Extracto
A pesar de una mejor comprensión de la patogénesis del cáncer oral, el resultado del tratamiento sigue siendo pobre. Por lo tanto, hay una necesidad de nuevas estrategias terapéuticas, para mejorar el pronóstico de esta enfermedad. la interferencia de ARN (RNAi) parece ser una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer oral. Sin embargo, un obstáculo para las terapias de ARNi mediada ha sido vectores, en particular, la retención de pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) en los endosomas y su posterior degradación en lisosomas, dando como resultado el silenciamiento de genes ineficiente. Por lo tanto, el presente estudio examinó la viabilidad del diseño y la utilización de un péptido, denominado 599, que consiste en una secuencia de influenza sintético derivado de un virus endosoma disruptiva fusogénico péptido y un tramo de nona penetrante en las células catiónico (D-arginina) residuos, para entregar siRNAs en células de cáncer de boca e inducir el silenciamiento de la diana terapéutica, CIP2A, una oncoproteína sobreexpresa en diversos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer oral. El aumento de la relación molar 599 de péptido-a-siRNA demostró una mayor capacidad de unión para las moléculas de siRNA y entrega siRNA mejorada en el citoplasma de las células de cáncer oral. De hecho, las mediciones cuantitativas de entrega siRNA en células demostraron que una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA podría entregar 18 veces mayores cantidades de siRNAs en comparación con las células tratadas con ARNsi independiente sin efectos significativos citotóxicos a largo plazo. Lo más importante, el péptido mediada entrega 599 siRNA promovido significativa mRNA CIP2A y proteína de silenciamiento que dio lugar a la disminución de la invasividad de células de cáncer oral y crecimiento independiente de anclaje. En conjunto, estos datos demuestran que un péptido quimérico que consiste de una secuencia fusogénica, en combinación con los residuos penetran en las células, se puede utilizar para suministrar eficazmente siRNAs en células de cáncer oral e inducir el silenciamiento de su gen diana, que podría ofrecer una nueva estrategia terapéutica en la lucha contra el cáncer oral
Visto:. Cantini L, Attaway CC, Butler B, Andino LM, Sokolosky ML, Jakymiw A (2013) fusogénicas-Oligoarginine péptido mediada por la entrega de siRNAs dirigidos a la CIP2A Oncogene en células de cáncer oral. PLoS ONE 8 (9): e73348. doi: 10.1371 /journal.pone.0073348
Editor: Kin-Hang Kok, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 14 de mayo de 2013; Aceptado: July 19, 2013; Publicado: 3 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Cantini et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por el NIDCR y CNRR otorga R00DE018191 (AJ) y P20RR017696, respectivamente. Este trabajo también fue financiado por la subvención del Programa de Investigación del Cáncer de la Florida Bankhead-Coley 08BN-02 (AJ). El apoyo técnico proporcionado por el Fondo para Clemson Light Imaging se hace posible por el Premio Nacional Science Foundation#1126407 y una donación del Fondo para la Universidad de Clemson Core a Terri F. Bruce. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
se estima que alrededor de 40.000 nuevos casos y aproximadamente 8.000 muertes relacionadas con el cáncer de la cavidad oral y faringe se producen anualmente en los EE.UU. en 2012 [1]. cáncer de cavidad oral está clasificado actualmente como el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo, con carcinomas de células escamosas de la mucosa oral es el tipo más común (~ 90%) [2], [3]. A pesar de enormes cantidades de investigación y los avances en los campos de la oncología y la cirugía, la tasa de supervivencia a 5 años para el cáncer oral ha mejorado modestamente en los últimos 30 años y su pronóstico sigue siendo pobre en comparación con los de mama, colon o cáncer de próstata [1] . Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias terapéuticas para mejorar el pronóstico de esta enfermedad.
ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo de regulación de genes altamente conservados post-transcripcional provocada por no codificante moléculas pequeñas, de doble cadena de ARN que puede silenciar específicamente la expresión de genes por cualquiera de traducción reprimir y /o inducir la degradación de ARNm [4], [5]. Las moléculas de ARN de doble cadena cortos, conocidos como pequeños ARN de interferencia (siRNA) son moléculas funcionales que, en asociación con el objetivo de selección de ARNm específico de secuencia de ARN inducida por silenciar complejo (RISC) mediar y división [6], [7], [8 ], [9]. El descubrimiento de que la introducción de siRNAs sintetizados químicamente en células de mamífero podría inducir eficazmente la inhibición específica de secuencia de la expresión génica [6], hace evidente el potencial terapéutico de aprovechamiento de RNAi como un medio para dirigirse específicamente y genes que causan enfermedades silencio. experimentos preclínicos posteriores en animales y ensayos clínicos más recientes han validado más siRNAs como inhibidores potentes de una variedad de genes causantes de enfermedades y como una nueva y prometedora clase de productos terapéuticos [8], [10], [11].
Aunque el diseño de siRNAs de grado terapéutico ha mejorado [8], [10], la entrega sigue siendo el mayor obstáculo hacia el uso generalizado de siRNAs para aplicaciones terapéuticas [8]. Debido a que las macromoléculas terapéuticas generalmente se entregan a través de endocitosis [12], uno de los principales pasos limitantes para muchos enfoques de entrega, incluyendo la entrega de siRNA, es atrapamiento endosomal y la consiguiente degradación de la carga terapéutica en los lisosomas [11], [12], [13] . Por lo tanto, para mejorar la biodisponibilidad intracelular de siRNAs, se necesitan estrategias eficaces para el escape endosomal.
Para transportar el genoma viral en el citoplasma, virus animales que se internalizan a través de endocitosis mediada por receptor, utilizan proteínas con endosoma disruptiva secuencias de dominio péptido de fusión para mediar la desestabilización de la membrana endosomal célula huésped [14]. El método por el cual estas proteínas virales desestabilizar membranas endosomal se produce de una manera dependiente de la acidificación-y ha sido imitado por los péptidos sintéticos, denominados péptidos de fusión [15], [16]. En particular, varios péptidos de fusión, sintéticos basados en el dominio de fusión N-terminal de la subunidad HA2 de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe han demostrado ser eficaces a influir en la transferencia de genes [15]. Entre estos péptidos de fusión, tanto el péptido INF-7 y su forma dimérica diINF-7, han demostrado su capacidad disruptiva endosoma mediante la mejora de los sistemas de transferencia de genes no virales y mejorar tanto la entrega citosólica de macromoléculas inmunoliposomas ocluida y lipofectamina mediada siRNA- inducida por el silenciamiento de genes [15], [16], [17]. Además, co-incubación de péptidos quiméricos que consisten en el péptido endosoma disruptiva HA2 fusionada a péptidos que penetran en células (CPP; vectores de péptido catiónico que puede inducir rápidamente su propia internalización celular a través de diferentes formas de endocitosis [18]), también se han demostrado para mejorar el escape endosomal de la carga acomplejado-CPP, en consecuencia, promover fuertes efectos biológicos [12], [18], [19]. En un estudio particular, se encontró co-incubación de HA2 ligada péptidos CPP con siRNAs complejados-CPP para mejorar moderadamente el silenciamiento del gen informador dirigida [20].
Aunque las estrategias descritas anteriormente han demostrado mejoras en siRNA mediada por los efectos de silenciamiento, varios problemas que aún permanecen eso podría limitar la eficacia del péptido mediada por la entrega citosólica fusogénica de siRNAs. En primer lugar, debido a que los péptidos de fusión o HA2-quimérico no estaban acomplejados con los siRNAs, este enfoque no garantiza que los péptidos serían co-localizar dentro de las mismas vesículas de endocitosis como la carga de siRNA [12]. Se requiere Co-localización con el fin de liberar moléculas de ARNsi de la vesícula endocítica [12]. En segundo lugar, debido a esta falta de interacción entre los péptidos y siRNAs, es posible que los péptidos podrían escapar de los endosomas sin perturbar seriamente las membranas endosomal, en última instancia, dejando la carga siRNA atrapado dentro de la vesícula [12]. Por lo tanto, para evitar estos problemas, este estudio tuvo como objetivo diseñar un péptido quimérico que consiste en una secuencia fusogénica vinculado a un CPP que permita estable de unión con siRNAs a través de interacciones electrostáticas y promover su entrega y endosomal intracelular de escape, con el fin de inducir el silenciamiento terapéutico de un oncogén específica en células de cáncer oral. Debido a que el péptido INF-7 es un péptido de membrana desestabilizar más potente en comparación con el péptido HA2 matriz y nona catiónico (D-arginina) péptidos son CPP altamente eficiente, capaz de absorción celular mejorada [12], [21], así como la entrega de siRNAs en los tumores y los cerebros de los ratones [22], [23], se diseñó un péptido quimérico, denominado 599, que aprovechar estas propiedades tanto dentro de una sola molécula a directamente complejo y aumentar la biodisponibilidad intracelular de siRNAs. Aquí, nos demuestran que el péptido 599 proporciona de manera efectiva siRNAs diseñado para apuntar CIP2A, una oncoproteína sobreexpresa en cabeza humana y carcinomas de cuello de células escamosas (HNSCCs), incluidos los carcinomas de células escamosas orales (OSCCs) [24], [25], [26] , en células de cáncer oral, media silenciamiento CIP2A eficiente, y por lo tanto inhibe la invasión de células de cáncer oral y el crecimiento independiente de anclaje.
resultados
El péptido 599 Efectivamente liga y entrega de siRNAs en células orales contra el cáncer
con el fin de probar si el péptido 599 a través de su nona catiónico (D-arginina) residuos podrían obligar eficazmente siRNAs con carga negativa en base a las interacciones electrostáticas, se realizó un ensayo de desplazamiento en gel de agarosa (Fig. 1). El uso de diversas cantidades del péptido 599, que van desde 1 a un exceso molar de 50 veces de siRNAs, se demostró que el péptido 599 de hecho podría unirse a moléculas de siRNA diseñados para apuntar CIP2A (siCIP2A) retardando la siCIP2A a partir de un péptido-a- molar siRNA (P: N) relación de 20:01, sin siRNAs libres detectables en el gel en 50:1. En P: N proporciones de 10:01, el péptido sólo tenía un efecto moderado sobre la unión siRNA, y al 01:01 fue completamente ineficaz
Un bromuro de etidio manchado 4% ensayo de desplazamiento en gel de agarosa examinando la capacidad de. diversas cantidades del 599 péptido (que va de 1 a 50 veces exceso molar de siRNAs) para formar complejos con siCIP2A. siCIP2A, siRNA dirigidos oncogén CIP2A; MWM, marcador de peso molecular (el número de pares de bases para cada fragmento de ADN se muestran) guía empresas
A lo que demuestra que el péptido 599 podría unirse a siRNAs en P específica:. N proporciones, el próximo examinó la capacidad del péptido a entregar siRNAs marcados con fluorescencia en las células de cáncer oral por análisis de microscopía de fluorescencia (Fig. 2A). El uso de un siRNA marcado fluorescentemente, DY547 conjugado a siCIP2A (D-siCIP2A), en complejo con cantidades crecientes de 599 péptido, que van desde 1 a un exceso molar de 50 veces de siRNAs, se observó que el aumento de la relación P: N mejorada el suministro de moléculas siRNA en CAL 27 células cancerosas orales después de dos horas de incubación. Más específicamente, la 50:1 relación P: N fue demostrado tener una mayor capacidad para inducir la captación de ARNsi en las células en comparación con el 20:01 P: N que sólo tuvo un efecto moderado. Por el contrario, las células tratadas con D-siCIP2A sola o en complejo con 599 péptido a una 01:01 relación P: N eran incapaces de captación de ARNsi eficaces. Las mediciones cuantitativas de internalizado D-CAL siCIP2A en 27 células después de 2,5 horas de incubación también corroboraron que el aumento del 599 P: N ratios de aumento de la captación de ARNsi en las células. En particular, el 50:1 y 100:1 P: N ratios de entregan aproximadamente 18 y 42 veces cantidades significativamente mayores de D-siCIP2A, respectivamente, en comparación con las células tratadas con D-siCIP2A solo (Fig 2B.). Como comparación, el agente de transfección comercial INTERFERin ™ (IFN) solamente entregado aproximadamente 2 veces mayores cantidades de D-siCIP2A, en comparación con las células tratadas con D-siCIP2A solo. Es de destacar que, aunque el 100:1 relación P: N fue capaz de entregar la mayor cantidad de siRNAs en células, se indujo efectos citotóxicos significativos a largo plazo, medidos mediante el uso de un control no siRNA dirigidos (sint) (Figura 2C). . En particular, el 100:1 relación P: N redujo significativamente la proliferación de las células 48 horas post-tratamiento en comparación con las células no tratadas. Por el contrario, la 50:1 relación P: N no tuvo efectos significativos sobre la citotoxicidad a largo plazo. Como resultado, en base a estos resultados el 50:1 P:. Se usa una relación N para una caracterización adicional y la experimentación
(A) Microscopía de fluorescencia análisis de CAL 27 células de cáncer oral se incubaron durante 2 horas con DY547 conjugado siRNA dirigidos CIP2A (D-siCIP2A; rojo) sola o en complejo con cantidades crecientes de péptido 599 (que va de 1 a un exceso molar de 50 veces de siRNAs). Los núcleos (azul) se counterstained con DAPI. Barra de escala: 50 micras. (B) CAL 27 células se incubaron durante 2,5 horas con D-siCIP2A sola o en complejo con cantidades crecientes de péptido 599 (que va de 1 a un exceso molar de 100 veces de siRNAs). Para la comparación, las células también fueron transfectadas usando el reactivo de transfección comercial, INTERFERin ™ (IFN). La cantidad de siRNA entregado en células en pmol por mg de proteína se informó con cada tratamiento normalizado a D-siCIP2A solo. Los datos son la media ± SEM de cuatro experimentos separados, donde *** P & lt; 0,001, ** P & lt; 0,01 en comparación con D-siCIP2A células tratadas solo (ANOVA, prueba de comparación múltiple de Dunnett). (C) Evaluación de la toxicidad a largo plazo (tal como se mide por un ensayo de proliferación celular) de CAL 27 células 48 horas post-tratamiento, ya sea con un siRNA no director (sint) por sí sola, el aumento de concentraciones de 599 péptido solo, o cantidades crecientes de 599 péptido (que va de 1 a 100 veces exceso molar de siRNAs) en complejo con Sint. Para la comparación, las células también fueron transfectadas con el reactivo de transfección comercial, IFN. Las células no tratadas se define como 100% viable. Los datos son la media ± SEM realizó por triplicado (n = 3), donde *** P & lt; 0,001, ** P & lt;. 0.01 en comparación con las células no tratadas (ANOVA, prueba de comparación múltiple de Dunnett)
Caracterización del complejo péptido 599-siRNA
Para obtener información sobre el mecanismo de entrada en la célula de la 599 /siRNA complejo, la localización subcelular del complejo 599 /D-siCIP2A se examinó en células vivas mediante microscopía de fluorescencia acoplado con imágenes de contraste de fase (Fig. 3A). Tras una inspección más cercana de la internalizado D-siCIP2As, parecía basa en el extenso patrón de captación punteada de siRNAs que el complejo 599 /D-siCIP2A estaba siendo endocitosis. Co-tinción de las células fijadas con el EEA1 marcador endosomal temprano, confirmó la colocalización de D-siCIP2As con vesículas endosomal (Fig. 3B), lo que indica un modo de internalización endocítica.
(A) Microscopía de fluorescencia y análisis de superposición de una imagen de contraste de fase de CAL 27 células vivas de cáncer oral se incubaron durante 2 horas con siRNA DY547 conjugado de orientación CIP2A (D-siCIP2A; rojo) complejados con el péptido 599 a una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA. Barra de escala: 50 micras. (B) Análisis indirecto microscopía de inmunofluorescencia de células de cáncer de CAL 27 orales se incubaron durante 2 horas con D-siCIP2A (rojo) complejados con el péptido 599 a una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA. Endosomas (verde) se tiñeron utilizando un anticuerpo monoclonal anti-anticuerpo de conejo EEA1. Los núcleos (azul) se counterstained con DAPI. La co-localización de D-siCIP2A con endosomas (amarillo) se observa en el panel fusionada y se destaca por las flechas. Barra de escala: 25 micras
Para evaluar el péptido 599 en términos de tamaño de partícula y la carga de la superficie después de la formación de complejos con siCIP2A tanto la dispersión de luz dinámica y las mediciones de potencial zeta se realizaron. (Fig. 4A). Sobre la base de las mediciones, el 96% de las partículas formadas se centra en 74 nm y un 4% a 220 nm por la distribución del tamaño ponderado por el número, el tamaño medio de partícula de la población mayor de ser 80 ± 0,5 nm. El potencial zeta del complejo 599 /siCIP2A se determinó que era positivo con un valor de 32,5 ± 0,5 mV. El complejo 599 /siCIP2A también se visualizó usando iluminación óptica basada en campo oscuro (Fig. 4B). El uso de esta tecnología de imagen se encuentra el complejo 599 /siCIP2A exhibir estructuras esféricas bastante uniformes
.
(A) Distribución de tamaño y el potencial zeta del péptido 599 acomplejado con siCIP2A en un molar 50:1 péptido-a-siRNA relación de 20 minutos después de la formulación en el agua. Imagen de microscopía óptica del péptido complejado con 599 siCIP2A en una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA 20 minutos después de la formulación en agua (B) de campo oscuro de base. Barra de escala:. 10.000 nm
Para probar la importancia de los dos componentes principales (es decir, las porciones de residuos endosoma-perturbadores y nona penetrante en las células catiónico (D-arginina)) para conferir la capacidad de la 599 péptido para entregar siRNAs en las células, dos péptidos adicionales se sintetizaron que consiste en ya sea la secuencia de endosoma disruptiva (616) o la nona catiónico penetrante en las células (D-arginina) residuos solos (9R). Tras el tratamiento de CAL 27 células con cualquiera de los 599, 616, o 9R péptidos en complejo con D-siCIP2A en un 50:1 relación P: N, microscopía de fluorescencia análisis revelaron que sólo el péptido intacto 599 tanto con el endosoma disruptiva y catiónicos células de penetración nona (D-arginina) porciones de residuos podrían mediar en la entrega de siRNAs en células, mientras que tanto los 616 y 9R péptidos no tuvieron ningún efecto aparente sobre la entrega de siRNA 2 horas después del tratamiento (Fig. 5).
microscopía de fluorescencia análisis de CAL 27 células de cáncer oral se incubaron durante 2 horas con siRNA DY547 conjugado de orientación CIP2A (D-siCIP2A; rojo) complejado a péptidos 599, 616, y 9R en una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA. Los núcleos (azul) se counterstained con DAPI. Barra de escala: 50 micras
El hecho de que el péptido 616 para entregar siRNAs en células era más probable debido a su incapacidad para unirse siRNAs incluso a P:. N proporciones tan altas como 100:1 (datos no mostrada). Sin embargo, el resultado con el péptido 9R fue algo sorprendente, ya que se demostró para unirse eficazmente siRNAs en un 50:1 relación P: N sobre la base de un ensayo de desplazamiento en gel de agarosa (Fig. S1A) y podría formar partículas con un tamaño medio de 58,2 ± 0,2 nm y un valor potencial zeta de 25,8 ± 0,5 mV (Fig. S1B). Debido a la fijación de paraformaldehído al de las células puede dar lugar a la redistribución de artefactos (Arg)
9 péptidos [27], que era posible que la distribución celular del complejo 9R /D-siCIP2A puede haber sido afectados por este fijador químico. Por lo tanto, la absorción de D-siCIP2A también se evaluó mediante el enfoque cuantitativo de fijación independiente de la que se encontró de manera similar que el péptido 9R, que van desde 0,1 a un exceso molar de 100 veces de siRNAs, era incapaz de mediar la entrega siRNA en las células y era indistinguible de células tratadas con D-siCIP2A sola (Fig. S1C).
el péptido 599 media la CIP2A silenciamiento de genes en células de cáncer oral
para el péptido 599 que se considera un vehículo de administración eficaz para siRNA- basada en la terapéutica, debe ser capaz de entregar siRNAs funcionales en células capaces de silenciar su objetivo gen deseado. Para evaluar la funcionalidad de los /siRNA complejo, dos líneas celulares de cáncer orales 599, CAL 27 y SCC-25, se trataron con el péptido 599 complejado con cualquiera siCIP2A o un control de Sint a una 50:1 relación P: N, después de lo cual tanto en el mRNA y los niveles de proteína CIP2A se evaluaron 48 horas después del tratamiento por PCR en tiempo real y análisis de Western blot, respectivamente. La cuantificación por PCR en tiempo real demostró una caída significativa en los niveles de ARNm CIP2A en ambas líneas celulares de cáncer orales tratadas con el 599 /siCIP2A complejo en comparación con el control de 599 células (Fig. 6A) /Sint tratados. Más específicamente, se observó un ~ 60% y ~ 85% de reducción en los niveles de mRNA en CIP2A CAL 27 y SCC-25 líneas celulares de cáncer orales, respectivamente. Además, análisis de Western blot confirmó la capacidad del péptido 599 para mediar la entrega de siRNAs funcionales en ambas líneas celulares mediante la demostración de la supresión de los niveles de proteína CIP2A 48 horas post-tratamiento con el 599 /siCIP2A complejo comparación con el control 599 /células Sint tratados ( la Fig. 6B). Es de destacar, también se evaluaron los niveles de proteína de la oncogénico factor de transcripción c-Myc porque CIP2A es conocido para regular la estabilidad de esta proteína [25]. Los análisis de Western blot confirmó que el silenciamiento de CIP2A causó la desestabilización de c-Myc en ambas líneas celulares (Fig. 6B)
.
(A) Análisis de PCR en tiempo real de los niveles de mRNA en CIP2A CAL 27 y SCC-25 por vía oral células de cáncer de 48 horas después del tratamiento con 599 péptido complejado a una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA a 100 nM de siRNA dirigidos CIP2A (siCIP2A) en comparación con el control no director siRNA (sint). Los niveles de ARNm de CIP2A se normalizaron a 18S rRNA. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos independientes realizados por triplicado, en donde ** P & lt; 0,01 en comparación con las células tratadas sint (prueba t de Student). (B) análisis de transferencia Western de CIP2A y c-Myc los niveles de expresión de proteínas en CAL 27 y 25 de SCC células de cáncer oral 48 horas después del tratamiento con 599 péptido complejado a cualquiera de 100 nM de SINT o siCIP2A a una 50:1 péptido-to -siRNA relación molar. los niveles de proteína GAPDH fueron monitoreados para asegurar la igualdad de carga de muestras.
Caracterización de los 599 /siCIP2A RNAi mediada por complejos de respuesta
En un esfuerzo por caracterizar mejor 599 silenciamiento péptido mediada también se evaluaron CIP2A en células de cáncer orales la duración del silenciamiento de genes, el silenciamiento de genes dependiente de la dosis, y la actividad de silenciar en el suero. La implementación exitosa de RNAi como una forma de terapia depende de estas tres características clave. Por lo tanto, en un esfuerzo para determinar la persistencia de 599 silenciamiento péptido mediada de CIP2A en células de cáncer orales en el tiempo, los análisis de una transferencia Western de CIP2A los niveles de expresión de proteínas en CAL 27 y 25 de SCC células de cáncer oral 1, 3, 5, 7 , se llevaron a cabo y 9 días después del tratamiento con 599 péptido complejado con cualquiera SINT o siCIP2A en una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA (Fig. 7A). Después de un solo tratamiento con 599 /siCIP2A, se observó el efecto de silenciamiento para durar durante 5 días en el CAL-27 células y hasta 9 días en SCC-25 celdas con la máxima silenciamiento ocurre durante 3 y 7 días, respectivamente. En experimentos de dosis-respuesta en SCC 25 células (Fig. 7B), se observó que el péptido 599 para conferir siCIP2A mediada por silenciamiento dependiente de la dosis con concentraciones de siRNA = 50 nM conferir ~ 100% de proteína CIP2A desmontables y las concentraciones de siRNA tan bajo como 20 nM dejar de tener efectos medibles de silenciamiento. Se observaron resultados similares en células CAL 27 (datos no mostrados), excepto que las concentraciones de siRNA más altas (≥80 nM) fueron necesarias para conferir en el mejor de ~ 90% silenciamiento proteína CIP2A. Por último, debido a que la estabilidad de siRNAs es una preocupación importante en RNAi-terapia, 599 péptido mediada por silenciamiento CIP2A se evaluó en ausencia y en presencia de suero y se comparó con varios reactivos catiónicos estándar disponibles en el comercio a base de lípidos de transfección (Fig. 7C). Tras el tratamiento de SCC-25 células con 599 /siCIP2A, ~ 95% de proteína CIP2A fue derribado en la ausencia de una entrada inicial de suero y fue comparable al silenciamiento CIP2A observado para todos los reactivos de transfección basados en lípidos catiónicos a prueba (& gt; 99%) excepto HiPerFect® que exhibieron sólo una reducción ~ 30% en los niveles de proteína. De importancia, sin embargo, es que incluso en presencia de suero, el complejo 599 /CIP2A todavía podría producir una respuesta muy eficaz RNAi en ~ 70% desmontables proteína CIP2A. La cuantificación de estos datos se basaron en el análisis densitométrico de tres experimentos independientes Western blot utilizando el software Image J [28]
.
(A) Western blot análisis de CIP2A los niveles de expresión de proteínas en CAL 27 y SCC-25 por vía oral las células cancerosas 1, 3, 5, 7 y 9 días después del tratamiento con el péptido 599 acomplejado con cualquiera de 100 nM de control no siRNA dirigidos (sint) o siRNA dirigidos CIP2A (siCIP2A) a una 50:1 péptido-a-siRNA relación molar. los niveles de proteína GAPDH fueron monitoreados para asegurar la igualdad de carga de muestras. (B) Análisis de transferencia Western de CIP2A knockdown proteína en-25 SCC células de cáncer oral 48 horas después del tratamiento con 599 péptido solo (5 mM) o formando complejo en una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA a cualquiera sint (100 nM ) o concentraciones decrecientes de siCIP2A. Los niveles de proteína CIP2A en las células no tratadas también se analizaron para la comparación. los niveles de proteína GAPDH fueron monitoreados para asegurar la igualdad de carga de muestras. (C) análisis de transferencia Western de la proteína CIP2A caída en SCC 25 células de cáncer oral 48 horas después del tratamiento con 599 péptido complejados a cualquiera de 100 nM de SINT o siCIP2A en una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA, en presencia (+) o ausencia (-) de suero, en comparación con las células no tratadas o células tratadas con reactivos de transfección comerciales Lipofectamine® RNAiMAX (RNAiMAX), Lipofectamine® 2000 (LF2000), INTERFERin ™ (IFN), y HiPerFect®. los niveles de proteína GAPDH fueron monitoreados para asegurar la igualdad de carga de muestras.
El péptido 599 mediada por silenciamiento de CIP2A Disminuye oral invasividad de las células cancerosas y el crecimiento independiente de anclaje
literatura publicada previamente ha demostrado que el silenciamiento CIP2A en células de cáncer derivadas de diferentes tejidos, como HNSCCs, carcinomas de células renales, y cáncer de mama puede tener efectos sobre la invasión de células de cáncer y el crecimiento independiente de anclaje [25], [29], [30]. Por lo tanto, para demostrar adicionalmente la utilidad potencial del péptido 599 en la terapéutica a base de siRNA para el cáncer oral, hemos probado si 599 silenciamiento péptido mediada de CIP2A podría afectar a la capacidad de invasión y las propiedades de crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer oral. Debido al hecho de que las células CAL 27 exhibieron sólo un breve efecto de silenciamiento y no crecen bien en medio semisólido [31], los efectos CIP2A 599 silenciamiento de péptidos mediado en la invasión de células y el crecimiento independiente de anclaje sólo fueron probados en SCC- 25 células. Tras el tratamiento de SCC-25 células con el péptido 599 complejado con siCIP2A, se observó una inhibición de ~ 33% significativa en invasividad de las células, en comparación con el control de 599 células (Fig. 8A) /Sint tratados. Por otra parte, 599 silenciamiento de CIP2A péptido mediada por células SCC-25 redujo significativamente el crecimiento independiente de anclaje por ~39% respecto al control 599 /Sint células tratadas (Fig. 8B). En conjunto, estos resultados demostraron la capacidad del péptido 599 para funcionar como un vehículo de administración eficaz para la terapéutica del cáncer orales a base de siRNA.
(A) Cuantificación del porcentaje de invasión de 25 SCC-células cancerosas orales después del tratamiento con 599 péptido formando complejo en una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA a 100 nM de siRNA dirigidos CIP2A (siCIP2A) en comparación con el control no director siRNA (sint). Los datos son la media ± SEM de cuatro experimentos separados, donde * P & lt; 0,05 en comparación con las células tratadas sint (prueba t de Student). (B) el crecimiento independiente del anclaje de SCC-25 células de cáncer oral después del tratamiento con 599 péptido formando complejo en una relación molar 50:1 péptido-a-siRNA a 100 nM de siCIP2A comparación con Sint control. Los datos son la media ± SEM de cuatro experimentos separados, donde * P & lt;. 0,05 en comparación con las células tratadas sint (prueba t de Student) guía empresas
Discusión
Para las tecnologías basadas en el ARNi para ser eficaz terapias, que requieren el suministro intracelular eficiente de siRNAs terapéuticos en el citoplasma de las células. Sin embargo, porque la mayoría de entrega se acerca siRNA de carga de tráfico en las células a través de endocitosis, el atrapamiento de estas moléculas dentro de las vesículas de endocitosis se ha convertido en un importante paso limitante [11], [12] y por lo tanto una barrera hacia el uso eficaz de las terapias basadas en RNAi. Para sortear este problema, se ha diseñado y probado un péptido, denominado 599, que consistía en parte las secuencias tanto de un CPP altamente eficiente y el péptido INF-7 endosoma-desestabilizar que cuando se combina permita la entrega eficaz de la carga siRNA complejado en las células. Los resultados de nuestro estudio demuestran que el péptido 599 podría aumentar la biodisponibilidad intracelular de siRNAs en células de cáncer oral y mediar eficazmente el silenciamiento de la oncoproteína CIP2A apuntado con la consiguiente inhibición de la invasión de células de cáncer oral y el crecimiento independiente de anclaje.
Debido a la conjugación covalente de siRNAs a CPP puede dar lugar a la entrega ineficiente de los siRNAs funcionales a las células [18], [32], [33], el péptido 599 fue diseñado para incluir nona catiónico (D-arginina) residuos que funcionarían no sólo como el componente de CPP, sino que también permiten unión no covalente de moléculas de siRNA con carga negativa al péptido a través de interacciones cargadas. ensayos de desplazamiento en gel de agarosa confirmó que el péptido 599 podría complejo a moléculas de ARNsi y que la unión entre el péptido 599 y siRNAs que parecía ser dependiente de la nona (D-arginina) residuos. Esto fue particularmente evidente en base al hecho de que el péptido 616, que comprendía solamente la secuencia del péptido INF-7 altamente aniónicos, no pudo enlazarse siRNAs
.
investigación sobre si la formación del complejo péptido-599 siRNA era suficiente para inducir la internalización de los siRNAs en las células, reveló que el aumento de la P: N coeficientes se traduciría en un aumento de la captación de ARNsi en las células después del tratamiento dos horas en comparación con las células tratadas con INTERFERin ™ o siRNA desnudo. Estos resultados fueron consistentes con otros estudios que de igual forma se encontró que el aumento de las concentraciones de CPP específicos aumentó su capacidad de captación de ARNsi [20], [23]. El aumento de la captación de ARNsi en las células más probable se produjo en mayor P: N proporciones basa en varios factores. En primer lugar, debido a que la mayor P: N relaciones fueron más eficaces en la unión siRNAs libres en solución, como fue evidente a través de los ensayos de desplazamiento en gel de agarosa, esto en parte habría contribuido a una mayor cantidad de siRNAs internalizarse en las células. En segundo lugar, porque el tratamiento de las células con altas concentraciones extracelulares de CPP se ha informado de inducir su internalización en las células a través de la activación de la endocitosis [34], el aumento de la captación de ARNsi en las células con mayor P: N proporciones pueden también se han atribuido a la presencia de cantidades más altas de péptido 599 que daría lugar a más eficazmente la endocitosis del complejo.
internalización mediada por CPP
en células es accionado por los residuos catiónicos se encuentran dentro de su secuencia y este proceso se ha informado que ocurrir a través de diversas formas de endocitosis [18]. En nuestro estudio, se observó que el péptido 599 para mediar la internalización de los siRNAs dentro de las dos primeras horas a vesículas endocítica y la eliminación de la nona (D-argininas) del péptido 599, como se representa por el péptido 616, confirmó el requisito de catiónico residuos para la entrega de siRNA de carga. Sorprendentemente, el péptido 9R que consistía sólo en nona catiónico (D-arginina) residuos fue igualmente incapaz de entregar siRNAs en las células, a pesar de que podría formar complejos con siRNAs.