencia mRNA UPF1 mediada es muy variable dentro de una serie de endógenamente mutado PTC-mRNAs aunque alelo ensayos de expresión específicos no fueron utilizadas para diferenciar entre los ARNm de tipo salvaje y mutados en el caso de alteraciones del marco de lectura heterocigóticos.
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3
,
SMAP1
,
TTC3
,
EFHC1
,
MBD4
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50
y
MSH6
albergan mutaciones de cambio de homocigotos o heterocigotos en la línea celular HCT116 MSI CRC. Usando gama de expresión, doblar los cambios en la expresión de los ARNm correspondientes relativas al silenciamiento UPF1 se determinaron (doble cambio = E
mRNA en las células tratadas con un UPF1 siRNA /E
mRNA en las células tratadas con el control de siRNA). Los genes que se encuentran subrayados son aquellos cuya re-expresión fue significativa en estas condiciones (1,5 veces de cambio con un valor de p ≤0.005). por lo tanto, evidencia de sensibilidad variable a la caries UPF1 mediada de tales PTC-mRNAs se podría obtener, a pesar de los alelos ensayos de expresión específicas no fueron usados para diferenciar entre los ARNm mutado y de tipo salvaje en el caso de alteraciones del marco de lectura heterocigotos. segundo. Codificación de las mutaciones de cambio en los genes diana en relación con NMD-estado MSI CRC primarias. Las frecuencias de las mutaciones de desplazamiento del marco de la misma serie de 13 genes diana para la inestabilidad en 44 MSI CRCs primarios están representados. Los genes diana cuyas mutaciones del marco de lectura se seleccionan con frecuencia durante la progresión de MSI CRC albergan diferentes sensibilidades a la caries UPF1 mediada.
Mutaciones en MSI CRC primaria de acuerdo con su estado NMD
Todos los genes diana mutados en HCT116 para los que anteriormente se había determinado el impacto de NMD fueron seleccionados para mutaciones de desplazamiento del marco en la codificación de secuencias de microsatélites en una serie de MSI CRCs primario (n = 44). Esto incluye genes cuya ARNm mutado son más o menos sensibles a la NMD (
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3
,
TTC3
,
EFHC1
,
MBD4
,
SMAP1
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50
,
MSH6
) (Figura 1a). Las frecuencias de mutación de estos 13 genes que representan posibles objetivos para la inestabilidad impulsado por MSI fueron muy variables en estos tumores (Figura 1b). Sobre la base de su alta frecuencia de mutación,
SLC35F5
,
ARV1
,
TTC3
, y
SMAP1
representar nuevos genes diana en el que las mutaciones de cambio no tienen previamente ha informado en MSI CRC. Ellos fueron mutados en 48% (21/44), 23% (10/44), 32% (14/44) y 73% (32/44) de los tumores, respectivamente (Figura 1b).
la sobreexpresión de mRNA en UPF1 CRC primarias MSI
Mediante la medición de los niveles de ARNm UPF1 y UPF2 por cuantitativa en tiempo real RT-PCR en otra serie independiente de MSI CRC primarios para los que también obtuvimos las muestras correspondientes a búsqueda de la mucosa normal, se observó un aproximado de 7 veces sobre-expresión de UPF1 en los tumores (n = 25) en comparación con la mucosa normal (
P = 0,0015
; prueba t pareada) (Figura 2). Dado que la cuantificación (7 veces) de la sobreexpresión tiene que ser tomada con cautela debido a la pequeña cantidad de datos, se verificó que UPF1 mRNA fue hecho sobre-expresado en MSI CRC primarias mediante la realización de una prueba cualitativa de chi-cuadrado, que es robusta a los valores extremos. Con este enfoque, el número de casos en los que la expresión UPF1 fue mayor en los tumores en comparación con el juego mucosa normal (N = 20/25) fue significativamente diferente de lo esperado por azar (
P = 0,009
; prueba de chi-cuadrado ). Estos datos se ilustran en la Figura 2, en el que 20 y 5 círculos abiertos representan muestras de tumores MSI sobre-expresión de UPF1 o no, respectivamente, se representan encima de una línea doted simboliza la expresión de este factor de NMD en mucosa normal. De interés, una tendencia a la sobre-expresión de este factor también se observó en no-MSI (SMS) CRC (n = 31) en las mismas condiciones (
P
= 0,08; prueba t pareada) (Figura 2). Por el contrario, UPF2 no se expresó diferencialmente en cualquiera de MSI o SMS CRC en comparación con el juego mucosa normal (
P
= 0,56 y 0,83, respectivamente; emparejado t-test). (Figura 2)
en 25 y 31 MSI CRC del SMS se comparó la expresión de UPF1 y UPF2 entre los tumores y emparejado mucosa colónica normal por tiempo real RT-PCR cuantitativa. En todos menos 5 casos, se observó la sobreexpresión de UPF1 en los tumores MSI CRC. Teniendo en cuenta todas las muestras, la sobre-expresión de UPF1 en los tumores MSI fue estadísticamente significativa (
P
= 1,5 × 10
-3; emparejado t-test). En MSS CRCs, una tendencia a la sobre expresión de este factor se observó en las mismas condiciones (
P
= 0,08; apareado t-test). En los pacientes con MSI o MSS CRC, UPF2 no se expresó diferencialmente entre tumor y búsqueda de la mucosa normal (
P = 0,56
y
P
= 0,83, respectivamente; emparejado t-test).
descomposición significativa de los ARNm de mutación derivada del marco de lectura que dependen de la expresión UPF1 en MSI CRC primaria
en nuestra serie de 44 primaria MSI CRC, se determinó aún más la relación
in vivo
expresión de 18 genes diana MSI por cuantitativa en tiempo real RT-PCR utilizando las condiciones experimentales que hemos determinado previamente en una serie de líneas celulares de CRC (
ATR
,
BAX
,
BLM
,
CBF2
,
CDX2
,
GRB14
,
GRK4
,
IGF2R
,
MBD4
,
MSH3
,
MSH6
,
RAD50
,
rbbp8
,
RECQL
,
RIZ
,
TCF4
,
TFDP2
,
TGFBR2
) (Figura 3 y también el cuadro S3 del estado mutacional de estos 18 genes en MSI CRC) [14]. Para todos los genes excepto 3 (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), se observó una tendencia a la desintegración del mutante en comparación con los ARNm de tipo salvaje. La decadencia de mRNAs mutantes en comparación con los tipos silvestres fue significativa para MSH6 (
P
= 0,02; de t de Student) y casi significativa para algunos otros sólo, por ejemplo, BAX (
P
= 0,08), CDX2 (
P
= 0,10), MSH3 (
P
= 0,10), RIZ (
P = 0,10
) y TFDP2 (
P
= 0,10), proporcionando evidencia de decaimiento diferencial de PTC-ARNm en comparación con el de tipo salvaje en nuestra serie de CRCs primarios, como ya se ha descrito en una serie de líneas de células MSI CRC [14] (Figura 3). En general, hubo un deterioro muy significativo de PTC-ARNm en los CRC primarias MSI (P
& lt; 10
-4, prueba t de Student; véase la sección "Materiales y Métodos" para los análisis estadísticos ). Como prueba indirecta de la contribución de NMD, la intensidad global de este proceso en MSI CRC primarias se correlacionó positivamente con el nivel de expresión UPF1 endógena (
P
= 0,02, prueba t de Student; ver los "Materiales y Métodos "sección para los análisis estadísticos), mientras que el impacto de UPF2 no fue significativa (
P
= 0,72, prueba t de Student) (datos no mostrados).
los valores ∂Ct se indican en relación con el estado mutacional de cada gen en los 44 MSI CRC primarias (de tipo salvaje y muestras tumorales mutados se indican con círculos blancos y triángulos negros, respectivamente). Para cada gen, se calcularon los valores relacionados con la de tipo salvaje (flecha blanca) o (flecha negro) muestras de tumores mutados medianas de ∂Ct. Para todos los genes excepto 3 (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), una tendencia a la descomposición del mutante en comparación con los ARNm de tipo salvaje se observó (los valores son ∂Ct inversamente proporcional a la expresión del gen). En general, los datos proporcionan evidencia de deterioro significativo de PTC-ARNm en comparación con el tipo silvestre ARNm
in vivo en
MSI CRC primarias (
P Hotel & lt; 10
-4, estudiante
t-test
).
UPF1 y UPF2 son factores predictivos negativos de la respuesta inmunitaria del huésped frente a MSI CRC
Con la excepción de
TCF4
, no se encontraron correlaciones positivas significativas entre la expresión endógena de PTC-ARNm y la presencia de TIL CD3ε-positivos en los tumores (
P
TCF4 = 0,06; bootstrapped t-test) (datos no mostrados ). La relación entre el número de los TIL y la expresión de UPF1 y UPF2 no era lineal sino log-lineal. Por lo tanto, se investigó la influencia de UPF1 y expresión UPF2 sobre el número de TIL
a través de
una prueba de Wald y los coeficientes en el modelo de regresión de Poisson se estimaron a través de mínimos cuadrados ponderados de forma iterativa volver. Sobre la base de estas observaciones, un efecto negativo de UPF1 y expresión UPF2 en el número total de TIL CD3ε-positivo se demostró (
P Hotel & lt; 0,01 para UPF1 y UPF2; prueba de Wald). Se estableció un modelo matemático que correlaciona el número de TIL CD3ε-positivos con la expresión de estos factores NMD en MSI CRCs, prediciendo que los TIL aumentó alrededor de un 30% cuando se reduce a la mitad la expresión de UPF1.
se ilustran Estos datos para UPF1 y UPF2 en la Figura 4; muestras tumorales en las que UPF1 y expresión UPF2 son bajos (por debajo de la media) presentado con tasas variables de CD3ε positivo-TIL mientras que las muestras tumorales en las que UPF1 y expresión UPF2 son altos (por encima del promedio) se encontraron para ser casi siempre caracterizada por una baja CD3 cuenta, haciendo UPF1 y Upf2 posibles marcadores de escasa inmunidad antitumoral en MSI CRC primarias.
el número total de CD3ε positivo-TIL se relacionó significativamente con la expresión endógena de UPF1 y UPF2 en esta serie de 44 MSI CRC primarias (
P Hotel & lt; 0,01; prueba de Wald). De interés, mientras que las muestras tumorales en las que UPF1 y UPF2 expresión fue baja (por debajo de la media) se presentaron con tasas variables de CD3ε positivo-TIL, muestras tumorales en las que UPF1 y UPF2 expresión fue alta (por encima de la media) se caracterizan casi siempre con una baja recuento de CD3 (CRC pobremente inmunogénicas). Estos datos hacen UPF1 y Upf2 marcadores específicos de pobre inmunidad anti-tumor en MSI CRCs primarios. CD3 inmunotinción de proteínas se presentan para 2 muestras de MSI primaria CRC que muestran ya sea bajo recuento de CD3 y alta UPF1 y expresión UPF2 (izquierda) o alta CD3 cuenta junto con un bajo UPF1 y expresión UPF2 (derecha).
Discusión
Mediante la evaluación de un gran número de genes diana que fueron mutados a tasas variables en sus secuencias de repetición de codificación, que muestran una descomposición significativa de los correspondientes mRNAs mutantes en comparación con el de tipo salvaje en MSI CRCs primarias con un impacto significativo de expresión endógena de UPF1 en este proceso, con UPF2 juega un papel menor en el proceso, como recientemente descrita por nuestro grupo en una serie de líneas de células MSI CRC [14]. Tomados uno por uno, se observó un deterioro significativo o casi significativa de sólo algunos mRNAs mutantes en comparación con los tipos silvestres y esto no es sorprendente, ya que: (i) en fecha tan reciente publicado por nuestro grupo, el impacto NMD en la expresión del marco de lectura mutación derivada de ARNm es muy variable de un mutante a otro [14]; (Ii) las frecuencias de las alteraciones de genes diana fueron muy variables y, a veces muy baja en nuestra serie de tumores; (Iii) algunos mutantes en particular,
(TCF4) ¿Cuáles son NMD-irrelevante. En este estudio, también investigamos a gran escala de la expresión génica cambios en las células MSI CRC en el contexto de la inhibición de NMD usando un método específico, mostrando que condujo a la regulación de 1251 genes en HCT116, entre los cuales una proporción de ellos significativamente mayor de lo esperado por azar contenía un microsatélite de codificación. Aunque no todos ellos se espera que se mutado en células MSI CRC, como se muestra aquí en una serie corta de hasta reguladas genes diana, se puede avanzar que UPF1 es particularmente relevante para modular la expresión de docenas de genes mutados en MSI CRC Células. En general, estos datos confirman por primera vez, tanto
in vitro
y
in vivo
, que la NMD influye profundamente en la tumorigénesis MSI-impulsada a nivel molecular.
Como posible consecuencia funcional de la actividad NMD
in vivo en
MSI tumorigénesis, hemos investigado si la actividad de este sistema modula la inmunidad antitumoral. De interés, la única mutación del marco de cuya presencia se asoció significativamente con un mayor número de TIL en MSI CRC estaba en
TCF4
, el único objetivo de genes NMD-irrelevante estudiado en nuestra serie como su secuencia de repetición de codificación se encuentra dentro de su último exón. Además, se observó una correlación inversa entre UPF1 y expresión UPF2 y el número de TIL CD3ε-positivos en MSI CRCs, y un modelo matemático que une el número de TIL CD3ε-positivos a la expresión de factores de NMD en MSI CRCs predijo que los TIL aumentó aproximadamente el 30% cuando se reduce a la mitad la expresión de UPF1 o UPF2. Estos datos indican que NMD puede influir negativamente en la inmunidad del huésped contra las células tumorales de MSI de manera acumulativa
vía
la degradación contrastado e incompleta de las transcripciones mutados que codifican péptidos inmunogénicos. Se podría especular en este contexto que los factores UPF pueden ser marcadores específicos de la inmunidad deficiente en MSI CRC primarias. A la luz de estos resultados, que de este modo se puede avanzar que el impacto negativo de la mencionada NMD en el proceso inmune desarrollada por el huésped contra las células tumorales MSI sería eficiente sólo cuando NMD factores están sobre-expresados y de gran actividad en la degradación de los numerosos PTC- codificación de ARNm para los péptidos inmunogénicos que se sintetizan en MSI CRC. Por el contrario, se puede suponer que, cuando se expresa a tasas más bajas, los factores de NMD serían ineficaces en la prevención del desarrollo de una respuesta inmune anti-tumor cuya intensidad dependerá de la cantidad y la naturaleza de las alteraciones del marco de lectura acumulados en las células de cáncer de MSI. Estos hallazgos pueden ser de interés clínico, ya que, como se mencionó anteriormente, la inmunidad antitumoral se considera generalmente como un factor independiente cuya intensidad se ha demostrado consistentemente ser predictivo de un resultado favorable independientemente de la etapa del tumor de colon inicial y otros factores clínicos [20] .
Dado que la eficiencia de NMD para degradar mRNAs mutantes de los genes diana es muy variable, recientemente hemos propuesto que NMD puede, por tanto, desempeñar un papel importante en la selección de mutaciones de genes objetivo con un papel funcional en MSI carcinogénesis [14 ]. Es de destacar que entre los genes regulados hasta en el silenciamiento UPF1, cuatro pendientes de declaración genes diana (
SLC35F5
,
TTC3
,
ARV1
y
SMAP1
) están aquí demostrado ser mutado con frecuencia en nuestra serie de MSI CRC primarias. Entre ellos,
SMAP1
, por estromal asociada a la membrana de la proteína-1, ha sido previamente informado para participar en reordenamientos cromosómicos con
MLL
en neoplasias hematológicas [21]. Con una frecuencia de 73% de las alteraciones del marco de lectura en MSI CRCs primarios, incluyendo mutaciones homocigóticas en cinco muestras de CRC (datos no mostrados), es uno de los genes más frecuentemente mutado objetivo en MSI CRCs junto con
TGFBR2
y
ACVR2
[17]. De acuerdo con nuestros resultados anteriores y los obtenidos por Ionov et
al.
Usando emethine como un inhibidor no específico del sistema NMD [14], [22], se confirmó en este estudio que
TGFBR2
PTC-ARNm se degrada a través NMD en células MSI CRC. En un artículo reciente, You y
col.
[23] informó de datos contradictorios, afirmando que este gen diana, así como
MSH3
escapar NMD en la línea celular HCT116. Se presentan los resultados en una serie de PTC-mRNAs que muestran estas transcripciones eran o bien completamente sensible o completamente resistentes a la NMD en células MMR-deficientes. Sus datos se obtuvieron mediante la realización de ensayos de expresión que no eran ni cuantitativa ni específica de alelo. En el mismo estudio, estos autores también sugieren una represión de traducción sistemática de proteínas truncadas de los ARNm de mutación derivada del marco de lectura que escaparon NMD (NMTR para "Tonterías mediada por la represión de traducción") [23]. Hemos verificado por el Western Blot que la expresión de las proteínas correspondientes para los dos genes diana mutados homocigótica (
TGFBR2
,
MSH3
) no era detectable en las células HCT116 (datos no mostrados). Contrariamente a You y
al
, proponemos que la pérdida de
TGFBR2
y
MSH3
expresión se debe principalmente a NMD en lugar de a una vía hipotética NMTR. Es de destacar que la existencia de una vía NMTR no se ajusta bien con las propiedades inmunogénicas de células de cáncer de MSI que dependen directamente de la acumulación de péptidos inmunogénicos derivados de numerosas proteínas relacionadas con el marco de lectura cuya PTC-mRNAs son NMD-relevante en la mayoría de los casos [ ,,,0],18], [19], [20]. Independencia de las diferencias, todos estos datos abogan por un papel de NMD en la modulación de la expresión de varios genes cuyas mutaciones han sido ya demostrada
(TGFBR2
,
MSH3
,
MBD4)
o se espera que juegue un papel importante durante la progresión MSI CRC [17]. agotamiento UPF1 con shRNA en células no MSI HeLa se informó recientemente para inducir la detención del ciclo celular en la fase S temprana debido a la participación de este factor en la reparación del ADN [24]. En contraste, el silenciamiento transitoria de UPF1 y /o UPF2 en células de cáncer colorrectal MSI y SMS (HCT116, LoVo, Co115, LS174T, SW480, COLO320) no condujo a alteraciones significativas de crecimiento celular y /o la muerte en nuestras manos (no datos mostrado). Ahora se requieren más estudios para determinar cómo la actividad NMD puede cambiar el repertorio de genes implicados en la carcinogénesis y el impacto MSI progresión tumoral utilizando MMR modelos de ratones deficientes en la que se modifica la actividad UPF1.
Nuestras observaciones se refieren al tumor primario más frecuente ubicación asociada con MSI en el ser humano, es decir, de colon. Indican que la NMD influye profundamente en la expresión de numerosos mutantes con un papel fundamental en la tumorigénesis espera impulsado por MSI y repercute negativamente en la inmunidad del huésped contra las células de cáncer de MSI. Tal función oncogénica putativa de NMD en la carcinogénesis MSI encaja bien con el hecho de que también presenta aquí por primera vez que UPF1 es significativamente sobreexpresado en comparación con los CRC MSI búsqueda de la mucosa normal. Esta última observación se basó en la medida del nivel de UPF1 mRNA. Como perspectiva, ahora se ha confirmado que se a nivel de proteínas a través de un enfoque cuantitativo, como el Western Blot que aquí no se realizó debido a la falta de material tumoral adicional disponible. El desarrollo de los ensayos clínicos deberían desarrollarse ahora a mirar si NMD puede ser considerada como un factor de mal pronóstico en los CRC MSI o no. Las moléculas pequeñas que inhiben la NMD ahora están disponibles [25] y se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión del papel NMD en los cánceres. Ahora tenemos la intención de utilizar estos fármacos en ratones deficientes en desarrollo MMR-neoplasias MSI para evaluar si puede constituir una nueva diana terapéutica para el tratamiento de estos tumores.
Materiales y Métodos
Las muestras tumorales y líneas celulares
la línea celular HCT116 CRC se adquirió en la American Type Culture Collection y se mantuvo en DMEM (Life Technologies) que contiene 10% de suero fetal bovino (Invitrogen) y glutamina sin antibióticos para permitir experimentos de transfección transitoria con siRNA. Cuarenta y cuatro MSI tumores primarios se obtuvieron de los pacientes sometidos a cirugía para el cáncer colorrectal; todos los casos fueron confirmados histopatológicamente como son adenocarcinomas. Los tumores fueron recogidos sistemáticamente fijado en formol e incluido en parafina y se congeló después de la cirugía sin ninguna incrustación antes en nitrógeno líquido. El estado de MSI se determinó por PCR multiplex fluorescente que comprende 5 repeticiones de mononucleótidos quasimonomorphic (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 y NR-27), como se describe [26].