Extracto
Antecedentes
Las propiedades mecánicas de la matriz extracelular tienen un papel importante en el crecimiento y la diferenciación celular. Sin embargo, no está claro en cuanto a qué medida las células cancerosas responden a los cambios en las propiedades mecánicas (rigidez /rigidez) del microambiente y cómo esta respuesta varía entre las líneas celulares de cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
en este estudio se utilizó un sistema de placa de 96 pocillos desarrollada recientemente que las matrices de geles de poliacrilamida de la matriz conjugada extracelulares que aumentan la rigidez de por lo menos 50 veces a través de la placa. se utilizó Esta placa para determinar cómo los cambios en la rigidez de la matriz extracelular modular las propiedades biológicas de las células tumorales. Las líneas celulares ensayadas caen en una de dos categorías en función de su proliferación sobre sustratos de diferente rigidez: "rigidez dependiente" (las que muestran un aumento en el crecimiento celular como rigidez extracelular aumenta), y "rigidez independiente" (los que crecen igualmente en ambos sustratos blandos y rígidos). Las células que crecían mal en geles suaves también mostraron una disminución de la difusión y la migración en estas condiciones. Más importante aún, la siembra de las líneas de células en los pulmones de ratones desnudos revelaron que la capacidad de las células para crecer en geles suaves
in vitro
correlacionada con su capacidad para crecer en un entorno de tejido blando
in vivo
. La línea de carcinoma de pulmón A549 respondió a la cultura en geles suaves expresando el marcador epitelial diferenciado E-cadherina y la disminución de la expresión del factor de transcripción Slug mesenquimales.
Conclusiones /Importancia
Estas observaciones sugieren que las propiedades mecánicas de la matriz entorno desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación y las propiedades morfológicas de las células cancerosas. Además, el formato de múltiples pocillos del ensayo suave de la placa es un complemento útil y eficaz para modelos de cultivo celular en 3 dimensiones establecidas
Visto:. Tilghman RW, Cowan CR, Mih JD, Koryakina Y, Gioeli D, Slack -Davis JK, et al. (2010) Matriz de rigidez regula el crecimiento celular del cáncer y Celular fenotipo. PLoS ONE 5 (9): e12905. doi: 10.1371 /journal.pone.0012905
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 15 Julio, 2010; Aceptado: August 24, 2010; Publicado: 23 Septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Tilghman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH-NCI CA40042 (Institutos nacionales de Salud-Instituto Nacional del cáncer) (www.nih.gov) y la financiación de la Fundación Premio Coulter Translational Partners (www.whcf.org) (JTP), NIH HL092961 (DJT) y NIH CA124706 (DG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El control de las células epiteliales diferenciación y la proliferación (CE) es crítica para la homeostasis del tejido [1], [2]. proliferación CE está regulada por interacciones complejas con el microambiente circundante, incluyendo la exposición a factores de crecimiento, el contacto con las células adyacentes, y la adhesión a los componentes de la matriz extracelular (ECM) [3] - [6]. La alteración de las vías de señalización que regulan la respuesta a estas señales microambientales es un evento crítico en la iniciación del tumor, progresión y metástasis
.
Las propiedades mecánicas de la ECM se han identificado como un factor importante la regulación de la diferenciación y proliferación de una multitud de tipos de células, tanto
in vitro
y
in vivo
. Específicamente, la rigidez ( "rigidez") de la ECM, definida por su módulo de elasticidad (
E
) en unidades de fuerza por área (Pa), afecta al crecimiento, la diferenciación, y la funcionalidad de muchos tipos de células, incluyendo células madre, fibroblastos, células gliales, y cardiomiocitos [7] - [11]. Además, los estados de enfermedad son a menudo acompañada por un aumento local de la rigidez de ECM [12], [13]. la progresión del cáncer en los tejidos blandos se asocia típicamente con un aumento de rigidez debido a la acumulación local de una densa, matriz de colágeno reticulado que permite la detección del tumor por palpación física [14], [15]. En consecuencia, las células epiteliales mamarias nontumorigenic, que normalmente residen en el suave (
E
= 150 pascales [Pa] o N /m
2) microambiente de la mama, muestran aumento de la proliferación cuando se cultivan en matrices más rígidos (
e
= 4500 Pa), junto con el aumento de la migración, la señalización de ERK aumentada, y la pérdida de la polaridad celular [16]. Estos atributos se consideran características de las células tumorales y se caracterizan por ser un componente integral de una transición de un relativamente quiescente a un fenotipo "maligno", impulsado por un aumento local de ECM rigidez [16].
El grado y la variabilidad a la que las líneas celulares de cáncer humano son sensibles a las variaciones en la rigidez microambientales no está claro. Los fibroblastos transformados con oncogénico H-Ras ya no muestran la inhibición del crecimiento sobre sustratos blandos [11]. Además, las propiedades de crecimiento de poblaciones clonales de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 difieren en respuesta a la rigidez, y se correlacionan con la capacidad de crecer en el pulmón suave o hueso rígido
in vivo
[ ,,,0],17]. Esto sugiere que las propiedades de crecimiento de una línea celular de cáncer en particular en respuesta a sustrato rigidez pueden ser determinados por su composición genética o epigenética
.
Análisis de líneas celulares de cáncer humano es generalmente a cabo utilizando células cultivadas en plástico rígido, o en Matrigel o en agar blando, las propiedades mecánicas de los que están mal definidos y /o difícil de modular. En este estudio hemos adaptado un método para cultivar células en sustratos "blandos" biológicamente relevantes usando poliacrilamida ECM-conjugado (PA) geles que puede abarcar la gama de rigidez de 100 Pa-150000 Pa. Se utilizó un recientemente desarrollado de 96 pocillos sistema de ensayo que las matrices geles PA de rigidez variable en incrementos definidos por el usuario a través de la placa. Se utilizó este sistema para determinar cómo los cambios en la rigidez de la ECM modular las propiedades biológicas de las células tumorales, incluyendo el crecimiento, la morfología y propiedades migratorias. Las líneas celulares de la prueba se separaron en dos categorías en función de sus perfiles de proliferación: "rigidez" líneas dependientes generalmente exhiben un mayor crecimiento celular como la rigidez extracelular aumentado, mientras que "rigidez" líneas independientes crecieron igualmente bien en todo el espectro probado de la rigidez de la matriz. Es importante destacar que las células que crecían mal en geles suaves también mostraron una disminución de la difusión y la migración en estas condiciones. Se evaluó el crecimiento de las cuatro líneas celulares representativas seleccionadas a partir de estas dos categorías
in vivo
mediante la introducción de las células en el medio ambiente de los tejidos blandos del pulmón. Las dos líneas celulares de rigidez independiente (PC-3 y mPanc96) crecieron bien en el tejido blando (pulmón), mientras que las líneas celulares dependientes de rigidez (A549 y MDA-MB-231) no crecen bien en el pulmón. La línea de carcinoma de pulmón A549 respondió a la cultura en geles suaves expresando el marcador epitelial diferenciado E-cadherina y la disminución de la expresión del factor de transcripción Slug mesenquimales. Estas observaciones sugieren que las propiedades mecánicas del entorno de matriz desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación y las propiedades morfológicas de las células cancerosas, y que el "perfil de rigidez" es una propiedad intrínseca de cada línea celular de cáncer.
resultados
rigidez crecimiento dependiente de las líneas celulares de cáncer de
Para medir el crecimiento de líneas celulares de cáncer en función de la rigidez de la matriz se adaptó una novela de 96 pocillos sistema de ensayo ( "soft-plate96" ) que utiliza colágeno acoplado covalentemente a geles de poliacrilamida como sustratos en lugar de plástico rígido ECM-revestido. Los soft-placas se componen de cinco tramos, cada uno con dos columnas de geles de PA recubiertas con colágeno de un módulo de elasticidad específico (Fig. 1), 150 Pa y 1.200 Pa (comparable a pulmón y de mama), 2400 Pa y 4800 Pa ( comparable a un tumor mamario), y 9.600 Pa (de aproximación músculo estriado). Estos módulos elásticos se eligieron sobre la base de mediciones publicadas de la rigidez de los tejidos y tumores blandos [7], [10], [16], [18], y en los datos preliminares que muestran que los mayores cambios en la proliferación de células rigidez dependiente ocurrieron entre 150 Pa y 4800 Pa (datos no mostrados).
un ensayo de crecimiento de 5 días típica utilizando un soft-plate96 produce un "perfil de crecimiento", que refleja el efecto de la rigidez en la proliferación de la línea celular.
Se determinó el perfil de crecimiento de catorce líneas celulares de cáncer mediante siembra de las células en el soft-plate96 y la medición de las veces el cambio en el número de células después de cinco días mediante una unión a ADN tinte fluorescente (Fig. 2) . Además, se determinaron los perfiles de crecimiento de células epiteliales mamarias nontumorigenic (MCF-10A) y dos líneas de fibroblastos. El crecimiento celular en matrices definidas genera un "perfil de crecimiento" cualitativo para cada línea celular (Fig. 1, 2). Los perfiles de crecimiento de las líneas celulares cayó en una de dos categorías: las células "rigidez dependiente", al menos un cambio de 2 veces en el número de células en toda la gama de rigidez extracelular probado (por ejemplo, células de cáncer de mama MDA-MB-231 y las células de cáncer de pulmón A549), y células "rigidez" independientes que crecieron igualmente bien en toda la gama de la rigidez probado matriz (por ejemplo, PC-3 células de cáncer de próstata y cáncer de páncreas células mPanc96) (Fig. 2). No hubo correlación entre la forma del perfil de crecimiento dependiente de la rigidez y el tejido de origen, o si las células fueron originalmente cultivadas a partir del tumor primario o de una lesión metastásica.
La tabla es una recopilación de 5 ensayos de crecimiento para diez días de 17 líneas celulares. Se incluye en la tabla son fuente original de las células (indicados por las citas bibliográficas), la capacidad de crecer en 150 Pa y 9600 Pa (sustratos de ensayos SoftPlate96), y el perfil de crecimiento suave plate96 para cada línea celular. perfiles grises indican las líneas de rigidez dependiente y perfiles negros indican las líneas de rigidez-independiente. El crecimiento se mide como sigue: - & lt; 1 veces; + 1-5 veces; ++ 5-10 veces; +++ 10-15 veces; ++++ 15-20 veces; +++++ & Gt;. 20 veces mayor en número de células durante 5 días
Además, caracteriza dos líneas celulares que mostraron un crecimiento dependiente de la rigidez (MDA-MB-231 y A549) y dos células líneas que mostraron un crecimiento independiente de la rigidez (mPanc96 y PC-3). Cada línea celular demostró el crecimiento celular robusto de plástico recubierta con colágeno rígido (Fig. 3A). Las células de rigidez dependiente demostraron un aumento pliegue 4-5 en número en los geles más rígidos (4.800 a 9.600 Pa) con relación al (150-1200 Pa) geles suaves (Fig. 3B, paneles superiores). Por el contrario, las dos líneas celulares de rigidez independiente demostraron números casi equivalentes en los geles blandos y rígidos (Fig. 3B, paneles inferiores). Para determinar si el crecimiento diferencial en sustratos blandos o rígidos representaba la selección de una población de células que muestran un crecimiento preferencial en los diferentes sustratos, las células A549 o MDA-MB-231 se cultivaron en plástico o 150 Pa sustratos para 15 días. Estas células se recogieron a continuación y se sometieron a un ensayo de crecimiento de 5 días en un soft-plate96. No se observó ningún cambio en el perfil de crecimiento suave de la placa después del cultivo prolongado en sustratos blandos (Fig. S1). Estos datos establecen claramente las diferencias específicas de líneas celulares en la capacidad de crecer en la suavidad frente a sustratos rígidos y sugieren que el "perfil rigidez" es una propiedad intrínseca de cada línea celular.
A.) Ensayo de crecimiento de 5 días de cuatro líneas celulares de cáncer de plástico. B.) ensayos de crecimiento de 5 días de las cuatro líneas celulares de cáncer en un soft-plate96. Los datos se expresan como el cambio veces más el número de células inicialmente plateados. Los resultados muestran la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 frente al crecimiento en 9600 Pa, medido por ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey
Propiedades de las líneas de rigidez-dependientes y de células -independiente sobre diferentes sustratos
se evaluó si la disminución del crecimiento de las células dependientes de rigidez en geles blandos se debió a defectos de adherencia al sustrato, un bloque en el ciclo celular, o la inducción de la apoptosis. Las células A549 y MDA-MB-231 se sembraron en el soft-plate96, se dejaron adherir durante seis horas, y el número de células unidas midieron. Ambas líneas celulares conectados de manera eficiente para las de colágeno-geles, independientemente de los módulos elásticos (Fig. 4A), indicando que el número de células más bajas en los geles después de cinco días no se debe a una falta de unión de las células.
a.) Las células A549 y MDA-MB-231 se sembraron en un soft-plate96 y número total de células por pocillo se contaron después de 6 horas de fijación. Los datos se expresan como porcentaje de adhesión a los 150 Pa geles. B.) A549 y las células PC-3 se cultivaron en 150 Pa o 4800 sustratos de gel Pa durante 5 días, seguido de análisis del ciclo celular. Los resultados muestran la media de al menos tres experimentos ± SEM. * P & lt;.
0,05
A falta de adherencia de señalización en células dependientes de anclaje resultados en un bloque en el G1 /S de control del ciclo celular [19]. las células A549 cultivadas en un gel de 150 Pa durante cinco días mostraron una acumulación moderada pero significativa en la fase G1 del ciclo celular con la correspondiente disminución en el porcentaje de células en la fase S (Fig. 4B), consistentes con un bloque en la G1 /S de control. En contraste, MDA-MB-231 células mostraron ningún cambio significativo en su perfil del ciclo celular, similar a la rigidez independiente de líneas de células PC-3 y mPanc96 (Fig. 4B). Sin embargo, tanto de las líneas celulares de rigidez dependiente (A549 y MDA-MB-231) exhibieron apoptosis significativa cuando se cultivan en geles suaves durante cinco días, mientras que los PC-3 y líneas celulares mPanc96 rigidez independiente no lo hicieron (Fig. 5A- SEGUNDO). Ninguna de las cuatro líneas celulares exhibió apoptosis significativa cuando se cultiva en las (4800 Pa) geles más rígidos. Estos datos indican que el "perfil de rigidez" de las células no refleja las diferencias en la adhesión a la matriz, pero más probablemente refleja los cambios de rigidez dependiente de la progresión del ciclo celular y la apoptosis celular.
A.) Micrografías representativas de A549 y MDA-MB-231 células sembradas durante 5 días en 150 Pa o 4800 Pa sustratos de gel. Todos los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul) y las células TUNEL positivas son etiquetados con fluoresceína (verde). Bar = 100 micras. B.) La cuantificación de la tinción de TUNEL. Promedio de 2 experimentos ± SEM, con un total de al menos 400 células contadas para cada condición.
La capacidad de las líneas celulares de cáncer de formar colonias en el tejido blando se correlaciona con su soft-plate96 perfiles
se evaluó si la capacidad diferencial para crecer en sustratos blandos exhibidas por las líneas celulares dependientes de la rigidez y -independiente fue predictiva de la capacidad de estas células para crecer en un entorno de tejido blando
in vivo
. Dos líneas de rigidez dependiente (MDA-MB-231 y A549) y dos líneas de rigidez independiente (PC-3 y mPanc96) fueron transducidas de forma estable con un lentivirus que codifica GFP, y se inyectaron en la vena de la cola de ratones desnudos. Cualquiera de 2-24 horas o 14 días después de la inyección de la población de células GFP-positivas en los homogeneizados de pulmón se determinó mediante citometría de flujo y la histoquímica. Cada una de las líneas celulares exhibieron número significativo de células en la inyección pulmones post (Figura 6A, panel derecho;. Datos no mostrados). Sin embargo, después de dos semanas los pulmones de los ratones inyectados con las dos líneas celulares de rigidez dependiente (MDA-MB-231 y A549) contenían un menor número de células GFP-positivas, en comparación con los pulmones de los ratones inyectados con las líneas celulares de rigidez independiente (PC- 3 y mPanc96) (Fig. 6A, panel izquierdo). Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción de secciones embebidas en parafina de los pulmones dos semanas después de la inyección de las células mPanc96 mostró microcolonias dentro de los alvéolos, mientras que los pulmones de los ratones que fueron inyectados con las células A549 y MDA-MB-231 containied no microcolonias detectables (Fig. 6B, los datos no mostrados). Así, el crecimiento de las líneas de rigidez-independiente en el pulmón se correlacionan con su eficiencia de crecimiento en los geles de 1200 Pa del ensayo SoftPlate96 (Fig. 6C), una rigidez similar a la del tejido pulmonar (DJT, observación no publicada). La correlación entre las tasas de crecimiento de células relativas en sustratos blandos, pero no platos rígidos, con el crecimiento de las mismas líneas celulares en el pulmón sugiere que la capacidad de las células para crecer en geles suaves
in vitro
puede ser un predictor de su capacidad de crecer en los tejidos blandos
in vivo
.
a.) MDA-MB-231, A549, PC-3, o células mPanc96 GFP-etiquetados fueron sembradas en los pulmones de ratones desnudos. (Izquierda) Se determinó el número de células positivas para GFP en el pulmón 4 horas y 14 días después de la inyección, y el cambio en el número de células positivas para GFP en el pulmón durante los 14 días fue anotado. * P & lt; 0,05 frente a MDA-MB-231 células, medida por ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey. (Derecha) A549 GFP-etiquetados y células mPanc96 se sembraron en los pulmones y el porcentaje de células positivas para GFP se anotó a intervalos de más de 24 horas. B.) Histología del pulmón de ratón a los 14 días después de la inyección de las células A549 (panel izquierdo) y células mPanc96 (panel derecho). Las flechas indican las micrometástasis. C) Comparación del crecimiento de líneas de células sobre plástico (tomada de la Fig. 3A) y en 1200 sustratos Pa (tomada de la Fig. 3B).
aumento de la proliferación y migración de células de rigidez dependiente las células se correlaciona con la propagación de células
Se evaluó a continuación si la proliferación de líneas celulares de rigidez dependiente de la correlación con la capacidad de las células para difundir en diferentes sustratos de gel. Tanto las células A549 MDA-MB-231 y exhibieron aumentos significativos en la propagación de células en geles de 4800 Pa en comparación con 150 geles Pa (Fig. 7A-B). Se obtuvieron resultados similares cuando BxPC-3 células, una línea de páncreas que exhibe un perfil de crecimiento comparable a las células A549 MDA-MB-231 y (Fig. 2), se cultivaron en 150 Pa y 4800 Pa geles (datos no mostrados). Curiosamente, las células PC-3 (rigidez independiente) fueron capaces de propagarse en 150 geles Pa en una medida similar a la de los 4800 geles Pa, mientras que las células mPanc96 (rigidez independiente) no se extendió de forma apreciable en cualquiera de sustratos blandos o rígidos (Fig . 7A-B). La capacidad de difundir en sustratos más rígidas también se correlacionó con la capacidad de las células A549 y MDA-MB-231 de migrar. Por el contrario, tanto las células mPanc96 PC-3 y no se presentaron diferencias significativas en la migración cuando se siembran en la suavidad frente a sustratos más rígidas (Fig. 7C). Estos resultados demuestran que para las líneas celulares de rigidez dependiente de la capacidad de las células para difundir correlaciona con aumento de la proliferación y la migración. Para las células de rigidez independiente de estos comportamientos parecen ser desacoplado.
Micrografías de A549
A.), MDA-MB-231, PC-3, y las células mPanc96 que se sembraron en 150 o 4800 sustratos de gel Pa durante 20 horas. B.) Áreas de células que se cultivaron durante 20 horas en 150 o 4800 Pa sustratos de gel. Los resultados muestran aumento medio veces sobre una célula unspread ± SEM de al menos 20 células contadas para cada condición. C. A549), MDA-MB-231, PC-3, y las células se sembraron mPanc96 durante 2 horas, después se filmó durante 18 horas. Velocidad media ± SEM de células en micras /h se determinó mediante el trazado y la medición de los caminos de 15 células por la rigidez por línea celular. * P & lt;. 0.05
Quinasa de adhesión focal (FAK) es un componente de señalización crítico de la señalización de la integrina y se ha implicado en la detección de la rigidez de la ECM [20], [21]. actividad FAK, medida por su autofosforilación en tyrosine397, se activó sólo modestamente como una función de la rigidez de la matriz en las células A549, y no se alteró significativamente en las otras líneas celulares ensayadas (Fig. S2). Estos datos hacen hincapié en que el comportamiento de las diferentes líneas celulares de cáncer en sustratos blandos o rígidos no pueden atribuirse simplemente a alteraciones en la adhesión general de señalización a través de la activación de FAK.
Las propiedades mecánicas del microambiente regulan las propiedades epiteliales y mesenquimales de las células A549
la conversión de las células epiteliales normales a su contra parte maligna metastásicos a menudo implica la pérdida de expresión de e-cadherina y la adquisición de un fenotipo más migratoria - un proceso denominado epitelio-mesenquimal transición (EMT). Las células A549 cultivadas en (150 Pa) geles suaves durante 5 días racimos formados sin adherencias focales visibles o fibras de estrés (Fig. 8A). En contraste, las células se extendieron sobre más rígido (4800 Pa y 19.200 Pa) y geles más prominentes se dispersan exhibiendo fibras de estrés y adhesiones focales (Fig. 8A), todas las señas de identidad del fenotipo mesenquimal. La tinción de inmunofluorescencia o análisis de transferencia Western de las células cultivadas en los geles de 150 Pa o 4800 o 19200 Pa geles demostraron significativa regulación de la expresión de E-cadherina en sustratos blandos (Fig. 8B-C). Sin embargo, no se observó ningún cambio significativo en la expresión de la vimentina marcador mesenquimal en las células que crecen en los diferentes sustratos (Fig. 8C).
A). Las células A549 se cultivaron durante 3 días en geles con rigideces de 150 , 4800 o 19200 Pa. Las células fueron fijadas y teñidas para la actina (verde) y paxillin (rojo). Las flechas indican las adhesiones focales. B.) Las células A549 se cultivaron en geles con rigideces de 150 o 19200 Pa. Las células fueron fijadas y teñidas para la actina (verde) y E-cadherina (rojo). Las células C) A549 cultivadas en geles de PA durante 3 días se lisaron y se transfirieron para la expresión de E-cadherina, vimentina y actina. D.) Los niveles relativos de ARNm de Slug y E-cadherina en células A549 cultivadas en geles de PA durante 3 días como se mide por tiempo real RT-PCR. Los resultados muestran la media ± SEM de tres experimentos independientes.
El represor de la transcripción Slug es un miembro de la familia Snail de elementos de unión al ADN que regula la expresión de E-cadherina [22] y se ha demostrado que es crítico para conferir un fenotipo metastásico en un modelo experimental de melanoma [23]. Quantitative análisis RT-PCR de las células A549 cultivadas en substratos de diferentes rigideces reveló una regulación por incremento de ARNm de SLUG cuando las células fueron cultivadas en geles más rígidos (4800 y 19200 Pa) en comparación con el gel suave (150 Pa) (Fig. 8D). los niveles de ARNm de SLUG inversamente correlacionados con los niveles de E-cadherina de ARNm, que eran más bajos en las células A549 cultivadas en los geles más rígidos en comparación con las células cultivadas en el gel suave, en consonancia con los cambios observados en la expresión de la proteína E-cadherina (Fig. 8B-C) . Estos datos indican que la rigidez de la matriz puede modular E-cadherina y la expresión de Slug en las células A549. células Curiosamente, MDA-MB-231, mientras que exhiben proliferación rigidez dependiente, no expresaron niveles detectables de E-cadherina en cualquiera de 150 Pa o 19.200 Pa (datos no presentados), lo que sugiere que estas células, mientras que morfológicamente similares a las células A549 en sustratos blandos y rígidos, no alteran la expresión de este marcador epitelial cuando se expone a un microambiente suave.
Discusión
los estudios señalados anteriormente ponen de relieve la importancia de las propiedades mecánicas de la ECM en la regulación proliferación de células cancerosas y la supervivencia. Además, se describe un sistema de ensayo eficaz y flexible para determinar cómo los cambios en las propiedades de células influencia de la matriz de rigidez. El análisis de 14 líneas celulares de cáncer puso de manifiesto que la alteración de la rigidez de la matriz de colágeno recubiertas de manera prominente altera el crecimiento de ciertas líneas celulares de cáncer (crecimiento "rigidez dependiente") mientras que tiene poco efecto sobre otras líneas celulares de cáncer (crecimiento "rigidez independiente" ) que creció de forma robusta incluso en sustratos de muy baja rigidez. Las menores tasas de crecimiento en los geles blandos en las líneas celulares de rigidez dependiente fueron causadas al menos en parte por la alteración selectiva en la progresión del ciclo celular y la inducción de apoptosis cuando las líneas de células se sembraron en matrices suaves. Además, las líneas de rigidez dependiente mostraron una marcada disminución en la propagación de células y la migración cuando se siembran en la suavidad frente a sustratos rígidos, y al menos una de las líneas celulares (A549) mostraron una regulación rigidez dependiente de la expresión de E-cadherina y la modulación reversible de epitelial y mesenquimal fenotipo. Por último, cuando se sembraron en los pulmones del ratón, líneas celulares de rigidez dependiente no crecieron, así como líneas de rigidez independiente, lo que indica una correlación entre la capacidad de crecer en matrices de función
in vitro
y la capacidad proliferativa
In vivo
en el pulmón.
el ensayo de pocillos múltiples soft-plate96 representa un enfoque relativamente de alto rendimiento para evaluar la función de la rigidez del sustrato sobre las propiedades de las células cancerosas en cultivo. En este sistema el método de Pelham y Wang [24] ha sido adaptado para generar una placa de múltiples pocillos en la que el sustrato se compone de geles de poliacrilamida de rigidez variable que han sido funcionalizados para proporcionar una superficie de unión para las proteínas de la matriz extracelular, por ejemplo, colágeno. En los estudios descritos anteriormente, las placas se diseñan para abarcar cinco niveles de módulos de elasticidad, que van desde 150 hasta 9600 Pa, sin embargo otros formatos se crean fácilmente. El punto final del ensayo en nuestros estudios fue la proliferación celular, pero otros criterios de valoración, por ejemplo, la supervivencia celular se configura fácilmente. Como se ilustra, el sistema de ensayo proporciona un método rápido y reproducible para evaluar la función de la rigidez de la matriz sobre el crecimiento celular y la supervivencia.
Utilizando este ensayo que hemos estudiado un panel de líneas celulares de cáncer con el objetivo de determinar cómo cambia en las propiedades mecánicas de la proliferación de las células influencia matriz. Nueve de las líneas celulares de cáncer mostraron una dependencia de la rigidez de la matriz para el crecimiento, creciendo significativamente mejor en matrices rígidas /rígidas que en las matrices menos rígidas /blandos. líneas celulares de rigidez-independientes puso de manifiesto prácticamente sin cambios en la tasa de crecimiento por encima del rango de la rigidez de la matriz utilizada en los platos. Sorprendentemente, todas las líneas celulares de cáncer examinadas en este estudio eran capaces de proliferar en sustratos blandos, mientras que los fibroblastos normales, músculo liso y células epiteliales exhiben una dependencia estricta en la rigidez de la matriz para el crecimiento [25]. Se supone que esto refleja la transformación "oncogénico" de las líneas celulares de cáncer en relación con las células normales, eventos que reflejan las múltiples mutaciones que caracterizan a las células cancerosas. No está claro en este momento si el perfil de rigidez de una líneas celulares de cáncer refleja una o más mutaciones específicas que son adquiridos por una línea de células individuales.
Es interesante que las líneas celulares que demostraron un crecimiento rigidez dependiente también mostró rigidez dependiente de la difusión y la migración. Nuestros resultados paralelos el análisis de una serie de líneas celulares de glioma propagadas en sustratos poliméricos recubiertos de fibronectina de rigidez mecánica definida [26]. Sobre soportes altamente rígidos (& gt; 100 kPa) las células de glioma propagan ampliamente, forman las fibras de estrés prominentes y maduran las adhesiones focales, y migraron rápidamente. Sin embargo, cuando se cultivan sobre matrices menos rígidas (valores comparables con tejido cerebral normal), las células de glioma aparecían redondeados y no podían migrar de forma productiva, similar a las líneas celulares de rigidez dependiente descritos en nuestros estudios. Curiosamente, la motilidad celular de glioma en sustratos altamente compatibles fue rescatado por la inhibición farmacológica de la contractilidad basada en actinomyosin, lo que sugiere que la contractilidad actinomyosin puede ser un componente crítico del aparato mecanosensorial. Otros estudios han implicado FAK, ERK, y la pequeña GTPasa Rho en la regulación del crecimiento en respuesta a la rigidez [16], o un aumento en los niveles de ciclina D aguas abajo de la activación de Rac [25]. Rho GTPasas y sus objetivos de abajo, que son mediadores críticos de la propagación de células, la migración y la contractilidad [27], pueden actuar como maquinaria mecanosensorial que responden a la rigidez del microambiente. Por ejemplo, Rho y su efector Rho-quinasa (ROCK) están involucrados en un bucle de retroalimentación que regula tubulogénesis en las células epiteliales normales cuando son cultivadas en matrices de colágeno en 3 dimensiones blandos [28]. Cuando las células se cultivan en más rígidas matrices, de alta densidad, este bucle de retroalimentación induce la fosforilación de FAK y ERK, lo que resulta en el aumento de la expresión de genes asociados con la proliferación, presumiblemente por FAK dependiente de la activación de Ras [20]. Si bien estos experimentos implican claramente la vía Rho en mechanotransduction en las células epiteliales normales, se requieren más experimentos para determinar los efectos de la contractilidad y la actividad GTPasa Rho en el crecimiento de células de cáncer en sustratos blandos, particularmente en líneas celulares de cáncer que albergan mutaciones en la vía Ras.
Como se demuestra en este documento, la rigidez extracelular afecta el crecimiento de ciertas líneas celulares de cáncer, y la capacidad de una línea de células de crecer en un sustrato blando
in vitro
puede predecir su capacidad de crecer en un ambiente suave
in vivo
. Además, la respuesta de una línea celular a la rigidez extracelular
in vitro
puede predecir su reacción a la respuesta desmoplásico
in vivo
, es decir, si un aumento de la rigidez del microambiente
in vivo
favorecerá el crecimiento de las células tumorales. perfil de crecimiento suave de la placa de una línea celular también puede predecir su sensibilidad a los fármacos terapéuticos en los tejidos blandos. Por ejemplo, el ADN-reticulante mitomicina C se ha demostrado que inhibe la proliferación de las células madre mesenquimales de manera más eficiente en rígida frente a sustratos blandos [29]. Además, las líneas celulares de cáncer pancreático que expresan marcadores epiteliales, tales como E-cadherina y niveles más bajos de la vimentina marcador mesenquimal son más sensibles al tratamiento erlotinib [30], [31]. Por lo tanto, si una línea celular (por ejemplo, A549) se convirtiera en más epitelial-como cuando se cultivan en un ambiente suave, sería predecirse a ser más sensibles a erlotinib. estudiar más a fondo tanto
e in vitro
in vivo
serán necesarios para explorar la capacidad predictiva del ensayo de placa blanda en la determinación de las respuestas celulares de cáncer de
in vivo
tejidos blandos ambientes y potencia terapéutica en este tipo de entornos.
plasticidad celular, o la capacidad de transición de ida y vuelta entre una célula epitelial sésiles y una célula mesenquimal migratoria, es un fenómeno bien estudiado que es fundamental para varios procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, y la progresión del cáncer. Una característica común a EMT es una regulación a la baja de la adhesión célula-célula, principalmente a través de la inhibición de la expresión de E-cadherina, y la adquisición de un fenotipo móviles junto con el aumento de la expresión de ciertos componentes de la infraestructura, tales como la vimentina. Sin embargo, esta transición no siempre puede ser completa, ya que hay muchos ejemplos de células que se someten a una EMT "parcial" en el que las células se vuelven móviles mediante la adquisición de transitoriamente algunas pero no todas de las características de las células mesenquimales [32]. Esto sugiere que las células se someten EMT de una manera compleja y en etapas, y no todos los eventos de EMT son necesarios para lograr un fenotipo migratorio.