Extracto
Objetivo
p16
La metilación se produce con frecuencia en la carcinogénesis . Si bien se ha planteado la hipótesis de que los
estados de metilación de p16
se mantienen de forma dinámica en las células cancerosas, la evidencia directa apoya esta hipótesis no ha estado disponible hasta ahora.
Métodos
Una fusión modelo celular se estableció que reprograma el patrón de metilación de ADN nativa de las células. El estado de metilación de los
p16
alelos estaba entonces en varias ocasiones se analizó cuantitativamente en el monoclonal de fusión, las líneas celulares de cáncer de los padres (
p16
-completamente metilado-AGS y no metilado-MGC803), y no HCT116 de células de fusión usando DHPLC y secuenciación de bisulfito. metilación de las histonas se analizaron mediante inmunoprecipitación de la cromatina-PCR (CHIP). estado de la expresión de p16 se determinó utilizando inmuno-tinción y RT-PCR.
Resultados
El estado de metilación de la mayor parte de la
p16
alelos se mantuvo estable en la fusión monoclonal células después de hasta 60 pasajes. Lo más importante, la metilación de novo focal, desmetilación, y hidroximetilación se observaron consistentemente dentro de aproximadamente el 27% de los
p16
alelos en los monoclones de fusión, pero no las células parentales homocigótica metilados o no metilados. Por otra parte, los subclones de los monoclones mantienen consistentemente el mismo
patrón de metilación de p16
. También se observó un fenómeno similar con el
HCT116 p16 metilado-hemi
línea celular de cáncer de no fusión. Curiosamente, la transcripción no se observó en
p16
alelos que fueron hidroximetilado con un patrón antisentido-strand-específico. Además, se encontró que los niveles de H3K9 y H3K4 trimethylation en las células de fusión a ser ligeramente más bajos que los de los padres y AGS MGC803 células, respectivamente.
Conclusión
El presente estudio proporciona la primera evidencia directa lo que confirma que los estados de metilación de
p16
islas CpG no sólo se mantiene homeostáticamente, pero también acompañado de un proceso dinámico de metilación transitoria focal, desmetilación, y hidroximetilación en las células cancerosas
Visto:. Qin S, Li Q, Zhou J, Liu Zj, Su N, Wilson J, et al. (2014) Mantenimiento homeostático del alelo-específica
p16
metilación en células de cáncer acompañado por un dinámico focal metilación y hidroximetilación. PLoS ONE 9 (5): e97785. doi: 10.1371 /journal.pone.0097785
Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Febrero, 2014; Aceptado: 22 de abril de 2014; Publicado: 14 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Qin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [subvención 31261140372 y 81171900], Programa Nacional de Investigación básica China [subvención 2011CB504201 y 2010CB529303], y la Fundación de Beijing Ciencias Naturales de China [subvención 7.122.033]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dajun Deng es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
metilación del ADN es considerada como una de las modificaciones epigenéticas más estables de mamíferos. Los estados de metilación de los genes relacionados con la diferenciación de células han demostrado ser altamente dinámico durante células germinales y el desarrollo de preimplantación, pero llegado a ser relativamente estática durante el desarrollo de tejidos somáticos [1] - [3]. En contraste, los estados de metilación de genes relacionados con la adaptación de acogida siguen siendo dinámico en tejidos somáticos con el fin de permitir la respuesta apropiada a la exposición a los factores ambientales y posterior patogénesis [4] - [6]. Hidroximetilación de ADN está íntimamente involucrado en la alteración de estado de metilación de genes y se ha encontrado que no sólo jugar un papel clave en la desmetilación del ADN, pero también sirven muchas de sus propias funciones [7], [8].
supresores de tumores P16 codificada por el locus INK4 /arf dentro cromosoma humano 9p21 es un regulador del ciclo celular implicada en la inhibición de la transición de fase G1 → S a través de la vía de P16-CDK4 /6-RB [9]. El locus es silenciada transcripcionalmente en células madre embrionarias, y juega un papel limitante de la velocidad en la reprogramación de células pluripotentes inducidos [10]. Aunque un fragmento de deleción 9p21 es la alteración genética más frecuente que se encuentra en todos los tipos de cáncer [11], la hipermetilación de las islas CpG sigue siendo el principal mecanismo para la inactivación de p16 en múltiples cánceres humanos [12] - [14]. De hecho, un número de estudios de cohortes han mostrado que la metilación de p16 se produce temprano en la carcinogénesis y se ha demostrado que aumenta significativamente el riesgo de transformación maligna de displasia epitelial [15] - [21]. A pesar de que no se ha establecido el papel causal de la metilación de p16 en la carcinogénesis, la evidencia sugiere fuertemente que la metilación de p16 puede contribuir de manera significativa al desarrollo del cáncer y podría convertirse en un biomarcador potencial [4]. Aunque metilación p16 es una de las modificaciones epigenéticas más altamente estudiados, su estabilidad en las células cancerosas y el mecanismo a través del cual se mantiene aún no se ha aclarado [22] - [26]. Una comprensión detallada de los mecanismos implicados en el mantenimiento de metilación del ADN es un paso crítico para el desarrollo de biomarcadores de metilación y la terapia epigenética intervención.
La prevalencia de la metilación de p16 en tejidos humanos gastritis crónica está fuertemente correlacionada con la infección por Helicobacter pylori, y disminuyeron dramáticamente después eradiation H. pylori, lo que sugiere que la mayoría de los alelos metilados-p16 pueden no ser estables [27], [28]. En contraste, la metilación de p16 en células normales y cancerosas cultivadas es probable muy estable, ya que se recuperó de manera eficiente después de que el inhibidor de la metilación del ADN (5-aza-CDR) fue eliminado [29]. Sin embargo, no se observó reactivación de genes de metilación-silenciado en una cierta proporción de las células tratados con inhibidor de la metiltransferasa de ADN. Es difícil excluir la posibilidad de que la recuperación observada de los resultados de metilación de p16 a partir de una selección ventaja conferida a las células que no se someten a la reactivación de p16 /desmetilación durante el tratamiento con el inhibidor. Además, recientemente se ha informado de que los sitios CpG metilados dentro de la p16 islas CpG se encuentran principalmente en el p16 exón-1 de codificación de región nucleosomal en las lesiones de gastritis humanos y extenderse en las regiones 5'UTR y promotor nucleosomal durante el desarrollo de carcinomas gástricos [26]. Estos hallazgos sugieren que los alelos completamente metilado-p16 pueden ser más estables que los alelos metilados focalmente; sin embargo, esta hipótesis debe probarse adicionalmente usando células monoclonales que contienen alelos p16 con diversos patrones de metilación, incluyendo la metilación focal.
La fusión celular se ha usado para estudiar los mecanismos detrás de regulación de la transcripción de genes y la metilación del ADN alteración [24], [30]. Con el fin de establecer un modelo celular que contiene diversos patrones de metilación de p16, una línea celular de cáncer gástrico con p16 completamente metilado (AGS) se combinó con una línea celular de cáncer gástrico p16-activo (MGC803) a través de la fusión celular. A continuación, estas células de fusión fueron clonados y subclonados antes de la distribución de los sitios CpG metilados y hidroximetiladas dentro de la p16 islas CpG se caracterizó. El estado de metilación de la mayoría de los alelos de p16 en las células de fusión se mantuvo igual que las células parentales. Los bajos niveles de metilación de novo focal, desmetilación, y hidroximetilación también se observaron en las células de fusión; Sin embargo, se encontró que estos cambios sean hechos inestables. Un fenómeno similar se observó también usando la línea celular p16 metilado-hemi HCT116. Estos hallazgos indican que los estados de metilación de las islas CpG de p16 se mantienen homeostáticamente en células de cáncer. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe que sugiera que el estado de metilación de las islas CpG se mantiene homeostáticamente en las células cancerosas no experimentar diferenciación.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
línea celular de cáncer gástrico humano MGC803 se cultivó en medio RPMI 1640 con 10% de FBS. AGS se cultivó en medio F12 con 10% de FBS. MGC803 líneas celulares [31] y AGS (ATCC CRL-1739) fueron amablemente proporcionados por el profesor Yang Ke en el Hospital de Cáncer de la Universidad de Pekín y el Instituto. HCT116 células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Chen Yuanjia, Union Hospital de Pekín (ATCC CCL-247), y se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de SFB.
Generación de los clones de células estables fusión
pBabe-Puro (resistencia a la higromicina) y pIRES2-EGFP (resistencia a la neomicina /G418) vectores se transfectaron a AGS y MGC803 células, respectivamente, utilizando LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, 11668-027) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Puromicina (puromicina
r + -AGS) y G418 (neomicina
r + -MGC803) se llevó a cabo la selección de AGS y líneas celulares MGC803 seguido de cultivo en medio F12 con 10% de SFB y puromicina (0,25 mg /ml) y RPMI 1640 con 10% de FBS y neomicina (700 mg /ml), respectivamente. La fusión se realizó utilizando PEG8000 como se describe anteriormente [32]. Después de la fusión, las células se cultivaron en medio de selección que contiene tanto la neomicina (700 mg /ml) y puromicina (0,25 mg /ml). Después de la selección, las colonias individuales fueron mono-clonados, y después de tres rondas de clonación subsiguiente, se obtuvieron cinco monoclones. Dos de los cinco monoclones fueron escogidos para más mono-clonación.
Los microsatélites
D9S974
y
D9S1749
análisis
El conjunto de cebadores para
D9S974 gratis (sentido, 5'-gagcc tggtc tggat Cataa-3 '; antisentido, 5'-aagct tacag aacca gacag-3') y
D9S1749 gratis (sentido, 5'-AGGAG agggt acgct tgcaa-3 '; antisentido, 5'-tacag ggtgc gggtg Cagat aa-3') se utilizaron para amplificar el
p16
alelos (Figura S1 a). Los genotipos de los micorsatellites se analizaron a 80 ° C por DHPLC usando un detector UV (260 nm) como se ha descrito anteriormente [33].
análisis Cariotipo
Un matraz de 25 cm a 60% de células confluencia se trató con 0,2 mg /ml de colchicina durante 4 horas. Las células se recuperaron después de la tripsinización y el tratamiento con solución /L KCl 75 mmol de 25 min. Las células se fijaron (03:01 metanol: ácido acético)., Y se tiñeron con colorante de Giemsa
preparación de ADN, bisulfito y TAB tratamiento
ADN genómico fue extraído de muestras de tejido con fenol /cloroformo . Las muestras se trataron con 5 mol /L de bisulfito de sodio durante 16 horas a 50 ° C [34]. Para el análisis 5hmC, el ADN genómico se trató usando el kit de TAB de acuerdo con las especificaciones del fabricante (WiseGene, Cat#K001) [35].
inmunoprecipitación hidroximetilado ADN específico (hMeDIP)
ADN genómico se sonicado en 200 pb y 600 pb fragmentos utilizando Bioruptor aparato de ultrasonidos (Diagenode). 100 ng de ADN se sometió a ultrasonidos se guardó como el control de entrada. Cada muestra consistió de 1 g de ADN diluido en tampón IP y se incubaron con 4 l anti-hidroximetilcitosina (5hmC) anticuerpo (Active Motif) a 4 ° C durante la noche sometidos a ultrasonidos. Los complejos anticuerpo-ADN fueron capturadas usando perlas de proteína A /G y luego purificadas. PCR se realizó en todas las muestras usando 35 ciclos con los cebadores 5'-agtcct ccttc cttgc CAAC-3 'y 5'-tccga gcact tagcg AATGt g-3'. Se utilizaron citosina no metilada, 5-metilcitosina, y el ADN 5hmC fragmentos de PCR como controles para verificar 5hmC enriquecimiento.
cromatina-immunoprecipitation (CHIP) ensayos
Los niveles de modificaciones de las histonas y H3K9me3 H3K4me3 se determinaron utilizando chip ensayos como se describe [36].
amplificaciones PCR
el amplicón de 392 pb de la antisentido-capítulo de la
p16
exón-1 se amplificó con los CpG libre imprimación (agagg sentido, 5'-ttttt atttg aggga Tagg-3 '; antisentido, 5'-ctacc taatt CCAAT tcccc TACAA ACTTC-3') conjunto como se describe [37]. El amplicón de 588 pb de la antisentido-capítulo de la
p16
exón-1 y el promotor se amplificó usando el conjunto de cebadores smsp (sentido, 5'-ctacct AATTC CAATT cccct aca-3 '; antisenses, 5'- CCAAT tcccc TACAA ACTTC g-3 ', 5'-CCAAT tcccc TACAA ACTTC atcct CCAAA ATCG-3' y 5'-CCAAT tcccc TACAA ACTTC atcct CCAAA atcac ccg-3 ') [26]. El 369 pb de la cadena sentido de la
p16
exón-1 se amplificó con el conjunto de cebadores CpG libre (sentido, 5'-gttgt agatt tttta tttat ttgga t-3 '; antisentido, 5'- tcccc ttacc taaaa aaata CC-3 ') a la temperatura de recocido 56 ° C. Los 284 pb y 346 pb amplicones de los antisentido-capítulos de la
p16
exón-intrón 2 y 2-se amplificaron respectivamente, con el conjunto de cebadores CpG libre (sentido, 5'-tggta ggtta TGATG atgggt ag- 3 '; antisentido, 5'-aacat aatta ctacc tctaa taccc c-3') y (sentido, 5'-tttgt gggtt tgtag aagta ggtat g-3 '; antisentido, 5'-cctaa tccaa caact AATCC actac c-3') a la temperatura de recocido 57 ° C.
la metilación de las islas CpG cuantificación usando DHPLC
el 392 pb, 369 pb, 284 pb, 346 pb productos de PCR amplificados por los cebadores universales fueron separados utilizando el ADN WAVE Sistema de análisis de fragmentos con un -detector de fluorescencia (FL) (Transgenomic, Inc., OM, EE.UU.) a 57,6, 55,0, 58,0, y 57 ° C, respectivamente [37], [38]. Se utilizó el tampón WAVE-HS1 FL-dye (Transgenomic, Inc.) para mejorar la FL-intensidad de los productos de PCR (etiquetado post-columna universal). ADN HCT116 genómico se utilizó como control estándar.
Clonar secuenciación
PCR se realizó en el bisulfito de ADN convertidos. Los amplicones se clonaron en el vector pCR-blunt (Invitrogen), transformado en
E. coli
, y se secuencia utilizando un ABI 3730 analizador.
p16
RT-PCR
se detectó p16
ARNm como se describe [12] .
P16 tinción de inmunofluorescencia
La tinción de inmunofluorescencia se realizó tal como se describe anteriormente [39]. En resumen, células de fusión se fijaron en formaldehído al 4% /PBS durante 10 min antes de un lavado de 5-min en PBS. muestras fijadas se bloquearon durante 30 minutos con 0,5% Triton X-100 /PBS a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpo anti-P16 (Abcam, ab54210) durante 1 hora a 37 ° C, después se lavaron con 0,5% Triton X-100 /PBS, después se incubaron con anticuerpo IgG de conejo de cabra anti marcado con rodamina durante 1 hora a 37 DO. DAPI (1:2000) se utilizó para teñir el núcleo de la célula. Las fotografías fueron tomadas en un microscopio confocal Leica.
Resultados
Establecimiento y caracterización de un modelo de fusión celular con diversa metilados
p16
alelos
La entrada ha sido informaron que heterocariones pueden inducir variación metilación del ADN a través de la fusión celular de dos líneas de células [30]. La hipótesis de que un modelo de fusión de células que contienen diferentes estados de metilación de las islas CpG p16 podría duplicar los procesos de metilación o desmetilación de novo. Por lo tanto, se construyeron puromicina
r + células que contienen -AGS completamente alelos metilados-p16 y la neomicina
+ r células -MGC803 que contienen alelos metilados-p16, respectivamente. Estas dos líneas celulares se fusionaron después y se cultivaron en medio de selección que contiene tanto puromicina y neomicina. Después de tres rondas de clonación, los monoclones de fusión se caracterizaron utilizando dos microsatélites D9S974 y D9S1749 () cerca del locus p16 (Figura S1 A). patrones de microsatélites D9S1749 dos cromatogramas (C7 /C9 /E10 y D3 /E3) y un patrón de D9S974 se observaron en 5 monoclones probados que diferían de los patrones de sus células parentales. Modo cromosoma también fue diferente entre el clon representativo E10 (casi tetraploide) y sus células parentales (cerca-diploides) (Figura S1B).
mantenimiento estable completamente metilado y unmethylated-
p16
alelos en las células cancerosas
El estado de metilación de las islas CpG p16 (392 pb) se analizó cuantitativamente en estos clones de fusión utilizando un ensayo de DHPLC como se informó anteriormente [37]. Como se vio en las células HCT116 p16 hemi-metilado, la relación de methylated- a moléculas no metilado-p16 era sobre 01:01 en estos clones de fusión (Figura 1 A-izquierda). La proporción de alelos metilados-p16 se mantuvo de forma estable en un clon representativo de los pasajes 45, 50, 55, y 60 (Figura 1 A-derecha). Además, RT-PCR detectó mRNA p16 en los 5 clones analizados (Figura 1B). la proteína P16 nucleoplasmic también se observó dentro de cada célula en dos monoclones representativos (C9) y E3 (Figura 1C). Sobre la base de esta información, es evidente que los estados de transcripción /metilación de los alelos de p16 en las células de fusión es probable mantienen en un patrón similar al de sus células parentales.
(A) Los estados de metilación de
p16
islas CpG en las monoclones de fusión fueron analizados mediante DHPLC (izquierda). La proporción de methylated-
p16
en el monoclone-E10 se mantuvo estable en los pasajes 45, 50, 55 y 60 (a la derecha). (B) RT-PCR muestra la variación de la expresión de ARNm
p16 Hoteles en los monoclones de fusión y su MGC803 de los padres y las líneas de células AGS. (C) confocal de inmunocitoquímica muestra la tinción variando la expresión de p16 en las diversas líneas celulares.
Focalmente metilado
p16
alelos no son estables en las células cancerosas
Curiosamente, mientras mayoría de las moléculas de p16 permanecieron en los estados completamente metilados o no metilados, los clones de fusión representativos contenían aproximadamente 27% (13/48) focalmente methylated- (o demethylated-) moléculas de p16 en la región exón-1 (Figura 2B). Sin embargo, las células parentales homocigótica metilados o no metilados, no mostraron los mismos cambios de metilación. Con el fin de confirmar que el clon ensayado fue, de hecho, monoclonal, este clon se subclonó más. Un análisis más detallado reveló que los patrones de metilación de p16 en dos subclones constantemente se mantuvo similar a sus clones parentales (Figura 2C y Figura S2).
(A) secuenciación de bisulfito clon del fragmento de 392 pb de la
p16
isla CpG en AGS y MGC803 células; Cada barra verde representa un sitio CpG. nucleosomal ubicación en el exón-1 también está marcado (26). (B y C) secuenciación de bisulfito en la fusión monoclone-E3 y subclones. cambios en la metilación focales (amarillo-sombreado); sitios CpG metilados (punto rojo); sitios CpG no metilados (punto blanco); focalmente methylated- o demethylated-
p16
moléculas (flechas negras). (D) modelo homeostático metilación de una sola isla CpG en las células tetraploides.
Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) (rs36228836) se identificó en la región promotora de p16. Se determinó que el genotipo de este SNP diferían entre las dos líneas celulares de sus padres (T /A para MGC803 y T /T para el AGS) figura, por lo que es posible identificar las p16 A-alelos MGC803-específicos en las células de fusión ( S3). Con el fin de aclarar si estos fragmentos focalmente metilados fueron el resultado de la metilación de novo o desmetilación, los estados de metilación dentro de un fragmento de 588 pb que abarca este SNP se analizaron mediante un ensayo de PCR específica de metilación siembra (SMSP). Se descubrió que la metilación de CpG de los alelos de p16 en los sitios de metilación "siembra" dentro del intrón-1 se enriquecieron con eficacia [26]. Los resultados de la secuenciación con bisulfito focal confirmaron que la metilación de novo se observó en los A-alelos específicos de MGC803-monoclone-D3 (Figura S3).
Con el fin de investigar si el transitorio focalmente existe alelos metilados-p16 en las células no son de fusión, también se analizó el patrón de metilación de la línea celular HCT116-metilado hemi p16. Del mismo modo, 16% (8/49) de las moléculas de p16 mostró metilación focal en las células HCT116 (Figura 3). Además, mediante el uso de un del /ins lectura mutación de cambio de marco de la región de codificación de exón-1 como un marcador genético, se determinó que tanto focal metilación de novo en los alelos mutantes G-inserción (principalmente no metilado) y la desmetilación en la alelos de tipo salvaje (principalmente metilado) también ocurren esporádicamente en las células HCT116 (4/26 y 4/23, respectivamente). Esto indica que la metilación focal y la desmetilación de los alelos de p16, de hecho, existir en las células de cáncer no son de fusión. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que mientras que la metilación focal y la desmetilación son eventos relativamente común, la mayoría de los alelos completamente methylated- y no metilado-p16 se mantienen de forma estable en células de cáncer.
(A) de bisulfito de secuenciación de clon de la 392 bp fragmento de la
p16
isla CpG en células HCT116. De tipo salvaje (
eliminación
) /mutante (G
inserción
)
p16
alelos; focalmente demethylated-
p16
moléculas (flechas negras); focalmente
de novo
moléculas metilados (flechas rojas). (B) Modelo de metilación homeostático para una sola isla CpG en las células diploides.
Con el fin de estudiar si la metilación focal /desmetilación ocurre en el cuerpo de genes, se analizaron los estados de metilación de las islas CpG dentro la p16 exón-2 y el intrón-2. análisis de DHPLC reveló que estas dos islas CpG estaban completamente metilados en AGS, MGC803, y las células HCT116 (Figura S4A & amp; B), y bisulfito de secuenciación de la isla intrón-2 CpG confirmado los resultados DHPLC (Figura S4C), lo que sugiere el cuerpo gen es homogénea y estable metilado en estas células y no está acompañada focal metilación /desmetilación.
concomitante se produce 5-hidroximetilación en el
p16
alelos de células de fusión
metilación del ADN y hidroximetilación no se puede diferenciar fácilmente utilizando ensayos de metilación basado en bisulfito regulares. El papel de la hidroximetilación en el metilación p16 focal o desmetilación se investigó usando un ensayo de hMeDIP-PCR (Figura 4A, gráfico de la izquierda). Los resultados de este ensayo mostraron que la cantidad de ADN hidroximetilada-p16 en los dos clones de fusión fue significativamente mayor que sus células parentales (Figura 4A, gráfico de la derecha)
.
(A) Immuno-precipitación y PCR análisis de sintética y celular 5hmC que contienen
p16
secuencias. Los AGS y fusión de células monoclone-D3 y E3 muestran niveles significativos de 5hmC. (B) Análisis TAB-ss revela completamente hydroxymethylated-
p16
alelos en los subclones de fusión, pero no las células de los padres. (C) Análisis TAB-ss de las células HCT116 muestra la mayor parte de la de tipo salvaje
p16
alelos son completamente hidroximetilada.
Tet-asistente de secuenciación de bisulfito (TAB-ss) es capaz de detectar específicamente metilcitosina 5-hidroxi- (5hmC) en el ADN en una sola resolución de base [35]. Utilizando este ensayo para analizar el contenido 5hmC en el p16 islas CpG en los detalles, se encontró que las células AGS exhiben CpG hidroximetiladas esporádicos a una frecuencia muy baja (21/700), mientras que las células MGC803 no mostraron ninguna hidroximetilación. Como se esperaba, se detectaron tanto hidroximetilación completa y focal de alelos de p16 en estas células de fusión (Figura 4B). Los resultados de dos ensayos indican consistentemente que hidroximetilación puede jugar un papel en el mantenimiento homeostático de la metilación de p16 en las células de fusión.
Análisis de las células HCT116 inesperadamente reveló hidroximetilación frecuente y completa en los antisentido hebras de la de tipo salvaje p16 (DEL) alelos (11/14), pero no en el G-alelos mutantes de inserción (Figura 4C). Si bien se detectó metilación en el fragmento de 369 pb del sentido de hebra de la p16 exón-1 en las células HCT116 como se esperaba (Figura 5A-C), en particular, la hidroximetilación completa no se observó en el sentido de hebras en tanto TAB-DHPLC análisis y secuenciación-TAB (Figura 5C y D), lo que sugiere hidroximetilación específica la cadena antisentido.
(A) Localización de la amplificación de 369 pb de la cadena sentido
p16
exón-1. (B) Detección de los 369 pb productos de PCR usando DHPLC (modo de calibrado) a 48 ° C. (C) La detección de las moléculas amplificadas hidroximetiladas de la
p16
sentido de hebra después de la modificación TAB usando DHPLC (detector FL) a la temperatura de desnaturalización parcial de 55 ° C. Bajo esta condición, los
p16
moléculas hydroxymethylated- y unhydroxymethylated- son parcialmente y totalmente desnaturalizado, respectivamente. Las plantillas regulares tratado con bisulfito se usan como controles de referencia. (D) Los resultados de TAB-secuenciación de los 369 bp productos PCR amplificados a partir de células HCT116.
Con el fin de determinar si los alelos de tipo salvaje de p16 por completo hidroximetiladas son transcripcionalmente activo, el alelo de origen de las transcripciones de p16 se caracterizó por secuenciación de clon. Los resultados de la secuenciación revelaron que ninguno de los 48 p16 moléculas de ARNm se transcribe a partir de los alelos de tipo salvaje de p16 que eran asimétricamente metilado y hidroximetilada (M:H) (Figura 6). Esta información demuestra que hidroximetilación en la cadena antisentido de los alelos de p16 puede no conducir a la activación transcripcional del gen.
(A) RT-PCR secuenciación de clon de la línea celular de control 293T (del) muestra tipo salvaje
p16
ARNm. El HCT116 (G-ins) línea celular mutante revela sólo
p16
clones de ARNm. (B) muestran resultados de la secuenciación Clon tanto de tipo salvaje y el ARNm de p16 mutante.
concomitante de H3K4 histonas y H3K9 trimethylation en el
p16
alelos en células de fusión
chip -PCR se utilizó para determinar cuantitativamente los niveles de H3K4me3 activo y represivo H3K9me3 en las células de fusión (Figura 7). El nivel H3K4me3 en los alelos p16 heterogéneamente metilados de los subclones de fusión se encontró que era significativamente menor de lo que se ve en los alelos completamente no metiladas de las células MGC803. Además, el nivel de H3K4me3 en el exón-1 de la cromatina se determinó que era más alto que fue encontrado en el promotor de la cromatina. Mientras que el H3K4me3 no se detectó en las células AGS, el nivel H3K9me3 fue significativamente mayor en esta línea celular que otras líneas celulares. nivel H3K9me3 mostró una correlación inversa con el nivel H3K4me3 entre estas líneas celulares.
(A) El nivel H3K4me3 activo dentro de la
p16
islas CpG en los subclones de fusión y MGC803 células fue significativamente más alta que células AGS, especialmente en la región de exón-1 (monoclones vs. AGS, P & lt; 0,01). (B) El nivel H3K9me3 represivo de los subclones de fusión y células AGS fue significativamente mayor que MGC803 células, especialmente en la región promotora (monoclones vs. MGC803, P & lt; 0,01).
Discusión
el patrón de metilación del ADN se conoce para cambiar dinámicamente durante la diferenciación de células madre embrionarias y desarrollo de los tejidos en vertebrados. Sin embargo, sigue siendo un misterio cómo se mantienen los estados de metilación del genoma en las células ya no someterse a la diferenciación. En el presente estudio, se encontró que los estados de metilación de methylated- por completo y unmethylated-
p16
alelos se mantuvieron estables durante la proliferación celular. Además, los niveles bajos de desmetilación focal, hidroximetilación, y
de novo
metilación se produjeron con relativa frecuencia en dos tipos de
p16 y modelos celulares de cáncer de hemi-metilado, pero no en células homogéneamente metilados o no metilados. Estos resultados implican que la metilación homogénea puede ejercer presión sobre la represión
p16
gen que puede afectar al menos parcialmente, las islas CpG no metilados anteriormente. Por el contrario, la presión ejercida por la transcripción desmetilación completa del gen es capaz de inducir y mantener la desmetilación de
p16
islas CpG. Hidroximetilación de
p16
alelos CpG se descubrió también jugar un papel en el mantenimiento homeostático de la metilación del genoma. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe para demostrar que el estado de metilación de un gen supresor de tumor se mantiene homeostáticamente en células de cáncer.
La estabilidad de los alelos de p16 metilado aún no se ha explicado. En las lesiones de gastritis, los estados de metilación de la mayoría de los alelos de p16 son inestables y H. pylori dependiente [27], [28]; sin embargo, en líneas celulares de cáncer que han demostrado siendo notablemente estable [29]. Nuestros estudios recientes de secuenciación integrales revelaron que los sitios CpG metilados en gastritis se encuentran dentro de la región de exón-1 del gen p16, sino que se extienden en la región promotora después del desarrollo de carcinoma gástrico. Esto implica que completamente alelos metilados-p16 son considerablemente más estables que sus contrapartes focalmente metilados [26]. También se ha informado de que heterocariones pueden inducir variaciones de metilación del ADN a través de la fusión celular de dos líneas de células, y, además, que algunas moléculas de p16 silenciado en células de cáncer de ratón pueden ser reactivados después de ser fusionado con el ratón las células madre embrionarias de p16-activo [30], [39]. En el presente estudio, se establecieron las células de fusión que contienen una amplia variedad de patrones de metilación de p16 a partir de líneas celulares parentales homocigótica metilados y no metilados con el fin de investigar la estabilidad de los alelos focalmente y completamente metilado-p16 dentro de la misma célula. Como era de esperar, los alelos de p16 de las células de fusión mostraron una gama completa y variable de metilación. Los alelos de p16 en los clones de fusión y sus subclones se mantuvieron de forma estable hemi-metilado durante pases de células, lo que indica que estos alelos p16 completamente metilados y no metilados son relativamente estables. Por otra parte, los clones de fusión hemi-metilado y células HCT116 mostraron niveles bajos de /alelos metilados focalmente-desmetilado de p16, que proporcionan evidencia directa de que los alelos de p16 hemi-metilada son menos estables que los alelos de p16 homogéneamente metilados. Esto, patrón de metilación dinámico, pero aún homeostático de p16 islas CpG puede ofrecer un mecanismo común que explica el mantenimiento de metilación del ADN en las células estáticas de diferenciación. Además, dos islas CpG en la p16 exón-2 y el intrón-2 son homogéneamente metilada en HCT116, AGS, y MGC803 células, por lo tanto, es probable que el mantenimiento homeostático de la metilación de p16 se pudo observar sólo en su /exón-1 región promotora en estas células. Debido a que hay muchas regiones con hemi metilados presentes en el genoma, tales como los cromosomas X de las células femeninas y los genes impresos, estudios adicionales en cuanto a si focal, la metilación transitoria y desmetilación son fenómenos generales de mantenimiento homeostático de la metilación del ADN, sin duda se justifica.
5hmC juega un papel crucial en la desmetilación del ADN activo como un intermedio en la oxidación de metilcitosina en serie. Sin embargo, una cierta proporción de 5hmC no se oxida más allá, sino que se mantiene en el genoma de los tejidos de adultos, tales como el cerebro y colon. Aunque las funciones adicionales de 5hmC en el genoma siguen siendo desconocidos, es probable que sirva un propósito importante. Se ha informado de que hidroximetilación en ambos lugares promotor y intragenic correlacionó positivamente con la expresión de genes [40]. En general, las islas CpG no están metiladas en las regiones alrededor de los sitios de inicio de transcripción en los genes transcritos activamente, pero están metilados en el cuerpo de genes. Recientemente, se ha informado de que hidroximetilación en el genoma del cerebro es TET2-dependiente y más hidroximetilación se detecta en el sentido de hebras que los antisentido-capítulos de los órganos de genes activamente transcrito [41], [42].