Paciente
Extracto
Antecedentes
La topoisomerasa I (Top1) es el blanco de inhibidor Top1 quimioterapia. La
TOP1
gen, localizado en 20q12-q13.1, se detecta con frecuencia en números de copias elevados en el cáncer colorrectal (CRC). El presente estudio explora el mecanismo, la frecuencia y el impacto pronóstico de
TOP1
aberraciones de genes en la etapa III CRC y cómo se puede detectar mediante hibridación in situ fluorescente (FISH).
Métodos
Nueve CRC de líneas celulares diferenciales en metafase se analizaron por FISH con una sonda
TOP1
en combinación con una sonda de referencia, sea sobre la región centromérica del cromosoma 20 (CEN-20) o el cromosoma 2 (CEN-2) . Muestras de tejido de 154 pacientes en estadio III CRC recibido quimioterapia previamente, previamente estudiados con
TOP1 /
CEN-20, se analizaron con
TOP1 /
CEN-2. Las relaciones entre el estado de biomarcadores y la supervivencia global (SG), tiempo hasta la recurrencia (TTR) en el CCR y el tiempo hasta la recurrencia local (LR; sólo el cáncer de recto). Se determinaron
Resultados
se observaron TOP1
aberraciones en cuatro metafases de líneas celulares. En todas las líneas celulares se encontró CEN-2 para reflejar los niveles de ploidía cromosómicas y por lo tanto la
TOP1
/CEN-2 fue seleccionado combinación sonda para identificar
ganancias TOP1
genes
(TOP1 /
CEN-2≥1.5). Ciento tres pacientes (68,2%) tenían
TOP1
ganancia, de los cuales 15 pacientes (14,6%) albergaban una amplificación (
TOP1 /
CEN-20≥2.0).
TOP1
ganancia gen no tenían ninguna asociación con variables clínicas, mientras que
TOP1
amplificación mostraron una tendencia no significativa hacia ya TTR (HR multivariable: 0,50, p = 0,08). Una vez que los casos amplificados fueron separados de los otros casos de ganancia genética, la no amplificación de genes aumenta (
TOP1
/CEN-2≥1.5 y TOP1 /CEN-20 & lt; 2,0) mostraron una tendencia hacia más corto TTR (HR univariado: 1,57, p = 0,07).
Conclusiones
TOP1
aumento de copias del gen número se repite con frecuencia en la etapa III CRC en un mecanismo que a menudo incluye CEN-20. El uso de CEN-2 como una medida de niveles de ploidía tumoral, hemos sido capaces de discriminar entre diferentes mecanismos de ganancia genética, que parecían diferir de impacto pronóstico.
TOP1
directrices de peces han sido actualizados
Visto:. Smith DH, Christensen IJ, Jensen NF, Markussen B, Romer MU, Nygård SB, et al. (2013) Mecanismos de la topoisomerasa I (
TOP1
) Gen Copia Número Aumento en una cohorte de pacientes de cáncer colorrectal en estadio III. PLoS ONE 8 (4): e60613. doi: 10.1371 /journal.pone.0060613
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 19 de diciembre de 2012; Aceptado: 28 Febrero 2013; Publicado: 5 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Smith et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Agencia danesa para la Ciencia, Tecnología e Innovación a través del programa de doctorado industrial. Nils Brunner y Hans Jørgen Nielsen fueron apoyados por el Consejo Danés de Investigación Estratégica, Simon Fougner Family Foundation Hartmanns, Fundación IMK Almene, Fundación Vigo Skovgaards Kathrine og, Fundación Tømrermester Johannes Niebla, Fabrikant Einar Willumsens Memorial Trust, Sociedad Danesa del Cáncer, el médico danés Consejo de Investigación, la Fundación Hede Nielsen, Directora de la Fundación Ib Henriksens, dueño de la serrería Jeppe Juhl y Fundación esposa Ovita Juhl, El Fondo Kornerup, La Aase y el Fondo Danielsen y Ejnar El Aage y Johanne Louis-Hansen Fondo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Hersi David Smith, Sven Müller y Kirsten Vang Nielsen trabajan en Dako A /S . Nils Brünner es asesor médico de Dako A /S. Jarle Ib Christensen es un consultor externo para Dako A /S. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. En 2011, el CRC representó aproximadamente el nueve por ciento de los nuevos casos de cáncer, así como nueve por ciento de las muertes por cáncer en los EE.UU. [1]. Para el tratamiento de CRC avanzado (estadio IV), dos opciones están disponibles quimioterapéuticos: 5-fluorouracilo (5-FU, capecitabina) en combinación con irinotecan (FOLFIRI) u oxaliplatino (FOLFOX) más agentes biológicos. Varios estudios reportan tasas de respuesta similares entre los dos regímenes de tratamiento de primera línea de la enfermedad avanzada [2] - [4], con un único reportar una tasa de respuesta significativamente mayor con FOLFOX estudio [5]. Curiosamente, uno de estos estudios informaron de una segunda línea 6% de respuesta objetiva al tratamiento FOLFIRI siguiente FOLFOX fracasado y una respuesta del 21% objetiva a la segunda línea de tratamiento FOLFOX siguiente fallado FOLFIRI, indicativa de la resistencia transversal no completa entre oxaliplatino irinotecán y [4]. Este hallazgo plantea la cuestión de si un subconjunto de pacientes que recibieron FOLFOX como tratamiento de primera línea se habría beneficiado de FOLFIRI como tratamiento de primera línea, o viceversa. Por consiguiente, consideramos que se justifican los esfuerzos dirigidos al descubrimiento de un perfil de biomarcador predictivo para el resultado del tratamiento FOLFOX /FOLFIRI.
El irinotecan, un profármaco del SN-38, funciona mediante la inhibición de la enzima topoisomerasa I (Top1) [6]. Top1 juega un papel esencial en el alivio de las tensiones topológicos que surgen durante la replicación del ADN y la transcripción de la mella, relajante y re-ligación de la estructura de doble cadena de ADN. SN-38 se une Top1 y estabiliza los complejos ADN-Top1 intermedios. La posterior re-ligación se inhibe, lo que finalmente resulta en la muerte celular debido a daños en el ADN durante la replicación de ADN o transcripción [6], [7]. Top1 ha debido a su papel como un objetivo para el SN-38 ha propuesto como un posible biomarcador predictivo para el resultado del tratamiento FOLFIRI. En el cáncer colorrectal avanzado, dos grandes estudios retrospectivos que investigan la relación entre los niveles de proteína Top1 y el resultado del tratamiento con irinotecan producen resultados contradictorios [8], [9]. Aunque estos esfuerzos se han dirigido al estudio de los niveles de proteína Top1, la investigación de alteraciones cromosómicas que involucran el gen de la topoisomerasa I (símbolo:
TOP1
) son limitados. Situado en 20q12-q13.1, parte de la región 20q ganado frecuentemente implicado en la progresión de adenoma a carcinoma [10] - [13],
TOP1
se encuentra en números de copias elevados en una gran fracción de fase III CRC muestras cuando se detecta por hibridación in situ fluorescente (FISH) [14], [15], España
en nuestro estudio de
TOP1
, ya hemos demostrado que en un CRC III cohorte de pacientes habían recibido quimioterapia previamente etapa (n = 154), aumentó
TOP1
número de copias del gen se asoció significativamente con una mejor supervivencia (OS) [15]. Curiosamente, se estima que el 71% de los pacientes albergaba un
TOP1
aumento de copias del gen, mientras que sólo el 10% de los pacientes albergaba un
TOP1
amplificación [
TOP1
/CEN-20 ( centrómero 20) Relación de ≥2.0] [15], lo que indica que la amplificación del gen no es el mecanismo más común para generar copias adicionales de
TOP1
. Una fuerte correlación entre el
TOP1 Opiniones y CEN-20 se encontró, dejando al descubierto una asociación entre el
TOP1
y el número de copias CEN-20 aumentos. Esto sugeriría que los mecanismos de ganancia gen que implican tanto la
TOP1
lugar y también se producen la región centromérica del cromosoma 20, posiblemente por el aumento de todo el brazo 20q por ejemplo, formación isocromosoma o toda la ganancia cromosoma 20 (aneusomy). Este tipo de aumento de número de copias de genes se produce por mecanismos relacionados con missegregation cromosoma y no la amplificación de genes. Medición de copias de genes alteraciones en el número por FISH tradicionalmente se basa en el uso de una sonda de referencia mismo cromosoma, por ejemplo, recurrir al CEN-20 para la medición de los genes en el cromosoma 20, por lo tanto, se propuso desarrollar un nuevo ensayo FISH para distinguir las muestras de tumor con
TOP1
número de copias aumenta debido a las amplificaciones de aquellos con los aumentos debidos a 20q ganancia o por aneusomy la aplicación de una sonda de referencia dirigido a un cromosoma no relacionado.
el propósito de este estudio es determinar la frecuencia de
TOP1
alteraciones, asigne ningún efecto pronóstico de estas aberraciones de genes, identificar los puntos de corte que reflejan los mecanismos genéticos subyacentes de
TOP1
copiar y alteraciones en el número de actualización directrices FISH de puntuación para reducir la carga de trabajo de observador. Para lograr estos objetivos, el mecanismo de
TOP1
ganancia de copias del gen se investigó en un panel de líneas celulares de CRC con el objetivo de identificar una sonda de referencia que refleje verdaderamente los niveles de ploidía, de modo que
TOP1
aumenta el número de copias deben ser detectados en relación con el número total de cromosomas (nivel de ploidía) y esto se hace mejor mediante el uso de un gen al centrómero relación. Una nueva combinación de la sonda, que consiste en la sonda
TOP1 Opiniones y un centrómero 2-específica (CEN-2), se aplicó luego a la etapa III muestras de pacientes de CRC probados anteriormente para discriminar entre pacientes portadores de
TOP1
número de copias de los aumentos causados por mecanismos que implican missegregation cromosomas y los causados por la amplificación del gen. Se investigó la relación entre los diferentes mecanismos de
TOP1
copia aumento de número y el pronóstico del paciente. Además, en base a todos los datos de FISH, podríamos actualizar el
TOP1
directrices FISH de puntuación.
Materiales y Métodos
2.1 Pacientes y material clínico
Uno ciento cincuenta y cuatro pacientes con CRC verificada histológicamente en estadio III adenocarcinomas y muestras de tumores que se pueden obtener FFPE fueron seleccionados como se ha descrito anteriormente (ver Fig. 1) [15]. Todos los pacientes tenían resecciones quirúrgicas de la CRC y no recibieron ninguna radiactividad adyuvante y /o quimioterapia, ya que esto no era parte del tratamiento estándar CRC en Dinamarca en el momento (abril 1991-agosto 1993). Los pacientes fueron asignados al azar para recibir ya sea ranitidina o placebo durante un máximo de cinco años con ningún efecto sobre la supervivencia de ranitidina informó [16]. Los participantes por escrito el consentimiento informado y el estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki II con la aprobación del Consejo Nacional de Salud de Dinamarca (2760-419-1989), la Agencia de Protección de Datos (1991-1110-751) y el Comité de Ética Central Nacional ( KF 01 a 2.045 /91). La aprobación incluye la colección de muestras de tejido para su posterior análisis de los marcadores biológicos (KF 01-078 /93) guía empresas
2.2 Preparación de metafases & amp.; Para no truncar los núcleos en interfase
líneas celulares de CRC Colo-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM12, SW620 y se obtuvieron del Programa de Terapéutica NCI /Desarrollo, en tanto que sistema antibloqueo de frenos -1, LoVo, LS-174T y se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection. Las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C, 5% de CO
2 en RPMI 1640 medio de crecimiento GlutaMAX ™ (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Invitrogen). Una vez que los cultivos alcanzaron una confluencia de ~ 70%, se añadió colcemid (Invitrogen) y se incubaron los cultivos durante 2 horas a 37 ° C. Posteriormente, se recogieron las células y un tratamiento hipotónico se llevó a cabo (0,075 M KCl) durante 10 min. La fijación se realiza (fijador: 03:01 v /v metanol absoluto y ácido acético glacial). Y esta suspensión se goteó sobre portaobjetos de vidrio
2.3 TOP1 /CEN-2 sonda Mezcla
La
TOP1
sonda del gen ha sido previamente descrito en otra parte [14]. A CEN-2 sonda específica (Dako, Glostrup, Dinamarca), que consta de varios monómeros de ácido nucleico de péptido marcado con FITC dirigidos a secuencias de α-satélite repetitivos, se combinó con la sonda del gen de DNA marcados con Rojo Texas en la memoria intermedia de IQFISH [17] (Dako). El
TOP1
/CEN-20 combinación de la sonda se ha descrito previamente [14].
FISH 2.4 Procedimiento
Los peces fueron reactivos del Kit de accesorios FISH Citología (K5499) y el FISH Accessory Kit Histología (K5799) (Dako). especímenes metafase se fijaron en 3,7% de formaldehído, lavado, deshidratado (en una, 85%, serie de etanol 70% 96%) y se seca al aire. FISH sonda se cargó en la diapositiva, se desnaturalizaron a 82 ° C (
TOP1
/CEN-2:05 min,
TOP1
/CEN-20:10 min) y se hibridan (
TOP1
/CEN-02:01 h,
TOP1
/CEN-20: la noche). sonda en exceso se eliminó por lavado en rigor de amortiguación (
TOP1
/CEN-2:63 ° C,
TOP1
/CEN-20:65 ° C). Las láminas fueron lavadas, deshidratada, seca al aire y se monta.
TOP1
/CEN-2 FISH hibridación con muestras FFPE (espesor: 3 micras) se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Dako). Brevemente, los portaobjetos se trataron previamente de calor (en el horno microondas) y digerida con pepsina a 37 ° C. Los portaobjetos se desnaturalizaron a continuación a 66 ° C durante 10 minutos y se hibridaron a 45 ° C durante 1-2 horas y, posteriormente, tratados como se ha descrito anteriormente.
2.4.1 de puntuación.
señales de FISH fueron inicialmente anotado como se describe anteriormente [14]. En pocas palabras, las señales se contaron en 60 núcleos que no se superponen pertinentes si las señales eran, como mínimo, visible a 200 × magnificación en el filtro apropiado. La puntuación se realizó a 1000 × magnificación en la Red doble filtro Texas /FITC. conteos de señal se escribe directamente en una hoja de puntuación electrónica (proporcionado amablemente por A. Schønau, Dako, Glostrup, Dinamarca). Inicialmente, 60 núcleos se anotó para cada espécimen siguientes
directrices FISH pharmDx ™ TOP2A
(Código K5333, en el prospecto, 1
ª edición, 2008.01.18), donde los núcleos que albergan ambas señales, así como núcleos de la acogida sólo las señales de referencia se puntuaron, lo que facilita la detección de deleciones de genes. Para mejorar la sensibilidad del ensayo, únicamente los núcleos albergar tanto las señales génicas y de referencia se incluyeron para su posterior análisis.
Para determinar el mecanismo de
TOP1
copia aumento de número en líneas celulares, ubicación de las señales y los números eran observado durante 50 metafases para cada línea celular. El número total de cromosomas para cada línea celular se determinó tomando imágenes digitales de tres metafases para cada línea celular y contando el número total de cromosomas manualmente
.
Para determinar la haploides, diploides, triploides y tetraploides rangos de CEN -2, 60 núcleos se contaron en el epitelio no afectada adyacente al tejido tumoral. La gama diploide se definió como sigue 2n - (n /2) [min] ≤2n & lt; 2n + (n /2) [max], donde 2n es igual a la media de CEN-2 cargos por núcleo en el (diploide) epitelio afectado. El triploides y tetraploides rangos fueron encontrados mediante el uso de 3n o 4n en lugar de 2n, respectivamente. Los rangos de nivel de ploidía haploides y altas se definieron como por debajo del rango diploide y por encima de los rangos de tetraploides, respectivamente. Definición de rangos de ploidía se ha descrito previamente [18].
2.5 Métodos Estadísticos
Todo descriptiva y la supervivencia de los análisis se realizaron mediante el uso de SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, EE.UU.). R versión 2.15.1 se utilizó en la optimización del método de puntuación.
Métodos
2.5.1 de puntuación.
Gene al centrómero proporciones fueron calculadas mediante la inclusión de cualquiera de los primeros 10 o 20 núcleos, la determinación de
TOP1
situación y comparando esto con el estado tras la inclusión de todos los núcleos relevantes. La concordancia se calculó mediante el uso de tau de Kendall [tau = (totalmente de acuerdo-desacuerdo) /(+ está de acuerdo en desacuerdo)]. intervalos límite, próximos a los valores de corte, en la que deben incluirse núcleos adicionales (por 10 núcleos, otros 10 núcleos adicionales tuvieron que ser anotado; por 20 núcleos, un adicional de 20 núcleos tenían que anotó) se definieron como mayor que o igual a 1,35 (min) y menos de 1,65 (max) cuando se aplica de corte fue de 1,5. Uso de HER2 /CEN-17 directrices, el intervalo que abarca el límite de corte de 2,0 se define como mayor que o igual a 1,8 (min) y menos de 2,2 (max) [19]. Concordancia y el número medio de núcleos obtenidos se calcularon con y sin límite intervalos
2.5.2 Análisis de supervivencia
Se consideraron tres criterios de valoración:.. La supervivencia global (OS, el tiempo hasta la muerte por cualquier causa) , tiempo hasta la recurrencia (TTR, el tiempo para cualquier evento relacionado con el cáncer colorrectal) y el tiempo para la recurrencia local del cáncer de recto (LR) (descrito en detalle en [15]). las estimaciones de Kaplan-Meier de las probabilidades de supervivencia se presentan para las variables binarias y algunas combinaciones. El análisis multivariante se realizó ajustar por sexo, (diferencia por cada 10 años más de edad) la edad y la localización del tumor (RC frente a CC). Se utilizó un análisis de regresión de Cox para el análisis. Los modelos fueron validados mediante la evaluación de la hipótesis de proporcionalidad y la linealidad de las covariables continuas que emplean Schönfeld y martingala residuales.
TOP1 Opiniones y número de copias de CEN-2, cuando se analizó como una variable continua fueron transformados log (base 2) y por lo tanto refleja una diferencia de dos veces para estas variables aleatorias. Los resultados se presentan por razones de riesgo (CR) con intervalos de confianza del 95% (IC) y valores de p. Todos los valores p calculados fueron de dos caras y consideraron significativas a 0,05.
Resultados
3.1 Mecanismos de TOP1 copia de genes aumentan a la célula del panel
Para determinar el mecanismo subyacente (s) de
TOP1
aumento del número de copias de genes, metafase para untar se prepararon a partir de un panel de diez líneas celulares de CRC. Metafase preparación fue un éxito para todas menos una de las líneas celulares (LS-174T). Después de la hibridación posterior con el
TOP1
/CEN-20 sonda, metafase para untar se analizaron en relación con el número total de cromosomas, el número de gene y los centrómeros señales, así como la ubicación de la señal, cuyos resultados se puede ver en la Tabla 1 y la Figura 2.
se observaron aumentos del número de copias de genes TOP1
en cuatro de las nueve líneas celulares. En tanto Colo-205 y SW620, aumento de gen parecía estar ligado al cromosoma 20 aneusomy (Fig. 2A y 2D, respectivamente). En HT-29 (Fig. 2B),
TOP1
ganancia gen se produjo de una manera sugestiva de 20q formación isocromosoma. En KM12,
TOP1
ganancia produjo independientemente de la CEN-20 (Fig. 2C). No
se observaron TOP1
amplificaciones. Como se muestra en la Tabla 1, sólo
TOP1
ganancias de genes que no impliquen CEN-20 (de un modo 01:01) se reflejan en el
TOP1
/CEN-20 relación.
A: Colo-205, B: HT-29 (esquina inferior derecha: isocromosoma ampliada digitalmente), C: KM12, D: SW620. Nota:. Debido a la existencia de dos cromátidas de cada cromosoma en metafase, el número observado de señales de genes es el doble de lo que se observa en un núcleo en interfase
3.2 Identificación de una nueva referencia sonda
para identificar un marcador relevante para la ploidía celular, es decir, el número total de cromosomas, el Instituto Nacional del Cáncer y el cielo /M-FISH y CGH base de datos (NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cielo /skyweb.cgi) se proyectó. El cromosoma 2 que parecía ser el menos afectado por las aberraciones numéricas independientes, tales como aumento de todo el cromosoma, y por lo tanto se seleccionó para su posterior análisis en el panel de la metafase línea celular. Como se muestra en la Tabla 1, se encontró que las líneas celulares triploide (Colo-205 y HT-29) para producir tres CEN-2 señales, mientras que las líneas de células diploides producen sólo dos. Todos los
TOP1
gen de copia incrementos se reflejaron en el
TOP1
/CEN-2 escala utilizando un valor de corte de 1,5, lo que representa una situación de 03:02 entre el gen y el centrómero y reflejando un adicional
TOP1
copia en una célula diploide.
3.3 Etapa III CRC paciente material
TOP1
/CEN-2 hibridación FISH y la evaluación se realizó con éxito para 151 de 154 muestras de tumor de FFPE de pacientes (98%) (ver Fig. 1). La distribución de los
TOP1
y CEN-2 señales fue homogénea en las muestras tumorales. Para la mejora sobre la sensibilidad para detectar especímenes albergar copias adicionales de
TOP1
, solamente núcleos albergar tanto
TOP1
y CEN-2 señales se incluyeron en el análisis posterior, lo que resultó en una mediana de 58 núcleos anotaron para cada muestra de tumor (rango: 47-60). En 50 muestras seleccionadas al azar, CEN-2 señales fueron contados en la mucosa del colon afectado para determinar la media de cuentas señales (media: 1,37, mediana: 1,38, rango: 1,20 a 1,62). Estos recuentos se utilizan para definir el rango de diploide (ver sección 2.4.1).
En el material tumoral, CEN-2 varió de 1.19 a 2.52 con una mediana de 1,70. Mediante la comparación de medias CEN-2 señales recuento de los núcleos tumorales a los núcleos no tumorales, la mayoría (97,4%) de muestras de tumor podría ser clasificado como albergar dos copias (disómicos) o tres (trisómicas) del cromosoma 2 (Tabla 2) . En las muestras de tumor,
TOP1
señales varió desde 1,33 hasta 6,72 por núcleo con una mediana de 3,17, mientras que la señales de TOP1
/CEN-2 relación
varió desde 1,01 hasta 3,39 con una mediana de 1,92 . No hay deleciones (
TOP1
/CEN-2<0.8) se observaron.
3.3.1 Determinación de
TOP1
de estado.
Para identificar muestras que albergan un
TOP1
gen aumento del número de copias, se aplicó un
TOP1
/CEN-2 relación de corte de 1,5. Como se muestra en la Fig. 3, las muestras que producen proporciones iguales o por encima de este límite se recibió el
TOP1
estado de 'ganancia', mientras que los de abajo se les llamó '
TOP1
normal'. Inicialmente, 103 pacientes (68,2%) fueron clasificados como "Ganancia" usando esta línea de corte.
La línea roja indica
TOP1
señal del gen y punto verde indica la señal centromérica. Los ejemplos se basan en los resultados de CRC línea de células en metafase - trisomía (SW620), pentasomy (Colo-205), 20q formación isocromosoma (HT-29) y 20q ganancia (KM12) guía empresas
Una vez que las muestras de tumor que alberga. una copia adicional del
TOP1
fueron identificados, los datos sobre
TOP1
/CEN-20 se utilizó para dilucidar el mecanismo de
TOP1
aumento de copias del gen. Mediante la aplicación de un
TOP1
/CEN-20 relación de corte de 2,0 para distinguir entre muestras donde
TOP1
ganancia gen se produce independientemente de la CEN-20 (
TOP1
/CEN -20≥2.0) de aquellos en los que se produce el aumento de genes debido a aneusomies o 20q formación isocromosoma (
TOP1
/CEN-20<2.0), las muestras con un
TOP1
ganancia se puede dicotomía entre su vez en amplificada y subgrupos no amplificado. Por lo tanto, las muestras de la producción de un
TOP1
/CEN-2 relación de igual o por encima de 1,5 y un
TOP1
/CEN-20 proporción superior o igual a 2,0 se denominan "
TOP1
amplificación ', mientras que para aquellos por debajo de 2,0 se les dio un "
TOP1
no amplificado por el estado de ganancia" (ver Fig. 3). Como se muestra en la Tabla 3, la mayoría (58,4%) de las muestras de tumor recibió un
TOP1
estado de ganancia no-amplificación. Todas las muestras clasificadas como
TOP1
amplificación también se encontraron producir un
TOP1
/CEN-2 relación de por encima de 2,0 (ver Tabla 3).
Para verificar el categorización de las muestras en subgrupos, significa CEN-2 y CEN-20 señales en núcleos tumorales fueron comparados con sus respectivos medios en la mucosa del colon afectado, los resultados de los que se enumeran en la Tabla 2. las muestras con una media de CEN-2 y CEN-20 en el rango diploide pertenecía en 21/34 (61,8%) casos a la
TOP1
categoría normal. Cerca-triploides y CEN-20 casos aneusomic fueron encontrados con mayor frecuencia en las muestras clasificadas como
TOP1
amplificada falta de ganancia. CEN-2 aneusomy se observó en 19 (12,6%) casos.
3.3.2 Asociación con la evolución del paciente.
La relación entre el estado de biomarcadores y la evolución del paciente fue explorado en ambos modelos univariantes y multivariantes . En esta cohorte de pacientes, hubo 112 muertes de todas las causas y 88 recurrencias incluyendo muertes específicas de cáncer dentro de cinco años [15].
TOP1
número de copias, por sí mismo, no se asoció significativamente con el sistema operativo, TTR o LR (ver Tabla 4). Mayores números de copias CEN-2 se asocian con un mejor pronóstico con sistema operativo como criterio de valoración clínica en el análisis multivariante (HR: 0,38 IC del 95%: 0,15 a 0,98; p = 0,04), mientras que sólo una tendencia se observó en el análisis univariable (HR : 0,49, véase la Tabla 4)
Inicialmente, los pacientes que albergan
TOP1
incrementos (
TOP1
ganancia, véase la figura 3) fueron comparados con aquellos sin (..
TOP1
normal). Ganancia de
TOP1
no se asoció significativamente con el sistema operativo o TTR tanto en el análisis univariante y multivariante (ver Tabla 4). Los pacientes con
TOP1
amplificaciones (
TOP1
/CEN-20≥2.0) inicialmente se compararon con los casos no amplificados (
TOP1
normal y
TOP1
subgrupos de ganancia no amplificada combinada). La amplificación de
TOP1
no se asoció significativamente con el sistema operativo o TTR, aunque enfocados importancia para TTR en el análisis multivariante (HR: 0,50; IC del 95%: 0,23 a 1,09; p = 0,08). Análisis de
TOP1
amplificaciones en relación con LR falló debido a un número muy limitado de eventos. cortes adicionales para las dos combinaciones de sonda fueron investigados y los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tras el análisis primario de los datos, las muestras fueron estratificados en subgrupos en función de la presencia y el tipo de
TOP1
aumento (véase la Fig. 3, que se enumeran en la Tabla 3). Como se muestra en la Tabla 5, se observó ninguna diferencia significativa entre el
TOP1
normal,
TOP1
la no amplificación de ganancia y
TOP1
subgrupos de amplificación con OS como punto final, tanto en el El análisis univariante y multivariante. Con TTR como criterio de valoración clínica,
TOP1
ganancias no-amplificación mostraron una tendencia hacia más corto TTR (HR: 1,57 IC del 95%: 0,97 a 2,55; p = 0,07) en el análisis univariado, y una similar, pero más débil, tendencia que se observa en el análisis multivariante (HR: 1,49).
TOP1
amplificaciones no mostró ninguna relación significativa con TTR en comparación con el
TOP1
subgrupo Línea de base normal. Una gráfica de Kaplan-Meier para estas relaciones se puede ver en la Fig. 4B
A (izquierda):. OS, B (derecha):. TTR
3.4 TOP1 Directrices de puntuación
La posibilidad de marcar un menor número de núcleos en la determinación de
TOP1
estado presenta una oportunidad para disminuir la carga de trabajo de observador. Para determinar si esto era posible, el estado de
TOP1
/CEN-2 y
TOP1
/CEN-20 se determinó usando 10 o 20 núcleos y se compara con el estado de la relación después de la inclusión de todos núcleos relevantes. Como se muestra en la Tabla 6, marcando un número reducido de núcleos, como los que sólo 10 o 20 núcleos para determinar
TOP1
/CEN-2 estado (cut-off) 1.5 muestras clasificadas con una concordancia moderada (0,76 y 0,91, respectivamente), lo que aumentó con la introducción de intervalos borderline, donde debe anotarse núcleos adicionales (ver sección 2.5.1). Para la detección de
TOP1
amplificaciones (de corte: 2,0), la concordancia fue relativamente alta (10 núcleos: 0.96, 20 núcleos: 0,99) y no se ha mejorado con el uso de intervalos borderline. Además, se investigaron alternativas puntos de corte, los resultados de los que se enumeran en la Tabla 6.
Discusión
4.1 Mecanismos de TOP1 Copia Número
aumento de este estudio, se identificaron cuatro mecanismos diferentes de
TOP1
copia aumento del número. En la línea celular que implica mecanismos de paneles
TOP1 Opiniones y CEN-20 (Colo-205, HT29 y SW620), así como un mecanismo donde
TOP1
fue ganado con independencia de CEN-20 (KM12) , fueron observados. En Colo-205 y SW620, se observó el cromosoma 20 aneusomy, de acuerdo con el Instituto Nacional del Cáncer y el cielo /M-FISH y CGH base de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/skyweb.cgi) de NCBI. Este tipo de aumento transpira debido a la missegregation de los cromosomas durante la mitosis, lo que resulta en un número anormal de cromosomas; un estado cariotípica denomina "aneuploidía".
En HT29,
TOP1
ganancia se produjo de una manera que sugiere la formación de un isocromosoma, en línea con otros resultados [20]. Este mecanismo de
TOP1
de copias de genes aumento número se produce debido a un misdivision del centrómero (rotura transversal, en lugar de longitudinal) durante la segregación de cromosomas, lo que resulta en un cromosoma con dos brazos idénticos. En KM12, un adicional de
se observó TOP1
señal en un cromosoma que no albergan una señal de CEN-20. En la base de datos del NCI y el cielo /M-FISH de NCBI y CGH, esta línea celular parece albergar un cromosoma fusión de 22q y una copia adicional de 20q, en donde CEN-20 (o al menos las secuencias satélite alfa del blanco de la CEN- 20 de la sonda) no se obtuvo junto con el resto de 20q. Este tipo de ganancia puede ser el producto del cromosoma 20 aneusomy seguido de un evento de translocación Robertsonian
.
Mientras aumento del número de copias del gen puede ocurrir debido a acontecimientos que implican regiones cromosómicas más grandes, como la ganancia de cromosomas enteros o brazos cromosómicos , también puede ocurrir debido a la amplificación del gen. La amplificación génica se ha propuesto que se produzca a través de varios mecanismos, incluyendo errores en la replicación del ADN y los ciclos de rotura-fusión-puente repetidas debido a la rotura en la doble cadena de ADN o la disfunción telomérica [21] - [23]. Una región cromosómica preferentemente obtenida a través de la amplificación se denomina un "amplicón", un fragmento de ADN de aproximadamente 0,5 a 10 Mb de longitud, y por lo general abarca de genes (s) que participan en la promoción del crecimiento del tumor [24]. Cabe señalar que el cromosoma entero o brazo cromosómico alteraciones generalmente ocurren con más frecuencia, pero en menor magnitud, que a alteraciones cromosómicas más pequeños [25].
En el presente estudio,
TOP1
amplificación génica se definió como
TOP1
/CEN-20 proporción igual o superior a 2,0. Esta definición significa que
existe TOP1
a niveles de dobles al de su cromosoma huésped. Por lo tanto, este tipo de aumento de copias del gen es probablemente debido al aumento de número de copias de un amplicón y no regiones cromosómicas brazo de longitud, ya que su mecanismo de aumento del número de copias es independiente de CEN-20. No se observaron
TOP1
amplificaciones en las nueve líneas celulares investigados, pero no se detectó en el 10% de las muestras tumorales. Esto podría sugerir que, o bien este mecanismo es específico del paciente o que este mecanismo no estaba presente en nuestro número limitado de líneas celulares investigadas. La amplificación de la
TOP1
gen también se ha informado en el melanoma [26] y el cáncer gástrico [27]
.
Si bien cada uno de los mecanismos antes mencionados de
TOP1
número de copias del gen aumento ocurrir como eventos individuales en las líneas celulares, nuestros resultados indican que pueden producirse simultáneamente en las muestras de tumor. En 4/15 (26,7%) casos de amplificación (datos no mostrados), se detectó CEN-20 aneusomy, indicativo de un mecanismo de amplificación, así como uno que implica aneusomy o isocromosoma formación. En las muestras clasificadas como
TOP1
no amplificada de ganancia, es posible que ambos 20q isocromosomas y copias adicionales del cromosoma 20 están presentes. Sin embargo, sólo es posible clasificar las muestras de acuerdo con mecanismo predominante.
4.2 Papel de 20q
ganancia del cromosoma 20 o 20q ha informado ampliamente como una anomalía cromosómica recurrente en el cáncer colorrectal [11 ], [28] - [33], el apoyo a la alta frecuencia de
TOP1
ganancias no amplificados observados en este estudio. En modelos in vitro sugieren que 20q ganancia juega un papel causal en la tumorigénesis, así como en el aumento de las tasas de proliferación celular [34]. En el cáncer colorrectal, se cree que 20q para jugar un papel en adenoma colorrectal hasta la progresión de carcinoma [10] - [13] y, a menudo se observa en los tumores que presentan el microsatélite fenotipos estables y /o la inestabilidad cromosómica [32], [35], [36 ].