Extracto
El objetivo de este estudio fue determinar si el anticuerpo MUC1 conjugado con un fluoróforo se podría utilizar para visualizar el cáncer de páncreas. Anti-MUC1 anticuerpos (CT2) se conjugó con 550 nm o 650 nm fluoróforos. ratón desnudo se utiliza para hacer modelos subcutáneos y ortotópicos de cáncer de páncreas. Western blot y análisis de citometría de flujo confirmó la expresión de MUC1 en líneas celulares de cáncer de páncreas humano incluyendo BxPC-3 y Panc-1. La inmunocitoquímica con fluoróforo conjugado anticuerpo anti-MUC1 demostró áreas fluorescentes en la membrana de las células Panc-1 de cáncer. Después de la inyección de los anticuerpos anti-MUC1 conjugados a través de la vena de la cola, por vía subcutánea trasplantaron Panc-1 y BxPC-3 tumores emiten fuertes señales fluorescentes. En los modelos de tumor subcutáneos, la señal fluorescente a partir del anticuerpo anti-MUC1 conjugado se observó en todo el margen del tumor y el espacio entre las células. El anticuerpo anti-MUC1 conjugado unido en el tumor trasplantado ortotópicamente-modelos Panc-1 y BxPC-3 que permite que los tumores a explorar. Este estudio demostró que los fluoróforos conjugados con anticuerpos anti-MUC1 podían visualizar los tumores de páncreas in vitro e in vivo y pueden ayudar a mejorar el diagnóstico y tratamiento del cáncer de páncreas
Visto:. Parque JY, Hiroshima Y, Lee JY, Maawy AA, Hoffman RM, M Bouvet (2015) MUC1 se dirige selectivamente al cáncer pancreático humano en modelos de ratón ortotópico desnuda. PLoS ONE 10 (3): e0122100. doi: 10.1371 /journal.pone.0122100
Editor Académico: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos |
Recibido: 14 Enero, 2015; Aceptado: February 18, 2015; Publicado: 27 Marzo, el año 2015
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Disponibilidad de datos:. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación: Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer CA142669 y CA132971 (de MB y anticancerígenas, Inc.), y una beca de la Fundación de investigación de Corea del marco del fondo de promoción de la investigación básica del Ministerio de Educación y Desarrollo de Recursos de Salud de Corea desde 2010 hasta 0022990 (a JYP). El donante prestado apoyo en forma de salarios de los autores [MB], pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. JYP, YH y RMH son afiliados no asalariados de AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. comercializa modelos animales de cáncer. No hay otros intereses en competencia. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El marcador de tumor puede ser CA19-9 detectado en el suero de pacientes con cáncer de páncreas. Sin embargo, la utilidad de CA19-9 como un biomarcador de cáncer de diagnóstico o pronóstico es cuestionable. La sensibilidad de CA19-9 en suero varía desde 41 hasta 86% con una especificidad del 33 al 100%, que no es adecuado para el cribado o diagnóstico [1]. CA19-9 es frecuentemente elevada en otras enfermedades inflamatorias y condiciones de obstrucción biliar tal que su utilidad como un biomarcador es aún más cuestionable. Se necesitan mejores biomarcadores para el cáncer de páncreas [2].
MUC1 es una glicoproteína unida a la membrana que consiste en una subunidad grande extracelular de un dominio de 20 amino ácido en tándem de repetición, una subunidad pequeña dominio extracelular, un dominio transmembrana y una cola citoplasma [3]. MUC1 es frecuentemente sobreexpresado en varios tipos de cáncer como el de mama, de ovario, de pulmón, de colon y el cáncer [3,4]. También se considera como un potencial biomarcador de diagnóstico, pronóstico y terapéutico del cáncer de páncreas. MUC1 se sobreexpresa en más del 90% de los tumores pancreáticos de pacientes de cáncer [5]. Fuerte expresión de MUC1 se asocia con la reducción de la supervivencia [6]. terapia dirigida MUC1 se ha probado en ensayos preclínicos y clínicos [7-9]. Se han hecho intentos para detectar MUC1 en el suero de los pacientes y el tejido de cáncer de páncreas con varios métodos [10,11].
Hemos demostrado que el anticuerpo anti-CEA conjugado con fluoróforos ayudó a mejorar la detección de cáncer y de fluorescencia activada cirugía guiada por (FGS) en los modelos de páncreas y cáncer de colon de ratón que mejoró significativamente el resultado en comparación con la cirugía-brillante de luz estándar [12-14]. Se ha informado de que las imágenes ópticas y catepsina claduin-4 específica ayudó a detectar el cáncer de páncreas y su precursor en modelos de ratones [15,16].
En el presente estudio, determinamos si el anticuerpo anti-MUC1 conjugado con un fluoróforo podría objetivo y visualizar el cáncer de páncreas in vitro e in vivo en modelos.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer de páncreas
Las líneas celulares de cáncer de páncreas humanos BxPC-3 [ ,,,0],17] y Panc-1 [18] se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT), penicilina /estreptomicina (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), piruvato de sodio (Gibco-BRL) , bicarbonato de sodio (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamina (Gibco-BRL), y aminoácidos no esenciales medio esencial mínimo (Gibco-BRL). Todas las células se cultivaron a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora.
Construcción de línea celular de cáncer de páncreas que expresan GFP
La construcción de la proteína fluorescente verde (GFP) que expresa Panc-1 línea celular se realizó como se describió anteriormente [19]. Para la transducción de genes GFP, 20% confluentes células Panc1 [18] se incubaron con un 1: 1 mezcla de precipitado sobrenadantes retrovirales de las células de empaquetamiento PT67 y RPMI 1640 (Gibco-BRL, Life Technologies, Inc.) durante 72 h. Las células se recogieron con tripsina /EDTA 72 h después de la incubación con sobrenadantes retrovirales GFP y se subcultivaron en una relación de uno y quince en medio selectivo que contenía 200 g /ml G418. El nivel de G418 se aumentó a 800 mg /ml por etapas. Los clones que expresan GFP fueron aisladas con cilindros de clonación (Bel-Art Products, Pequannock, NJ) por tripsina /EDTA y se amplificaron y se transfieren mediante métodos de cultivo convencionales. clones de alta expresión GFP-se aislaron en ausencia de G418 para & gt; 10 pases para seleccionar para la expresión estable de GFP [20-22].
Ratones
atímicos
nu /nu
ratones desnudos (AntiCancer Inc., San Diego, CA) , 4-6 semanas de edad, fueron utilizados en este estudio. Los ratones se mantuvieron en una instalación aislada en virtud de filtración HEPA. Los ratones fueron alimentados con una dieta de roedores autoclave de laboratorio. Todos los procedimientos quirúrgicos de ratón y de formación de imágenes se llevaron a cabo con los animales anestesiados por inyección intramuscular de 50% de ketamina, xilazina 38%, y 12% de maleato de acepromazina (0,02 ml). Los animales recibieron la buprenorfina (0,10 mg /kg ip) inmediatamente antes de la cirugía y una vez al día durante los próximos 3 días para mejorar el dolor. El tamaño máximo del tumor fue de menos de 2 cm. El estado de los animales se controló cada día. Los animales se sacrificaron todos 2-3 semanas después de la cirugía. inhalación de CO2 se utilizó para la eutanasia. Para asegurarse de la muerte después de asfixia con CO2, se realizó la dislocación cervical. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el cáncer, Institucional Cuidado de Animales Inc. y el empleo Comisión (IACUC) de conformidad con los principios y procedimientos descritos en el Instituto Nacional de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales con el número de Aseguramiento A3873-1.
conjugación de tinta-anticuerpo
Hamster anticuerpos monoclonales contra MUC1 (CT2; Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) se conjugaron con DyLight 650 o 550 colorantes (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU. ) según las especificaciones del fabricante, asegurando un mínimo de al menos 4: 1 de colorante: proteína. Proteína: concentraciones de colorante se confirmaron utilizando un NanoDrop espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) [23]
Western blotting
Los lisados celulares se extrajeron en tampón de lisis que contiene 70 mM β-glicerofosfato. , ortovanadato de sodio 0,6 mM, MgCl 2 mM
2, ácido etileno glicol 1 mM, DTT 1 mM (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.), 0,5% de Triton-X100, 0,2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y el 1% de la proteasa cóctel de inhibidores (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Los lisados se separaron por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon en 5% (w /v) de leche en polvo no grasa y se sondaron con anticuerpos. Se utilizó anti-MUC1 (CT2). Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.).
El análisis de citometría de flujo
Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia, se trató con solución accutase (Sigma) durante 5 minutos, se lavaron dos veces con tampón de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (2% de FBS, 0,1% de azida de sodio en PBS). Las células (1 × 10
6) se resuspendieron en el tampón de FACS. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 2% y luego se bloquearon con solución de 2% BSA-PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas con anticuerpos anti-MUC1 (CT2, 2 g /prueba) durante 40 minutos a temperatura ambiente, y luego con cabra anti-armenio hámster IgG-FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.) durante 40 minutos a temperatura ambiente . Después de lavar con tampón FACS, las células se resuspendieron en tampón FACS y se sometieron a citometría de flujo utilizando un FACS Aria (BD Immunocytometry Sistemas, Franklin Lakes, NJ). dispersión lateral y perfiles de dispersión frontal se utilizan para eliminar los dobletes de células.
La inmunocitoquímica de células vivas
células Panc-1 (2 x 10
5) fueron cultivadas durante la noche. Anti-MUC1 (CT2) anticuerpo conjugado con DyLight 550 colorantes se diluyó a 4 g /ml en PBS (Cellgro Corning, Manassas, VA). El medio de cultivo de las células se aspiró y se añadió el anticuerpo diluido a las células vivas. Las células se incubaron con el anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron suavemente 2 veces con solución salina tamponada con fosfato después el anticuerpo se aspiró. Se observaron las células bajo un microscopio confocal FV1000 (Olympus, Tokio, Japón) con luz blanca y 559 nm láser [24].
La inmunohistoquímica
Para la inmunotinción de fluorescencia en las diapositivas hechas de tejido tumoral congelado , se utilizó anti-MUC1 (CT2) conjugado con DyLight 650. Los portaobjetos se incubaron con suero normal de burro al 10% durante 1 hora a temperatura ambiente, y se incubaron con el anticuerpo conjugado a temperatura ambiente durante 1 hora en una dilución de 1: 100. Los tejidos se secan y se observaron con un IV-100 microscopio láser de barrido (Olympus, Tokio, Japón), con 633 nm láser [25]. diapositivas suplentes de la misma tejido tumoral congeladas se tiñeron con hematoxilina y eosina y se observaron al microscopio óptico.
modelo de colgajo de piel
Los ratones desnudos fueron anestesiados con la mezcla de ketamina por vía subcutánea. Se hace una incisión en forma de arco se hace en la piel abdominal. El tejido conectivo subcutáneo se separó para liberar el colgajo de piel sin dañar la arteria y la vena. El colgajo de piel se extendió y se fija en el soporte plana. Panc-1-GFP (1 X 10
6 células) en 30 l de Matrigel fueron rociados en la superficie interior de la tapa de la piel, y se cerró la piel [26].
subcutánea y el tumor ortotópico modelo de ratón
Para realizar modelos de tumores pancreáticos trasplantados por vía subcutánea, las células de cáncer pancreático humano Panc-1 y BxPC-3 (2 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos. Cuando los tumores subcutáneos crecieron entre 10 y 20 mm de diámetro, que se recogieron y se fragmentaron en pequeños fragmentos. Los fragmentos de tumor se implantaron ortotópicamente en ratones desnudos, tal como se describe anteriormente [19,27-29].
Whole imágenes de cuerpo
En ambos modelos de tumores subcutáneos y ortotópicos, los ratones fueron inyectados con el anticuerpo conjugado con fluoróforo en la vena de la cola, y la imagen de cuerpo entero a continuación, se llevó a cabo utilizando el sistema OV100 de Pequeños Animales de imagen (Olympus, Tokio, Japón) después de la anestesia con la mezcla de ketamina se ha descrito anteriormente [30]. La dosis óptima para los estudios en animales se decidió por la dosis del anticuerpo conjugado que produjo las imágenes con la mejor relación de tumor a fondo en el modelo de tumor subcutáneo.
Imagen análisis
Todas las imágenes fueron analizados utilizando Imagen- J (Institutos nacionales de Salud, Bethesda, Maryland) antes de que el proceso de imágenes y comparación. proceso de imágenes se realizó con Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc., San José, California).
Resultados
La expresión de MUC1 en líneas celulares de cáncer de páncreas
Tanto el cáncer de páncreas líneas celulares ensayadas (BxPC-3 y Panc-1) tenían la expresión de MUC1 observó con Western Blot (figura 1A). La proporción de células positivas se MUC1 36,9% en BxPC3 y 24,4% en las líneas celulares de cáncer de páncreas Panc1, como se observa con citometría de flujo (Fig 1B). La misma prueba se repitió en cada línea celular por lo menos tres veces. Los resultados de todos los experimentos mostraron que anti-MUC1 anticuerpo (CT2) podría detectar MUC1 en la membrana celular de las células de cáncer de páncreas in vitro.
(A) análisis de transferencia Western muestra la expresión de MUC1 en líneas celulares de cáncer de páncreas (BxPC -3 y Panc-1). (B) Análisis de citometría de flujo muestra la expresión de MUC1 en la superficie de líneas de células Panc-1 BxPC-3 y. (C) La inmunocitoquímica en células vivas muestra múltiples puntos fluorescentes en la superficie de las células Panc-1. imágenes de fluorescencia representativas se fusionaron con los correspondientes DIC (contraste de interferencia diferencial) imágenes (x60 objetivo de inmersión en agua sobre FV1000, usando el láser de 559 nm).
La inmunocitoquímica también se realizó utilizando anticuerpos anti-MUC1 (CT2) conjugado con flourophores. Después de la incubación con el anticuerpo conjugado sin permeación, múltiples puntos fluorescentes se observaron en la superficie de las células Panc-1 bajo un microscopio de fluorescencia (Fig 1C). La fusión con el correspondiente contraste de interferencia diferencial microscopía confirmó que el anticuerpo conjugado con fluophore reaccionar con MUC1 en la superficie de las células de cáncer de páncreas y produce fluorescencia.
Orientación de los tumores pancreáticos subcutáneos con MUC1 fluorescente
Cuando BxPC-3 o Panc-1 tumores subcutáneos se habían alcanzado aproximadamente 10 a 20 mm de diámetro, los animales recibieron cada uno una sola dosis 30 mg de DyLight 650 conjugado con anti-MUC1 (CT2) a través de la vena de la cola. Los ratones fueron imágenes tanto bajo campo claro y fluorescencia de iluminación mediante el sistema de imágenes de Animales Pequeños Olympus OV100. Tanto Panc-1 (Fig 2A) y BxPC-3 (datos no mostrados) tumor mostraron fluorescencia más fuerte. inmunotinción de fluorescencia se realizó en muestras de tumores congelados hechos de BxPC-3 y mostró fluorescencia en las membranas celulares que demuestran la expresión de MUC1 (Fig 2B).
(A) El ratón se forma la imagen tanto bajo luz blanca y fluorescencia iluminación. La intensidad de la señal de fluorescencia roja del tumor subcutáneo Panc1 es más fuerte que el fondo. (B) tinción con hematoxilina y eosina (x200, izquierda). Fluorescencia inmunotinción para MUC1 (objetivo regular de x20, derecha) de las muestras tumorales congeladas muestra señales de fluorescencia en la membrana de las células cancerosas.
Orientación de las células de cáncer de páncreas en colgajos de piel con MUC1 fluorescente
los ratones con células de cáncer pancreático que crecen en colgajos de piel fueron inyectados con anti-MUC1 (CT2) conjugado con DyLight 550 colorantes en la vena de la cola. Cuarenta y ocho horas después de la inyección de anticuerpo, el colgajo de piel se extendió de nuevo. Imaging se realizó con el OV100 y FV1000. Varias colonias de células cancerosas se observaron en la superficie de la aleta de la piel con la OV100. señales de fluorescencia de GFP de células cancerosas individuales se observaron con el FV1000. En el margen exterior de la colonia y el espacio entre las células cancerosas dentro de la colonia, 550 nm señales de fluorescencia, que se originó a partir del anticuerpo fluoróforo conjugado, se observaron. (Fig 3) Los resultados demostraron que el anticuerpo se hizo reaccionar con MUC1 en la membrana de las células cancerosas in vivo.
Imágenes representativas se obtuvieron bajo luz blanca, y 473 nm y 559 nm láser en la OV100, y se fusionó . se observó señal de GFP de las células cancerosas individuales y la señal fluorescente de color rojo de la DyLight 550 anticuerpo anti-MUC1 fluoróforo conjugado en el margen exterior de la colonia y el espacio entre las células cancerosas.
Orientación de páncreas tumores en modelos con ratones ortotópico fluorescente MUC1
con tumores implantados ortotópicamente en el páncreas de ratones fueron inyectados con DyLight anticuerpo 650-conjugado anti-MUC1 (CT2) con una sola dosis 30 mg a través de la vena de la cola de 7-10 días después de la implantación del tumor. Imaging se realizó después de abrir el abdomen de los ratones. intravital de imágenes con el OV100 detecta la señal de fluorescencia procedente de Panc1 y tumores BxPC3 (Fig 4). Tumores de menos de 5 mm puede ser detectado con imágenes de fluorescencia (Fig 4). Las relaciones medias de intensidad de fluorescencia entre el tumor y el fondo en Panc-1 y BxPC-3 ortotópico tumores fueron 6,70 y 2,39, respectivamente. Estos resultados confirmaron que en modelos de tumores ortotópico, MUC1 dirigido cáncer de páncreas y la detección de tumores habilitado. Aparte de el tumor, no se detectaron señales de fluorescencia de la piel y, la vejiga y los contenidos intestinales, pero en menor intensidad.
se detectaron señales de fluorescencia de los tumores pancreáticos trasplantados ortotópicamente en la cola del páncreas. Aparte de el tumor, no se detectó señal de fluorescencia de la piel y, la vejiga y los contenidos intestinales, pero a una intensidad más baja que la del tumor. Las flechas blancas indican tumor de páncreas.
Discusión
MUC1 es un biomarcador de imagen muy atractivo para el cáncer de páncreas, ya que se sobreexpresa en aproximadamente el 90% de los pacientes con cáncer de páncreas [5,6]. Los presentes resultados de modelos de tumores subcutáneos y ortotópico demuestran que MUC1 puede apuntar y visualizar el cáncer de páncreas por lo que es fluorescente. Los resultados del presente estudio demuestran que MUC1 es un objetivo adicional para el etiquetado del cáncer y la terapéutica de entrega de páncreas. MUC1 puede ser un objetivo útil para identificar y tratar las metástasis a distancia de todos los tipos de cáncer que expresan el antígeno usando anticuerpos marcados o portadoras terapéuticos.
BxPC-3 y Panc-1 fueron seleccionados sobre la base de estudios previos con estas líneas celulares para la cirugía guiada por fluorescencia (FGS) [13,14]. Es posible que la fracción de células positivas en el tumor es inferior a la observada por citometría de flujo debido al impedimento estérico al anticuerpo entrada en el tumor. También es posible que la presencia de células estromales en el tumor puede disminuir el porcentaje de células positivas.
El anticuerpo CT2 es el reconocimiento de ambas células cancerosas vivas, así como las células dentro del tumor en el ratón que es fácilmente visualizado mediante conjugación del anticuerpo a un fluoróforo. Es posible que en la célula viva, partes suficientes de la cola citoplásmica se hacen accesibles al anticuerpo. En fecha tan reciente se muestra por Kumar et al, se necesitan más estudios para comprender la estructura y la localización subcelular de la proteína MUC1 [31].
Ha habido intentos de utilizar MUC1 como un objetivo de tratamiento. formación de imágenes dirigida MUC1 puede guiar la terapéutica en el tumor [11,32,33]. Imaging para MUC1 puede demostrar si los objetivos terapéuticos están presentes en las células del cáncer y predecir la respuesta al tratamiento de terapia dirigida-MUC1 [5]. Además, imágenes de fluorescencia dirigido a MUC1 en el cáncer pancreático puede mejorar la visualización del tumor con el fin de lograr la resección completa durante la cirugía. Fluorescente cirugía guiada (FGS) se ha demostrado que mejora la supervivencia en modelos de ratones con cáncer de páncreas [13,14]
.
En el presente estudio, hemos querido estudiar MUC1 focalización de cáncer pancreático humano con el siguiente objetivo de el estudio de la orientación MUC1 en nuestro cáncer de páncreas xenoinjerto ortotópico (PDOX) modelos [12]. futuros estudios posteriores estarán en la orientación de MUC1 en modelos de ratón PDAC espontáneas. Los estudios formales bio-distribución se hará en futuros experimentos. El presente estudio muestra MUC1 se puede utilizar para tumor selectiva focalización in vivo. Sobre la base de la capacidad del anticuerpo fluorescente MUC1 de orientación para iluminar estos tumores, ahora podemos comparar FGS en futuros estudios con anticuerpo anti-CEA y anti-MUC1.