Extracto
inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) contra EGFR y c-Met están inicialmente eficaz cuando se administra de forma individual o en combinación para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Sin embargo, las eficacias globales de TKIs son limitadas debido al desarrollo de resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, es importante para dilucidar los mecanismos de EGFR y la resistencia a c-Met TKI con el fin de desarrollar terapias más eficaces. líneas celulares de NSCLC modelo H1975 y H2170 se utilizaron para estudiar las similitudes y diferencias en los mecanismos de resistencia a EGFR /c-Met TKI. células H1975 son positivos para la mutación T790M EGFR, que confiere resistencia a las terapias EGFR TKI actuales, mientras que H2170 células son EGFR de tipo salvaje. Anteriormente, se hicieron resistentes a la erlotinib EGFR TKI y la SU11274 c-Met TKI por la exposición H2170 células a concentraciones progresivamente crecientes de TKIs. En H2170 y las células resistentes TKI-H1975, se han encontrado para ser modulados diferencial de las proteínas Wnt clave y mTOR. transductor de señalización Wnt, activa β-catenina se reguló en las células H2170 con ITC-resistentes en comparación con las células parentales. GATA-6, un activador transcripcional de Wnt, también se encontró que se upregulated en las células H2170 resistentes. En las células resistentes H2170 erlotinib, la regulación positiva de inactiva GSK3 se observó (p-GSK3), que indica la activación de Wnt y mTOR vías que se inhiben de otra manera por su forma activa. Sin embargo, en las células H1975, moduladores Wnt como activa β-catenina, se downregulated GATA-6 y P-GSK3. Resultados adicionales de ensayos de viabilidad celular de MTT demostraron que la proliferación de células H1975 no se redujo significativamente después de la inhibición por Wnt XAV939, pero el tratamiento combinación con everolimus (inhibidor de mTOR) y erlotinib como resultado la inhibición del crecimiento celular sinérgica. Así, en H2170 H1975 células y células, la inhibición simultánea de proteínas clave Wnt o la vía de mTOR Además de EGFR y c-Met puede ser una estrategia prometedora para la superación de EGFR y la resistencia a c-Met TKI en pacientes con CPNM
.
cita: Botting GM, Rastogi I, G Chhabra, Nlend M, N Puri (2015) Mecanismo de resistencia y nuevas dianas que media la resistencia a EGFR y c Met-tirosina inhibidores de la quinasa en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (8): e0136155. doi: 10.1371 /journal.pone.0136155
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos |
Recibido: 19 de septiembre de 2014; Aceptado: 31 de julio de 2015; Publicado: 24 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Botting et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de la Salud con el número premio R21CA158965-01A1 (http: //www.nih .gov) para Neelu Puri. Este trabajo también fue financiado en parte por una subvención de la Comunidad de la Fundación Comunitaria de Norther Illinois para Neelu Puri. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: Dr. Marie Nlend es empleado por Thermo Fisher Scientific . No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
EGFR y c-Met están receptor tirosina quinasas (RTK) que son altamente expresado en el CPNM y facilitar la señalización a través de vías tumorigénico compartidos cuando están alteradas [1,2]. Varios inhibidor de la tirosina quinasa (TKI) terapias contra EGFR y c-Met se administran en la actualidad y son inicialmente eficaces en pacientes con CPNM que tienen ciertas mutaciones de EGFR-somáticos tales como la activación de L858R [3-5]. Sin embargo, el desarrollo de resistencia TKI es común y da como resultado la recurrencia de tumores [6,7]. Mayor que 50% de toda la resistencia secundaria adquirida a EGFR TKIs se atribuye al desarrollo de la T790M secundaria 'gatekeeper mutación' [8-12]. Esta mutación también puede causar resistencia a EGFR TKI primaria si está presente antes del tratamiento [10]. Otro 20% de la resistencia adquirida a EGFR TKIs se atribuye a la amplificación del receptor c-Met [2,13,14].
MET
amplificación de genes y la presencia de T790M no son mutuamente excluyentes, ya que los estudios han demostrado que muchos pacientes con CPNM son positivos para ambas alteraciones [2,15].
Estudios previos realizados por nuestro grupo y otros han demostrado que EGFR y c-Met tienen sustancial diafonía que contribuye al aumento de la activación de sus vías aguas abajo compartidos [16]. También se han presentado pruebas de que existe un efecto sinérgico entre EGF y HGF en tumorigenicidad [1], y que el EGFR y c-Met ITC puede inhibir la proliferación de células NSCLC sinérgicamente [17].
La investigación ha sugerido que la desregulación de la vía de Wnt puede ser un factor importante que contribuye a una mayor mantenimiento y la señalización de la proliferación en varios tipos de cáncer [18,19]. Otros estudios sugieren que la interferencia entre EGFR y Wnt puede mejorar la tumorigénesis del cáncer de pulmón [17,18,20]. XAV939, un inhibidor de tankirasa es una pequeña molécula prometedora Wnt inhibidor actualmente en estudios preclínicos. XAV939 activa Axin1, promoviendo la degradación de β-catenina [21], y por lo tanto la inhibición de la señalización de Wnt canónica. Por otra parte, el objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR), una serina /treonina quinasa que es un jugador clave en la vía PI3K /Akt, que actúa tanto hacia arriba como aguas abajo de Akt [22-25] También se ha relacionado con una variedad de tipos de cáncer cuando están alteradas . Por lo tanto, la mTOR también se ha convertido en una diana terapéutica potencial en terapias contra el cáncer [26]. La rapamicina y sus derivados, everolimus, son dos inhibidores de mTOR prometedores actualmente en ensayos clínicos para el cáncer de pulmón [27-30]. Canonical vías de Wnt y de mTOR puede ser regulada negativamente por la serina /treonina quinasa GSK3 [31-33]. En los seres humanos, GSK3 tiene dos isoformas, GSK3α y GSK3 [34], con este último se conoce que funcionar como parte del complejo de destrucción β-catenina [33,35,36]. Esta investigación compara estas vías de señalización alternativas, específicamente proteínas clave de las vías de Wnt y mTOR, en líneas celulares NSCLC modelo positivo o negativo para la mutación de EGFR T790M-activación.
Estudios recientes en nuestro laboratorio con células H2170 con ITC-resistentes han demostrado una regulación por incremento de p-ERK, una proteína que se sabe que activa GATA-6 [17]. GATA-6 es un factor de transcripción cree que es esencial para el desarrollo de las células epiteliales del pulmón y otros procesos embriogénicos [37,38], mediante la regulación de la vía de Wnt [37]. GATA-6 también se conoce para facilitar la activación Wnt mediante la promoción de la transcripción de ligandos Wnt importantes [37,39-43]. La estimulación de la vía Wnt canónica finalmente resulta en la activación de β-catenina (desfosforilado en Ser37 y Thr41), que promueve la transcripción de las proteínas implicadas en la proliferación celular [44,45].
Este estudio demuestra que la combinación de Los inhibidores de mTOR Wnt o con EGFR actual y c-Met ITC pueden inhibir con éxito la proliferación celular y la supervivencia de las células de tipo salvaje EGFR NSCLC. Sin embargo, en el caso de células T790M-positivo, puede ser posible romper la resistencia, a través de la combinación de inhibidores de mTOR con EGFR y c-Met TKIs. Este estudio sugiere que el mecanismo de resistencia a EGFR /c-Met TKI de es diferente en mutado (T790M) y células de tipo salvaje EGFR NSCLC. Esto indica que el tratamiento combinatorio selectiva se debe utilizar para las células con EGFR tipo salvaje y EGFR mutado T790M, para mejorar el pronóstico de los pacientes de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
Erlotinib [
N CD - (3-etinilfenil) -6,7-bis (2-metoxietoxi) quinazolin-4-amina]. (Cat. Nº e-4007) y everolimus (Cat No. e -4040) fueron adquiridos de LC Laboratories (Woburn, MA), SU11274 [[(3Z) -N- (3-clorofenil) -3 - ({3,5-dimetil-4 - [(4-metil-piperazin-1-il ) carbonil] 1H-pirrol-2-il} metileno) -N-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida]] (Cat. No. S-9820) y XAV939 [3 , 5,7,8-tetrahidro-2- [4- (trifluorometil) fenil] 4H-tiopirano [4,3-d] pirimidin-4-ona] (Cat. No. 53113) se adquirieron de Sigma-Aldrich ( St. Louis, MO). Todos los inhibidores se suspenden en DMSO y se almacenaron como alícuotas a -20 ° C. EGF (Cat. No. AF-100-15) y HGF (Cat. No. 100-39) se adquirieron de PeproTech (Rocky Hill, NJ) y se suspendieron en PBS y se almacena como alícuotas a -20 ° C.
phosphospecific anticuerpos de conejo monoclonales para p-mTOR (Ser 2448, Clon D9C2), p-4E-BP1 (Thr37 /46, clon 2855), p-GSK3 (Ser 9), total GSK3, Axin1 (C76H11) y p-LRP6 (C5C7), anticuerpos policlonales de conejo para phosphospecific p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) y p-p70SK (T389), de conejo y ratón IgG anticuerpos secundarios se obtuvieron de Cell Signaling Technology. policlonal de conejo no fosforilado GATA-6 (sc-9055) se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Un anticuerpo monoclonal de ratón para β-catenina activa (05 a 665) se obtuvo de Millipore (Billerica, MA). Un anticuerpo monoclonal de ratón para β-actina se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Todos los anticuerpos fueron utilizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares
H2170 y H1975 con CPNM fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EE.UU., CRL-5928, CRL-5807 y CRL-5908, respectivamente). Las células H2170 tienen EGFR de tipo salvaje, mientras que H1975 células son positivas para dos mutaciones en el dominio quinasa del EGFR: L858R y T790M (documentado por ATCC). Todas las líneas celulares se almacenaron en incubadoras a 37 ° C con 7% de CO
2 y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones de la ATCC (atcc.org) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) medios de comunicación (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Cat No: SH3002701) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals,, Lawrenceville, GA, Cat No: S11050), 1% (v /v) Antibiótico-antimicótico Solution (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 15070-063), 1% (v /v) de piruvato sódico (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 11360) y 1% (v /v) Hepes (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 11360).
efecto del EGF /HGF y TKIs sobre la fosforilación de EGFR, c-Met y Otros vías de señalización
las células se trataron antes de la lisis para determinar los efectos de ligandos del factor de crecimiento y en TKIs expresión de la proteína. células parentales se sembraron y se dejaron adherirse y crecer durante 24 a 48 horas hasta que los platos fueron aproximadamente 40% de confluencia. Las células fueron entonces en ayunas durante 24 horas con RPMI libre de suero (con 0,5% de BSA). Después de 24 horas de inanición, las células fueron tratadas con o sin respectivo TKIs (erlotinib o SU11274) durante 24 horas. Después de 24 horas de tratamiento TKI, las células fueron tratadas con o sin ligandos del factor de crecimiento (15 ng /ml EGF durante 2,5 minutos o 40 ng /ml de HGF durante 7,5 minutos a 37 ° C). Inmediatamente después del tratamiento de ligando, se lisaron las células y se recogieron para inmunotransferencia.
lisis celular e inmunotransferencia
Después de todos los pre-tratamientos de células (como se describe anteriormente), las células se lisaron en tampón (Tris 20 mM , 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% NP-40, 0,42% NaF, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 orthovanidate sodio nM y 10 mM inhibidor de la proteasa cóctel (Sigma-Aldrich). Los lisados celulares fueron luego a electroforesis para la separación de 7,5 % o 10% de SDS-PAGE. Separado proteínas después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboatories, Hercules, CA) y se sondearon con anticuerpos para las proteínas relacionadas con la vía Wnt o mTOR. inmunotransferencias se desarrollaron usando el kit de quimioluminiscencia Pierce ECL sustrato (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, 32109) y modulaciones de diferentes proteínas se calcularon mediante análisis densitométrico utilizando el software ImageJ NIH.
celular MTT viabilidad Ensayo
Los efectos de diversas ITC sobre H2170 y H1975 celular viabilidad se midieron por ensayo de reducción de colorante MTT colorimétrico usando MTT 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro de tinte de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se colocaron en placas a 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y después de 24 horas, las células se trataron con inhibidores durante 72 horas. reactivo MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat. No. M5655) se añadió, y las células se incubaron a 37 ° C durante 4 horas, después de lo cual los cristales de formazán se disolvieron y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 570 Nuevo Méjico. Porcentaje viabilidad de las células tratadas con fármaco se calculó en relación con las células control no tratadas. Todos los experimentos de viabilidad celular se realizaron tres veces en réplicas de seis para cada condición de tratamiento.
inmunofluorescencia
20.000 células se sembraron en 8 pocillos cámara de diapositivas de vidrio por pocillo (Lab-Tek II Cámara de diapositivas Sistema, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) que se pre-recubiertas con poli-L-lisina (solución 0,01%) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células se dejaron adherir durante 24 horas, después de lo cual se mantuvieron en ayunas durante la noche células en medio libre de suero (con 0,5% de BSA). Las células se trataron luego con EGF /HGF (15 ng /ml EGF durante 2,5 minutos o 40 ng /ml de HGF durante 7,5 minutos a 37 ° C), y se fijaron con solución de paraformaldehído al 4% en 1X PBS. Las células fueron entonces permeabilized (solución X-100 0,1% Triton en 1X PBS) y se bloquearon (tampón que contiene 5% de suero de cabra normal en PBS 1X). Las células se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario β-catenina activa (1: 400) a 4 ° C y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con IgG DyLight 488 anti-ratón anticuerpo secundario (1: 250) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) (Producto#35502) diluido en 1X PBS con 1% de BSA y Hoechst tinte de tinción nuclear (azul). Las células se observaron utilizando un microscopio Zeiss Axio Observador Z1. la intensidad media de fluorescencia de la tinción nuclear de β-catenina activa se midió utilizando el software ImageJ NIH más de 10 campos microscópicos por condición de tratamiento y los valores se promediaron.
qPCR análisis
200.000 células se sembraron en una distancia de 35 mm plato y se dejó que se adhirieran durante 24 horas. medios Starving (RPMI con 0,5% BSA) se añadió a las células durante 24 horas, después de lo cual se recogió el ARN total usando Invitrogen RNA mini kit. El ARN se cuantificó usando Tome 3 nanogota y luego se utilizaron concentraciones iguales de ARN para la síntesis de ADNc. Las secuencias de los cebadores utilizados para la β-catenina son F: TGGATGGGCTGCCTCCAGGTGAC y R: ACCAGCCCACCCCTCGAGCCC y para GAPDH son F: TTGCCAATGACCCCTTCA y R: CGCCCCACTTGATTTTGGA. qPCR se realizó utilizando superíndices III Platinum de dos pasos Kit qRT-PCR (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La expresión de cada gen se analizó por triplicado y los valores de Ct se normalizaron con GAPDH. a continuación, los datos se analizaron usando el método ΔΔCt y doblar cambios se calcularon utilizando 2
(- ΔΔCt).
El análisis estadístico
Se realizaron Todos los experimentos de tres a cinco veces. La prueba t de Student o ANOVA se utilizó para analizar la significación estadística de los datos. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa a lo largo del estudio.
Resultados
Comparación de IC
50 de líneas celulares H2170 parentales y resistentes con la línea celular H1975
H2170 células fueron inicialmente moderadamente sensibles a los ITC erlotinib y SU11274 debido a su estado de EGFR de tipo salvaje (Tabla 1). Como se describe en nuestro estudio anterior [17], los padres (naïve) H2170 células fueron tratadas con concentraciones crecientes de erlotinib (0,5 a 14 mM) y SU11274 (2,5 a 17 mM) durante varios meses para obtener células con resistencia estable a altas concentraciones de estos ITC. Estas células mostraron resistencia estable después de 12 pasajes en medios libres de drogas. MTT ensayos de viabilidad celular se realizaron para determinar la IC
50 para erlotinib y SU11274.
50 valores se calculó utilizando el software Sigma Plot 12.5 y los resultados se muestran en la Tabla 1. El IC (H2170-ER) y resistente SU11274 células del IC
50 de erlotinib y SU11274 en erlotinib H2170 H2170-resistente (RS) se encontró que era 11 a 22 veces y 4 a 5 veces mayor, respectivamente [17], en comparación con células parentales (H2170 H2170-P). Sin embargo, el IC se encontraron
50 de erlotinib y SU11274 a ser aproximadamente 15 veces y 2 veces mayores, respectivamente, en las células H1975, en comparación con las células parentales H2170. Durante este estudio, se mantuvieron las células H2170 TKI-resistentes en medios que contienen 10 erlotinib M o 10 M SU11274. células H1975 son naturalmente resistentes a erlotinib, debido a la presencia de la mutación T790M, y para el propósito de este estudio células H1975 se cultivaron en medio libre de drogas.
inhibición dual por EGFR y c- Met ITC sobre la proliferación de células H1975
Dado que, la mutación de EGFR T790M se sabe que confieren resistencia erlotinib (Tabla 1) en el CPNM, es importante identificar el potencial de sensibilidad a los medicamentos causada por esta mutación. Por lo tanto, la prueba de la sinergia de drogas en las células H1975 (positivos para las mutaciones L858R y T790M EGFR) con erlotinib y SU11274 a través de ensayo de viabilidad celular MTT. Se observaron efectos sinérgicos en la inhibición del crecimiento de células H1975 con erlotinib y SU11274 en combinación a concentraciones de 1 M (relación 1: 1 de cada fármaco) y 3 M (relación 1: 1 de cada fármaco) (Fig 1). Sin embargo, sus efectos combinatorios no eran sinérgico encima de la concentración de 5 mM de cada fármaco (relación 1: 1) (datos no mostrados). La sinergia se determinó a través de se obtuvieron valores por debajo de 1 v2.0 software Calcusyn y el índice combinatoria (CI) (valores de CI & lt; 1 indican sinergia) [46]
H1975 células se colocaron en placas a 3000 células por pocillo en una. placa de 96 pocillos y después de 24 horas se trataron con diferentes combinaciones de EGFR erlotinib inhibidor y c-Met SU11274 inhibidor. Después de 72 horas de ensayo de viabilidad celular MTT exposición al fármaco se realizó. efectos inhibidores sinérgicos en la inhibición de crecimiento de células H1975 se observaron tras el tratamiento de combinación de erlotinib y SU11274 a concentraciones de 1 mM y 3 mM (relación 1: 1 de cada fármaco). sinergismo fármaco se calculó utilizando el software v2.0 Calcusyn y los valores de CI estaban por debajo de 1. El análisis ANOVA se utilizó para determinar diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (n = 3, p & lt; 0,01).
Papel de Wnt y vías de mTOR en EGFR /c-Met-TKI resistencia
con el fin de dilucidar el mecanismo de resistencia al erlotinib y SU11274 en células H2170, los niveles de expresión de las proteínas clave implicadas en la vía /mTOR Wnt se determinaron mediante inmunotransferencia. Hemos observado que activa β-catenina se reguló 1,5 veces y 2,0 veces en presencia de EGF y erlotinib, respectivamente, en las células H2170-ER, en comparación con los mismos tratamientos en células parentales H2170. También observamos que GATA-6 se upregulated 2,0 a 3,0 veces en la presencia y ausencia de EGF y erlotinib en células H2170-ER en comparación con mismos tratamientos en las células H2170-P. Además, se encontró p-GSK3 (Ser9) que se upregulated aproximadamente 2 veces en las células H2170-ER en presencia de erlotinib en comparación con el erlotinib tratada células H2170-P (Fig 2).
H2170 -P, las células H2170-H2170-ER y SR se sembraron en placas de 35 mm a 125.000 células por placa y mueren de inanición (RPMI 1640 con un 0,5% de BSA) durante 24 horas antes de ligando (EGF y HGF) y /o drogas (erlotinib y SU11274 tratamientos). Después de análisis de transferencia Western aumento de la expresión de proteínas relacionadas con la vía Wnt y mTOR en H2170-ER y no se observaron células H2170-SR en comparación con las células H2170-P con la excepción de p-GSK-3β en las células H2170 SR. Los cambios veces se calcularon utilizando el software ImageJ. (N = 3, p & lt; 0,05).
Del mismo modo, en las células H2170-SR, observamos activa β-catenina se upregulated 2,0 a 4,0 veces en la presencia y ausencia de HGF y SU11274 ; p-GSK-3b se upregulated 1,5 a 2,0 veces en presencia y ausencia de HGF y SU11274; y GATA-6 era también upregulated 3,0 a 4,0 veces en presencia de HGF y SU11274, en comparación con los mismos tratamientos en las células H2170-P (P & lt; 0,01) (Fig 2). No se observó ninguna modulación significativa en la expresión de proteínas totales entre el H2170-P, H2170-ER y las células H2170-SR (Fig 2).
aumento de la acumulación nuclear de activo β-catenina en H2170-ER y H2170 células -SR
Debido al hecho de que activa β-catenina es un efector aguas abajo clave en la vía canónica de señalización Wnt y se observa que se upregulated significativamente en las células H2170-ER y H2170-SR (Fig 2). Se analizó la localización de activos β-catenina en H2170-P, H2170-ER y las células H2170-SR mediante inmunofluorescencia. Tras la activación, β-catenina se acumula en el núcleo, e interactúa con TCF /LEF para iniciar la transcripción. Hemos observado que en H2170-ER y las células H2170-SR, hubo una mayor localización de β-catenina en el núcleo en comparación con las células H2170-P. Se encontró que la intensidad fluorescente media de la tinción de β-catenina activo en el núcleo para ser 1,9 y 2,5 veces mayor en las células H2170-ER en comparación con H2170-P, en EGF células tratadas y no tratadas, respectivamente (p & lt; 0,01) (Fig 3) . Del mismo modo, se encontró que la intensidad media de fluorescencia de la tinción de β-catenina activo en el núcleo para ser 2,9 y 3,1 veces mayor en las células H2170-SR, en comparación con las células H2170-P, en células HGF tratados y no tratados, respectivamente (p & lt; 0,01 ) (Fig 3).
H2170-P, las células H2170-ER y H2170-SR se sembraron en portaobjetos de 8 pocillos de cámara a 20.000 células por pocillo y después de hambre durante la noche. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 y después se bloquearon con 5% de suero normal de cabra y 0.3% de Triton X-100 antes de la incubación con el anticuerpo primario. Las células fueron incubadas con 488 DyLight anticuerpo secundario conjugado y a continuación se observaron bajo el microscopio de fluorescencia. El color verde de la imagen representa activa tinción β-catenina en la célula y el color púrpura representa DAPI tinción nuclear. Intensidad media de la tinción de β-catenina activa se midió cuantitativamente utilizando el software ImageJ. Se observó una mayor acumulación nuclear de activo β-catenina en las células H2170-ER y H2170-SR, en comparación con células H2170-P (n = 3, p & lt; 0,01).
La activación de la mTOR vía en células H1975
con el fin de esclarecer el modo de resistencia al erlotinib y SU11274 en la línea celular H1975 (T790M-positivo), inmunotransferencia se realizó para analizar las modulaciones en los niveles de expresión de las proteínas Wnt importantes y mTOR. Se encontró activo β-catenina ser downregulated 1,5 veces en H1975 células en presencia de erlotinib y EGF en comparación con las células H2170-P con mismos tratamientos. GATA-6 se encontró que se downregulated 1.5 a 6.5 veces en H1975 células en presencia y en ausencia de EGF y el tratamiento erlotinib en comparación con mismos tratamientos en las células H2170-P. Además, el regulador de Wnt negativo Axin1 se encontró que se upregulated 1,5 veces y 2,5 veces en H1975 células, en comparación con las células H2170-P, en presencia de EGF y erlotinib, respectivamente (Fig 4A). Las modulaciones en la expresión de proteínas relacionadas vía Wnt clave, siguientes EGF y el tratamiento erlotinib sugieren que en células H1975, la vía /β-catenina Wnt no está directamente implicada en el desarrollo de la resistencia a erlotinib
.
H1975 y H2170-P las células se sembraron a 125.000 células por placa en placas de 35 mm y mueren de inanición (RPMI 1640 con 0,5% de BSA) durante 24 horas antes de ligando (EGF y HGF) y /o drogas (erlotinib y SU11274) tratamientos y se analizaron mediante Western blot. (A) activa β-catenina y se observaron GATA-6 que se downregulated y p-ERK, p-mTOR, p-p70S6K, se observaron p-LRP5 /6 y Axin1 ser upregulated en H1975 células en comparación con los mismos tratamientos en H2170-P células (n≥3, P & lt; 0,05). se observaron (B) Del mismo modo activo β-catenina y GATA-6 que se downregulated mientras que, p-GSK3 no se moduló significativamente en H1975 células en comparación con las células H2170-P con mismos tratamientos. También observamos p-ERK, p-LRP5 /6, p-mTOR, p-p70S6K, p-4E-BP1 y Axin1 fueron todos upregulated en H1975 células en comparación con las células H2170-P con mismos tratamientos (n≥3, p & lt ; 0,05)
Además, p-ERK se reguló 10,5 y 4,6 veces mayor en las células H1975 en presencia de erlotinib y ambos erlotinib y EGF, respectivamente, en comparación con igual tratamientos en células H2170-P. . También, p-mTOR se upregulated 1,5 veces en H1975 células en comparación con las células H2170-P en presencia de erlotinib. Además, p-p70S6K se encontró que se upregulated 1,5 veces a 3,6 veces en H1975 células en presencia y en ausencia de EGF y erlotinib en comparación con mismos tratamientos en las células H2170-P. Curiosamente, p-LRP5 /6, un Wnt co-receptor común, se encontró que se upregulated 1.8 a 2.5 veces en H1975 células en presencia y ausencia de erlotinib en comparación con mismos tratamientos en las células H2170-P (p & lt; 0,05) (Fig 4A).
Además, la inmunotransferencia se realizó con el fin de dilucidar las similitudes o diferencias en la expresión de proteínas en células H1975 después del tratamiento con HGF y SU11274. Se encontró activo β-catenina ser downregulated 1,5 a 2,0 veces en H1975 células en presencia y ausencia de SU11274 y GATA-6 también se encontró que se downregulated 1.5 hasta 3.5 veces en la presencia y ausencia de HGF y SU11274 en H1975 las células cuando se comparan con los tratamientos mismos a las células H2170-P. No se observó ningún modulaciones significativas en la expresión de p-GSK3 (Ser9) en células H1975, en comparación con los grupos de tratamiento similares en las células H2170-P. Además, el regulador de Wnt negativo Axin1 se encontró que se upregulated 2,0 veces en H1975 células, en presencia de HGF y SU11274 en comparación con las células H2170-P con mismos tratamientos (p & lt; 0,05). (Fig 4B) guía
Además, p-ERK y no se observaron p-LRP5 /6 que se upregulated hasta 2,0 veces mayor en las células H1975, en comparación con células H2170-P en presencia de SU11274. También, p-mTOR se upregulated 1,5 veces en ausencia de EGF y erlotinib y en presencia de sólo el erlotinib, mientras que p-p70S6K se upregulated 1,5 a 3 veces en la presencia y ausencia de HGF y SU11274 en H1975 células en comparación con mismos tratamientos en las células H2170-P (P & lt; 0,05) (Fig 4B). No se observó ninguna modulación significativa en la expresión de las proteínas totales clave en las células H1975, en comparación con las células H2170-P (S1) Fig.
La regulación positiva de la vía mTOR en las células H1975 en comparación con erlotinib y resistente H2170 células resistentes SU11274
para dilucidar las similitudes o diferencias en el modo de resistencia a erlotinib se produce en el H1975 y H2170 células-ER, inmunotransferencia se realizó después de EGF y erlotinib. p-LRP5 /6 se downregulated 1.5 a 2.2 veces en H1975 células en presencia y en ausencia de EGF y erlotinib en comparación con mismos tratamientos en las células H2170-ER. GATA-6 se encontró que estaba regulado por disminución de 3,6 veces y 2,9 veces en H1975 células en comparación con las células H2170-ER en presencia de EGF y erlotinib, respectivamente, y p-ERK se encontró que se upregulated 2,0 a 70,0 veces en H1975 las células en presencia y ausencia de erlotinib y EGF cuando se comparan con los tratamientos mismos a células H2170-ER. También, p-mTOR se encontró que se upregulated hasta 1,6 veces en la presencia de EGF solamente y en ausencia de ambos EGF y erlotinib en comparación con las células H1975 H2170-ER con los mismos tratamientos. Además, p-p70S6K se encontró que se upregulated hasta 2,0 veces en H1975 células en comparación con las células H2170-ER en ausencia y presencia de EGF y erlotinib ambos (p & lt; 0,05). (Fig 5A)
H1975, H2170-ER y H2170-SR se sembraron a 125.000 células por placa en placas de 35 mm y el hambre (RPMI 1640 con un 0,5% de BSA) durante 24 horas antes de ligando (EGF y HGF) y /o drogas (erlotinib y SU11274 ) los tratamientos y se analizaron mediante Western blot. No se observaron (A) GATA-6 y P-LRP5 /6 para ser regulados a la baja en las células H1975, en comparación con las células H2170 ER en mismos tratamientos. Sin embargo, p-ERK, p-mTOR y p-p70S6K se upregulated en H1975 células en comparación con las células H2170-ER en tratamientos similares (n≥3, P & lt; 0,05). (B) activa β-catenina y no se observaron GATA-6 para ser regulados a la baja en las células H1975 en comparación con los mismos tratamientos en las células H2170-SR. También observamos que el p-ERK, p-mTOR y p-p70S6K se upregulated en las células H1975, en comparación con las células H2170-SR en mismos tratamientos. Los cambios veces se calcularon utilizando el software ImageJ (n≥3, p & lt; 0,05).
Del mismo modo, a fin de elucidar las similitudes o diferencias en el modo de resistencia TKI que ocurre en el H1975 y H2170 células-SR, inmunotransferencia se realizó después del tratamiento HGF y SU11274. se observó activa β-catenina ser downregulated 2,0 veces en H1975 células, en comparación con las células H2170-SR en presencia y en ausencia de HGF y SU11274. GATA-6 se downregulated 1,5-6,0 veces en H1975 células en comparación con las células H2170-SR en presencia y en ausencia de HGF y SU11274. p-ERK se encontró que se upregulated 2 veces y 6,0 veces en H1975 células, en comparación con las células H2170-SR, en ausencia de HGF y SU11274 tanto y en presencia de SU11274 solo, respectivamente. p-mTOR se reguló 5,5 veces y 1,5 veces en ausencia tanto de HGF y SU11274; y en presencia de SU11274 solo, respectivamente, en células H1975, en comparación con los mismos tratamientos en las células H2170-SR. Además, también se encontró p-p70S6K ser upregulated 2,0 a 6,0 veces en H1975 células en comparación con las células H2170-SR en presencia y en ausencia de HGF y SU11274 (p & lt; 0,05). (Fig 5B)
el aumento de expresión β-catenina activa en H2170-ER y las células H2170-SR
a fin de analizar la expresión de genes de β-catenina en las células H2170 hemos realizado experimentos de qPCR como se describe en la sección de métodos. Los resultados indican que en las células H2170-ER expresión de β-catenina en los niveles de ARNm fue de aproximadamente 3,4 veces mayor en comparación con las células H2170-P (P & lt; 0,01). Del mismo modo, la expresión β-catenina en las células H2170-SR fue 3,2 veces mayor en comparación con las células H2170-P (P & lt; 0,01). Sin embargo, no se observó ningún cambio significativo en la expresión del gen β-catenina en células H1975 en comparación con las células H2170-P. (Fig 6).
H2170 y H1975 se sembraron las células a 125.000 células por placas de 35 mm y se les permitió adherirse y crecer durante 24 horas. Después de lo cual las células se mueren de inanición (RPMI con 0,5% BSA) durante 24 horas y luego se procesaron para la recogida de ARN. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que β-catenina está regulada positivamente en las células H2170-H2170-ER y SR en comparación con las células H2170-P. Mientras, en las células H1975 (EGFR T790M mutado) que no observó ninguna modulación significativa de β-catenina en comparación con las células H2170-P. La expresión de cada gen se analizó por triplicado (n = 2, p & lt; 0,01).
Efecto de Wnt y mTOR inhibidores solos y en combinación con erlotinib en células H1975
celular MTT