Extracto
El
CCS3
locus en el cromosoma 3 del ratón regula la susceptibilidad diferencial de a /J (a, susceptible) y C57BL /6J (B6, resistentes) cepas de ratón a-inducido químicamente cáncer colorrectal (CRC). Aquí, se presenta la cartografía de alta resolución posicional del gen que subyace en la
CCS3
efecto. Uso de correlación fenotipo /genotipo de una serie de 33 ACB /cepas de ratón congenic recombinantes BCA, así como en grupos de poblaciones de retrocruzamiento que llevan cromosomas recombinantes únicas para el intervalo, y en cepas subcongenic, hemos delineado el tamaño máximo de la
CCS3
intervalo física a un segmento ~2.15 Mb. Este intervalo contiene 12 anotado transcripciones. La secuenciación de los candidatos posicionales en A y B6 identificado muchos cambios de codificación, ya sea de baja prioridad o variantes de codificación no proteicos. Hemos encontrado una variante número de copia única (CNV) en el intrón 15 del gen
NFKB1
. La CNV se compone de dos copias de una secuencia de 54 pares de bases inmediatamente adyacente al sitio de empalme exón 15, mientras que sólo una copia se encuentra en CRC-susceptible A. La proteína NFKB1 (p105 /p50) expresión se reduce mucho en un tumores en comparación a la normalidad Un epitelio del colon como se analiza por inmunohistoquímica. Los estudios en los macrófagos primarios de A y ratones B6 demuestran una marcada activación diferencial de la vía de NFkB por lipopolisacárido (cinética de estimulación y máximos niveles de I? B? Fosforilada), con una activación más robusto que se asocian con resistencia a la CRC. NFkB ha sido implicado anteriormente en la regulación de la homeostasis y la respuesta inflamatoria en la mucosa intestinal. El intervalo contiene otro candidato posicional
Slc39a8 Windows que se expresa diferencialmente en dos puntos A vs B6, y que recientemente se ha asociado en la agresividad del tumor CRC en los seres humanos
Visto:. Meunier C, Van Der Kraak L, Turbide C, Groulx N, Labouba I, Cingolani P, et al. (2013) posicional Mapeo y análisis de genes candidatos del ratón
CCS3
Locus diferencial que regula la susceptibilidad a la inducidos por carcinógenos cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (3): e58733. doi: 10.1371 /journal.pone.0058733
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de diciembre de 2012; Aceptado: 5 Febrero 2013; Publicado: 14 de marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Meunier et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación a PG y NB de la Sociedad de investigación del cáncer del Instituto canadiense [www.cancer.ca/Research.aspx], la investigación del cáncer Society Inc. [www.src-crs.ca/en-CA] y el Canderel Programa de iniciativa [www.deficanderel.com/3/donate.htm] del Centro de Investigación del cáncer Goodman [cancercentre.mcgill.ca/research/]. PG es un profesor James McGill de Bioquímica. CM recibió apoyo beca y premios de viaje desde el Programa de Investigación del Cáncer de McGill Integrado de Formación (MICRTP) y la Fundación Peter Quinlan [www.mcgill.ca/gcc-research/funding/] a través de la Facultad de Medicina de la Universidad McGill. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la patogénesis del cáncer colorrectal (CRC) se asocia con la acumulación secuencial de mutaciones en genes específicos, que causa progresión gradual de las lesiones pre-neoplásicas a adenocarcinoma completo soplado [1]. etapas histopatológicos que correlacionan con reordenamientos moleculares somáticas están bien descritas [1], [2]. Sin embargo, sólo en los últimos años y con el advenimiento de los estudios de asociación de genoma tiene el grado de complejidad de las interacciones entre los componentes genéticos y ambientales que contribuyen a la etiología del cáncer colorrectal humano ha apreciado [3], [4], [5] , [6]
en una pequeña proporción de los casos de CCR (& lt; 10%)., un determinante genético claro y muy penetrantes se puede observar en los síndromes de cáncer hereditario, lo más importante es poliposis adenomatosa familiar (FAP), Lynch El síndrome (no asociado a poliposis el cáncer de colon hereditario) y alternativamente, las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) -ligada CRC [7], [8]. Por otro lado, la mayoría de los casos de CCR (& gt; 90%) son esporádicos sin historia familiar previa. La etiología de la esporádica CRC implica interacciones bidireccionales entre un componente genético complejo, y los factores ambientales mal definidos [3], [6]. Hasta la fecha, unos 16-20 variantes de baja penetrancia comunes han sido identificados en estudios de asociación de genoma completo (GWAS) para CCR esporádico humana [9], [10]. Casi la mitad de los loci están estrechamente relacionados o alélica con componentes de la vía de señalización de TGF: SMAD7, GREM1, BMP2, BMP4, RHPN2 y LAMA5 ([11], [12], revisado en [13]). Por otra parte, se ha propuesto que al menos 170 tales loci pueden contribuir a la susceptibilidad CRC en los seres humanos [13].
Más del 25% de todos los cánceres se cree que son asociadas con la infección crónica, inflamación o otros tipos de respuesta inflamatoria [14]. La inflamación crónica ha sido recientemente apreciado como un importante contribuyente a la etiología de la CRC en los seres humanos [15], [16], revisado en [13]. Por lo tanto, los pacientes afectados por enfermedades inflamatorias del intestino (EII) tienen un riesgo mucho mayor de desarrollar colitis asociada (CA) CRC, el grado de la manifestación colitis correlación con la incidencia de la CA-CRC [17]. Además, los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) muestran un efecto protector contra diferentes tipos de cáncer [18]. Curiosamente, varios componentes clave de las vías de respuesta inmune Th17 y Th1 mediadas por TGF recientemente han sido identificados como loci de baja penetrancia asociado con EII inicio, lo que podría implicar TGF señalización tanto en IBD-Linked así como CRCs esporádicos ([15], [ ,,,0],16], revisado en [19], [20]).
el ratón representa un modelo experimental valioso para diseccionar el componente genético complejo de CRC humano. Los ratones están disponibles como cepas puras fijos de homocigosis para diferentes variantes alélicas que representan una amplia diversidad genética en los genes y las vías pertinentes a CRC patogénesis clave. Además, el CRC se puede inducir de una manera reproducible y bien controlado por mutágenos químicos tales como azoximetano (AOM) [21], [22]. Los tumores resultantes se parecen mucho a su contraparte humana con respecto a la histopatología (a partir de focos de criptas aberrantes a carcinoma
In situ
) y las alteraciones genéticas subyacentes (mutaciones en
Apc
,
Kras
y
ß-catenina
) [23], [24]. puras cepas de ratón muestran marcadas diferencias en la susceptibilidad a inducidos por carcinógenos CRC y análisis de ligamiento clásica en cruces informativos han localizado varios loci que regulan las diferencias inter-deformación en la susceptibilidad [25], por ejemplo,
CCS1
[26],
Ssic1
[27], y
CCS2
[28]. Estudios paralelos en congenic cepas derivadas de BALB /cHeA y STS /A sugirieron una pluralidad de loci adicionales (
la Scc1
a
SCC15
) CRC respuesta que afecta al agente carcinógeno inducido por [29], [30 ]. De ellos, la clonación posicional de la
la Scc1
locus condujo a la identificación de los
Ptprj
como gen causante, y reordenamientos somáticos en el homólogo humano
PTPRJ
fueron identificados en humanos CRC [31], [32].
En el modelo de carcinogénesis química OMA, C57BL /6J cepa (B6) es resistente a los pocos tumores CRC observó 18 semanas después del inicio del tratamiento (típicamente 0-5 tumores), mientras que A /J (A) son muy susceptibles con el número de tumores que varía entre 20-50 [33]. En nuestro laboratorio, hemos utilizado un conjunto de ACB /líneas BCA recombinantes congenic mouse (RCS) derivadas de la CRC-resistente Un B6 y CRC-susceptibles de identificar los determinantes genéticos responsables de la susceptibilidad diferencial de estas cepas de CRC inducida por AOM. Las cepas 13 ACB y 22 de BCA se obtuvieron mediante la endogamia sistemática de una doble retrocruzamiento (N3), y cada cepa contiene una pequeña cantidad (12,5%) del ADN de uno de los padres fija como un conjunto de segmentos congenic discretos (mapeados por genotipo) en el fondo (87,5%) del otro padre. Loci individuales de resistencia /susceptibilidad que contribuyen a un rasgo complejo pueden segregar en RCS individuales y pueden ser estudiados de forma aislada, lo que facilita los estudios de identificación de genes. Esto llevó a la cartografía de los tres loci (
CCS3
,
CCS4
,
Ccs5
) regulación de la respuesta al CRC inducida por AOM en estas cepas [33], [34] , [35]. El
CCS3
locus determina la susceptibilidad inicial a la CRC inducida por AOM (aparición de adenomas), mientras que el
Ccs5
locus modula el número de tumores en animales portadores de alelos de susceptibilidad a
CCS3
[ ,,,0],34]. El
CCS3
locus fue asignada a un segmento de 14 Mb en la parte central del cromosoma 3. Este intervalo contiene 94 transcripciones anotadas, y varios de estos genes muestran expresión robusta en el colon, en sí, regulados en una cepa específica la moda.
en el presente estudio, hemos llevado a cabo análisis genéticos de cepas ACB /BCA y en cruces derivados de ellos para reducir aún más el tamaño de la
CCS3
intervalo genética a 2,2 Mb. Hemos caracterizado además los genes en el intervalo de perfiles de expresión y secuenciación del ADN genómico.
Resultados
congenic recombinante Delineación del intervalo CCS3 en AcB /BcA y A x B /BXA cepas endogámicas recombinantes
fenotipificación un subconjunto de 23 cepas ACB /BCA para la susceptibilidad a la CRC inducida por AOM inicialmente mostró que la susceptibilidad diferencial de a y las cepas de ratón B6 para CRC está regulada por un solo locus designado
CCS3
. En estos estudios,
CCS3
fue asignada a un segmento de 14 Mb en la parte central del cromosoma 3 [33]. Para delimitar mejor el
CCS3
intervalo de genética, que phenotyped /cepas adicionales ACB BCA (para un total de 33 cepas), así como un subconjunto de cepas AXB /BXA (AXB19, AXB24, BXA2, BXA8, BXA12 ), con algunas de estas cepas recombinantes que llevan haplotipos informativos en el
CCS3
región. Los grupos de ratones fueron tratados con 1 dosis semanal de inyección de AOM durante 8 semanas, y 11 semanas más tarde, los animales se sacrificaron, se recogieron dos puntos y se puntuaron los tumores. Las cepas fueron estratificados de acuerdo con el número de tumores detectados, ya sea bajo /intermedio (≤ 10 tumores) o altas (& gt; 15 tumores) [33]. A continuación, este patrón de distribución de la deformación bimodal se superpone a la combinación haplotipo conocido de alelos A y B6 para el cromosoma 3 distal (
CCS3
) en estas cepas. Un resumen de todos los datos disponibles a la ACB /BcA y A x B /BXA cepas se muestra en la Figura 1A. Este análisis confirmó el papel crítico de
CCS3
alelos en la susceptibilidad CRC rasgo, y las cepas se determinaron nuevos AcB52 y AcB60 como llevar haplotipos recombinantes informativos que delimitan aún más los límites del locus en los lados proximal y distal, respectivamente. Para delinear mejor los puntos de interrupción de recombinación en estas cepas, hemos desarrollado varios marcadores adicionales informativos (microsatélites y marcadores SNP) en esta región por secuenciación del ADN genómico de A y padres B6 (ver sección Materiales y Métodos). El uso de estos marcadores, delineamos aún más los puntos de interrupción de recombinación en el lado proximal (AcB52), entre los marcadores P3-17 (pst. 132,558 Mb) y P3-19 (pst. 132,562 Mb), y en el lado distal (AcB60) entre los marcadores D4-11 (pst. 136.18 Mb) y rs30215915 (pst. 136.20 Mb) (fig. 1B). Estos estudios reducen aún más el tamaño del intervalo física máxima de la
CCS3
locus de 3,64 Mb (P3-17 a rs30215915).
A. Cromosoma 3 haplotipos de cepas ACB /BcA se muestran junto con su resistencia (blanco) o la susceptibilidad de estado (negro) de CRC inducida por AOM (banda inferior). Los segmentos cromosómicos B6 derivado se indican en gris (2), mientras que los haplotipos A son anotados en blanco (1). Las flechas (↓) indican cepas clave RCS que delimitan el intervalo mínimo cromosómica para la
CCS3
locus. B. mapa de haplotipos detallada de la
CCS3
locus, incluyendo el trazado de los extremos proximal y distal límites por genotipo SNP de alta densidad en las cepas congenic informativos clave (AcB52, AcB60).
alta resolución de mapeo de posición del locus CCS3 por las pruebas de progenie de los ratones de retrocruzamiento informativos
En estos estudios, se produjo (B6xA) F2 animales, que se genotipo para identificar los recombinantes informativos dentro de la
CCS3
intervalo , utilizando marcadores rs30055788 en el lado proximal y rs30215915 en el lado distal. Entre un conjunto de 240 F2 animales examinados, se identificaron 3 recombinantes informativos que fueron designados RecA, RecB y RecC. A continuación, se backcrossed Cada recombinante en la progenie tanto B6 y de un fondo, y múltiple a partir de cruces individuales entonces fueron genotipados para marcadores en el intervalo y phenotyped para la susceptibilidad a la CRC (Fig. 2A, 2B). En este análisis, la progenie de retrocruzamiento entre el ratón Rec individuales (A, B, C) y los padres, ya sea A o B6 muestran una mezcla de haplotipos recombinantes en la región con combinaciones de homocigosis para A o alelos B6 o heterocigosidad para /B alelos A (Fig. 2B). Por último, comparamos el genotipo de los cromosomas recombinantes con el fenotipo de A y retrocruzamientos B6 derivados de ellos (Fig. 2A, 2B). controles de los padres A los números desarrollados alta tumorales (X = 45,5; Fig. 2A) mientras que los controles B6 eran bajos (X = 1,0; p & lt; 0,0001). Las pruebas de progenie de RecB y RecC backcrossed a B6 mostró los números agregados tumorales en estos ratones similares a los controles B6, de acuerdo con la homocigosis para haplotipos B6 en la porción distal de la
CCS3
región previamente definida. Por el contrario, las pruebas de progenie de RecA y RecB cruza a A mostró números de tumores en estos animales que no fueron estadísticamente distinto de los detectados en los controles parentales A (aunque RecB XA eran más intermedia), de acuerdo con homocigosis para el alelo A en la porción distal de
CCS3 gratis (Mb134.0-136.2). Por último, se observó un tercer grupo de animales que muestran el número de tumores intermedia entre la de los dos extremos de los padres (X = 8,5;
p
& lt; 0,001, ya sea para comparación); éstos incluyeron RecA x B6 (genotipo BB proximal /AB distal; genotipo AB proximal /AB distal), RecB X B6 (proximal AB, AB distal), RecB XA (AA proximal /AB distal), y RecC XA (proximal AB, AB distal). En este grupo de animales, hubo una fuerte correlación entre el número de tumores intermedio y la heterocigosidad para /B haplotipos A en la porción distal de la
CCS3
intervalo, consistente con el patrón de co-dominante de herencia de
CCS3
alelos que ya se ha informado [33]. El efecto combinado de A /A, A /B y alelos B /B en la porción distal de
CCS3
se muestra en la Figura 2C. Estos experimentos reducirse aún más el tamaño de la
CCS3
intervalo para ~2.15 Mb, tal como se expone en el lado proximal por eventos de recombinación recíprocas en RecA y RecB (en el intervalo de rs31197594 y rs52356981) y en el lado distal de la recombinación evento en AcB60 (rs31197594 en el intervalo de rs30215915) (de la Fig. 1).
a. Después del tratamiento AOM, los dos puntos se disecaron, se fijaron y el número de tumores se calificó como (ratones individuales se muestran como "•"). Controles y ratones retrocruzamiento correspondientes a los recombinantes clave (Rec A, B y Rec Rec C), donde crían a A /J (indicados A) y C57BL6 /J (indicado como B). Los ratones se agruparon por haplotipo en el
CCS3
locus y animales recombinantes llevan un haplotipo diferente en cada mitad de la
CCS3
intervalo. Se identifican los grupos que muestran los números de tumores estadísticamente diferente forma el grupo parental A (#). B. El
CCS3
haplotipo del cromosoma 3 distal de cada grupo de ratones phenotyped en el panel (A) se muestra en negro (B6), blanco (A /J) o rayas (heterocigotos). Las líneas discontinuas muestran el intervalo primero identificado en RCS (flecha), así como el intervalo de genética reducida para
CCS3
ha sugerido por un evento de recombinación en Rec A y B entre los marcadores Rec rs31197594 y rs52356981, en el lado proximal (cuadro ). El límite distal se estimó a partir de estudios en congenic cepas recombinantes a partir de la Figura 1B. C. Agregados genotipo /fenotipo correlación de ratones retrocruzamiento agrupado para la reducción de
CCS3
intervalo (Mb134.0-136.2).
candidatos posicionales para el locus CCS3
El ~2.15 Mb
CCS3
intervalo contiene 12 genes de codificación, una ARN micro (
Mir1895
), así como varios ARN no codificantes largos (lincRNA) y uno retroposon (Fig. 3A , y los datos no se muestra). La secuencia del segmento 2.15 Mb se comparó entre A y B6 usando secuencias del genoma de referencia disponibles en el Wellcome Trust Sanger Institute [36], y una lista completa de todas las variantes exonic, intronic y intergénicas se presenta en la Tabla S1. No hay SNPs que distinguen A y B6, ya sea en
Mir1895 gratis (pst) 133903469-133903547 ni en los lincRNAs y retroposon presente en las posiciones 134810372-134810477 (105 nt), 135099190 a 135.100.723 (1537 nt), 135158617 -135 158 847 (231 nt), 135188928-135.189.496 (569 nt), 135390302 a 135.391.702 (1401 nt), 135626423-135626782 (360 nt) de los conjuntos de datos Ensembl. Por lo tanto, es poco probable que estos ARN no codificantes son responsables de la
CCS3
efecto, a pesar de una contribución de este tipo de ARN no codificantes todavía no se puede excluir formalmente. Entre los 12 genes que codifican anotados en el intervalo (
Cxxc4
,
Tacr3
,
CENPE
,
Bdh2
,
Nhedc2
,
Nhedc1
,
Cisd2
,
Ube2d3
,
Manba
,
NFKB1
,
Slc39a8
,
Bank1
), un número de variantes de nucleótidos distinguir a y B6 (Tabla 1, Tabla S1), con aminoácidos no sinónimo sola variantes encontradas en Manba (L844F) y Bank1 (A375M). Manosidasa beta un (Manba) es una enzima lisosomal, la inactivación de los que causa beta-manosidosis, una enfermedad de almacenamiento lisosomal con un amplio espectro de afectación neurológica [37]. Por lo tanto, una variante patológica en este gen es poco probable que cause la susceptibilidad a la CRC. Por otro lado, la variante A375M en Bank1 (B andamio de proteínas de células con repeticiones de anquirina) es una sustitución conservativa que afecta a un residuo no conservado en parientes BANK1 (datos no mostrados), y por lo tanto es poco probable que sea patológica.
A. El
CCS3
locus contiene 12 anotado transcripciones, cuya posición, dirección de la transcripción (flecha), y se muestran la posición de los marcadores SNP de referencia. B. La posición de los productos de amplificación de largo alcance utilizados para la secuenciación profunda de
Nfκb1
se muestra a escala, junto con la posición de los exones 25 codificantes y no codificantes del
Nfκb1
. Se muestra la posición de la eliminación intrónica 54 pb identificado en A /J. Se corresponde con la pérdida de un 54 repetición directa pb que está presente en dos copias en B6 (sombreada en gris), que su vez se compone de una estructura de 3-repetición (identificado por las flechas por encima de la secuencia). Se muestra la posición de la variante de número de copias con respecto al exón 15 del gen, junto con una proyección del exón 15 secuencia traducida en la estructura de proteína predicha. p50 predicho y porciones IκBγ de la proteína se muestran, junto con el dominio Rel homología (RHD), anquirina-repite (ANK), dominio de muerte (DEAD) y la región rica en glicina (G) p50 separar y p105 (llamados IκBγ).
Hemos informado anteriormente transcrito de ARN perfiles de estudios, la comparación de la expresión de genes en el
CCS3
interval tanto para una mucosa normal versus B6, y por mucosa normal vs. Los tumores de los ratones A [33]. Re-secuenciación de todos los exones de codificación anotado y el exón /intrón se llevó a cabo de genes que muestra alta expresión en la mucosa colónica normal (
Cisd2, Ube2d3
,
Nfκb1
y
Slc39a8
). Debido a su asociación previa con la homeostasis del epitelio del colon, y la respuesta inflamatoria
In situ
, el
Nfκb1
gen de nuestras acciones Un ratón fue secuenciado en su totalidad (130 kb). Este análisis combinado no pudo identificar variantes de nucleótidos que afectan a secuencias de sitio de consenso de corte y empalme (Tabla S1), con la notable excepción de una variante de número de copias (CNV) que consta de un elemento de 54 pb situada 13 nucleótidos aguas abajo del sitio de empalme 3 'del exón 15 ( la Fig. 3B). Este elemento está presente como dos copias en el ADN genómico B6, pero una copia no se encuentra en la posición correspondiente en A. El elemento duplicado 54 pb que se encuentra en B6 es en sí mismo parte de un motivo de ADN repetitivo compuesto por 3 repeticiones de ADN-cerca-a idéntica que incluye el sitio de empalme 3 'de
Nfκb1
exón 15 en el genoma B6 (Fig. 3B). La supresión de uno de los dos elementos 54 pb en A altera la integridad del motivo 3-repeat encuentra en el ADN B6. La variabilidad en el número de las repeticiones de ADN-cerca-a idéntica sugirió un posible cambio en la conformación secundaria secuencia en este cruce del exón 15/15 intrón en el ADN genómico y /o precursores de ARN. De hecho, el análisis preliminar de la estructura secundaria de un fragmento de ADN de más de 350 pb que abarca el motivo 3-repeat muestra la presencia de un pseudoknot putativo en ratones B6 (Fig. 4A), que está ausente de la A DNA genómico (Fig. 4B). Además, el 54 bp-elemento, una copia de la cual está ausente en A, muestra de especies cruzadas similitud de secuencia entre los ratones, humanos y varias otras especies (Fig. 5A), lo que sugiere un posible papel conservado de este elemento y de la estructura secundaria asociada a través varias especies. Curiosamente, parece que hay conservación de secuencia significativa del intrón 15 a través de especies, mientras que la secuencia de nucleótidos y predijo
Nfκb1
exón 15 secuencia de aminoácidos muestra mala conservación de especies cruzadas (Fig. 5A, 5B). El papel específico por el cual esto sería CNV regular la función NFKB1 fue investigado pero, hasta ahora, ningún mecanismo claro ha sido identificada (ver Discusión).
La herramienta pknotsRG [77] se utilizó para generar estructuras secundarias para el 350 segmento de nucleótidos que abarca la estructura 3-repetición de B6 (A) y la supresión variante característico de A /J (B). bases no apareadas se indican en las bases azules, amarillas que identifican nucleótidos implicados en las estructuras pseudoknot. Este análisis identifica un pseudoknot con elaborados complementariedad intra-molecular que se interrumpe en la variante alelo A /J.
A. ClustalW alineación (EBI) de
Nfκb1
intrón 15 secuencias de diferentes especies (como se muestra en la parte izquierda de la alineación). La secuencia de ratón de referencia desde B6 se muestra en la parte superior, incluyendo el código de ácido carta amino solo para el segmento de polipéptido codificado por el exón 15. La secuencia genómica de A se muestra exactamente como en la figura. 3B, incluido el borrado 54 pb duplicación ( '---') y el motivo de ADN de 3 repeticiones que solapa el sitio de empalme 3 'del exón 15 (flechas). Ambas secuencias de ratón (B6 y A) se han alineado con las correspondientes rata, perro, caballo y secuencias genómicas humanas. Conservación de cada nucleótido del ratón se representa como sombreado cajas en la parte inferior con elevada (negro) a menor (blanco) la conservación nivel. B.
Nfκb1
secuencia de cDNA codificada por el exón 13 al exón 17 (se muestra como alterna subrayado y el formato normal para cada exón) de ratón y los genes humanos se han alineado. La porción menos conservada de la secuencia es que codificado por el exón 15, cuya secuencia es en caracteres en negrita. Se identifican nucleótidos conservados a través de la secuencia (*).
La activación de NFkB el Camino
También se investigó la activación de la vía NFkB en las cepas A y B6, utilizando un estándar de inducción LPS ensayo en los macrófagos primarios (BMDM). La inducción de NFKB en los macrófagos y en las células epiteliales intestinales es muy similar con respecto a las señales de inducción que son activos tanto en las células (LPS /TLR4; NOD1 /peptidoglicano; TNF /TNF-R) y la cinética de tiempo [38]. BMDM fueron expuestos a LPS, y en diferentes puntos de tiempo, se lisaron y se analizó mediante transferencia de western para la expresión de p50 y p105 Nfκb1 isoformas células, total y phospohorylated (p-) I? B?, Así como el total y fosforilados quinasa I? B, (p -) Iκkβ (Fig 6).. Estos experimentos mostraron niveles similares de expresión de p50 Nfκb1 y las proteínas p105 y Iκkβ total. Estos niveles fueron similares a lo largo de la duración del tratamiento. Sin embargo, la activación de la vía de NFkB por LPS era mucho más fuerte en B6 que en una macrófagos, tal como se determina por la aparición de activado p-Iκkβ y la disminución simultánea de I? B? A lo largo de la detección de p-I? B?, Destinada a la degradación. En los macrófagos B6, la activación de NFkB ocurrió más rápidamente y era más robusto que en A BMDM (cinética de aparición y la cantidad total de p-I? B? Y p-Iκkβ). En general, estos resultados identifican más débil para la activación de NFkB A las células en comparación con las células B6 en respuesta a la estimulación por LPS microbiano.
macrófagos derivados de la médula ósea se preparan a partir de A (
CCS3
S
) y
CCS3
R
) ratones (B6 y fueron estimuladas en presencia de lipopolisacárido (LPS). En los intervalos indicados de tiempo (minutos, que se muestran en la parte superior), se recogieron las células, se lisaron y se prepararon extractos de proteínas totales. Las muestras se resolvieron en 10% SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos contra NFkB (p50, p105), totales y phospohorylated (p-) I? B?, Así como quinasas total y fosforilados I? B, (p-) IKK /β y β- actina como control de carga. El peso molecular de las proteínas individuales se muestra a la derecha de cada panel montado, cada uno de los cuales es representativo de 3 experimentos independientes.
Expresión de p105 /Nfκb1 proteínas p50 en la mucosa normal y en tumores de la A /J
investigó la expresión del precursor Nfκb1 p105 por inmunohistoquímica, usando un anticuerpo (ver Materiales y Métodos) que reconoce tanto p105 y el producto p50 Nfκb1. En este análisis, se incluyeron en las mismas secciones ambos mucosa normal, lesiones displásicas y adenocarcinomas más avanzados ya sea intramucosos o protubing en la luz intestinal, todos obtenidos en la necropsia de A ratones 18 semanas después del tratamiento. Varias imágenes representativas se muestran en la Figura 7. En la mucosa normal, NFkB tinción de proteínas se ve en las criptas, predominantemente en los núcleos de las células epiteliales intestinales (IEC), y también se puede detectar en sub-población de células de la lámina propia. Esta tinción es en gran parte ausente en las zonas adyacentes de la hiperplasia de tejido /adenomas (Fig. 7f /h), así como en las secciones con otros tumores desarrollado (adenocarcinomas) visto en el lumen intestinal (Fig 7b /d). Estos resultados indican una pérdida de la expresión de la proteína Nfκb1 en lesiones cancerosas con displasia de bajo y alto grado observado en ratones A /J.
Representante tinción inmunohistoquímica (IHC) para la proteína p105 NFKB1 /p50 en los tumores y el epitelio del colon adyacente de los ratones que llevan homocigoto a /J-haplotipo en CCS3. 5 × magnificación (a, c, e, g) y el correspondiente 20 × magnificación (b, d, f, h) se muestran durante cinco tumores representativos.
Discusión
los últimos años, los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han señalado en un impresionante pluralidad de factores genéticos que contribuyen a la susceptibilidad CRC en los seres humanos [4], [5]. Además, se reconoce cada vez más que los factores ambientales, como la dieta, estilo de vida y la flora microbiana pueden contribuir aún más a modular la penetrancia o expresividad de la predisposición genética. La contribución de los genes individuales en la susceptibilidad CRC puede evaluarse en modelos de ratón pertinentes, cuando tanto los factores genéticos y ambientales pueden ser controlados [6]. Del mismo modo, el "avance genético" disección de la susceptibilidad diferencial de las cepas puras de la CRC puede identificar nuevos genes efectos, la relevancia de los cuales puede ser probado posteriormente para CRC humana [21].
En el estudio actual, tenemos reducido el tamaño de
CCS3
a ~2.15 Mb, un tamaño susceptible de clonación posicional [39]. Este intervalo contiene 12 anotado transcripciones, de las cuales 6 se expresan en el intestino (Fig. 3A). Uno de ellos codifica p105 Nfκb1, un fuerte candidato posicional y el componente central de la señalización de NFkB. Aunque muchas variantes polimórficas fueron identificados entre A y B6 de los genes en el intervalo, sin sentido o sin sentido sin variantes patológicas, obviamente, se identificaron en sus regiones codificantes. La tinción inmunohistoquímica (IHC) reveló una fuerte expresión Nfκb1 nuclear en el epitelio del colon normal, mientras que los tumores adyacentes en el mismo tejido expresan proteína NFKB1 nivel muy bajo (Fig. 7). Esto sugiere que la tumorigénesis de colon se asocia con la baja regulación de p105 Nfκb1 en nuestro modelo de ratón de CRC inducida por AOM. Además, hemos detectado una deleción cerca de
Nfκb1
exón 15 en A ratones. Los 54 bp mapas de deleción intrónicas dentro de una estructura de repetición de 3 unidades que se solapa con el sitio de empalme 3 'de
Nfκb1
exón 15. La correspondiente secuencia del intrón 15 muestra notable conservación de especies cruzadas, y el segmento afectado por la supresión se prevé para formar una estructura secundaria muy estable que se interrumpe en el genoma a. elementos de ADN presentes en intrones se sabe que influyen en el procesamiento del ARN como elementos de secuencia [40] o como estructuras secundarias que se pueden unir por proteínas de unión de ARN de doble cadena [41], [42]. Además, la estructura del ADN secundaria tal como bucles en horquilla ssDNA también puede afectar reconocimiento DNA-proteína [43], la expresión de genes y la recombinación del ADN [44]. Horquillas formados en repeticiones de ADN se han asociado con una serie de trastornos genéticos [45], [46], [47]. Es importante destacar que los estudios de expresión de proteínas en los macrófagos primarios tratados con LPS de A y ratones B6 demuestran activación diferencial de la vía de NFkB en estas células. Al supervisar la activación dependiente del tiempo y la acumulación máxima de activado p-Iκkβ y p-I? B? Destinada a la degradación se observó que una activación más robusto de la vía de NFkB se asocia con una disminución marcada en la susceptibilidad a la CRC. Por lo tanto, la convergencia de genética colocación de datos de mapeo
Nfκb1 Bienvenidos en el intervalo ~2.15 Mb de
CCS3
, el papel conocido de la vía NFkB en la homeostasis de la mucosa intestinal (ver más abajo), la detectado pérdida de NFkB expresión de la proteína p105 /p50 en los tumores en comparación con mucosa normal, la activación diferencial observado de esta vía en animales de diferentes
CCS3
haplotipos, y la presencia de una alteración genética distintiva en el gen, junto señalan en el
Nfκb1
como un fuerte candidato para el
CCS3
efecto.
Nfκb1 es un miembro de la familia de factores de transcripción NFkB que comparten un ADN amino-terminal de unión y dominio de homología Rel dimerización. Sin embargo, carece de un dominio de activación de la transcripción (TAD) y se basa en la heterodimerización con miembros de la familia que contiene NFkB TAD-(p65 /Rela RelB, c-Rel) para activar la transcripción [48]. Nfκb1 se sintetiza como un precursor de p105.