Extracto
La mesotelina (
MSLN
) gen codifica una 71 kilodalton (kDa) de la proteína precursora que es procesada en el factor de potenciación megacariocítica (MPF), una proteína kDa 31 que se secreta a partir de la célula, y la mesotelina madura (mMSLN), una kDa proteína de superficie celular 40. El mMSLN se une a CA125, una interacción que ha sido implicado en la propagación intra-cavitaria de mesotelioma y cáncer de ovario. Para definir mejor el papel del MPF y mMSLN, el crecimiento del cáncer de pulmón A549 línea celular se evaluó en ratones inmunodeficientes con la inactivación del gen
Msln
. Hemos observado que
Msln CD - /- ratones con tumores xenoinjertados A549 intraperitoneal sobreviven significativamente larga de
Msln + /+
ratones portadores de tumores. Cuando portadores de tumores
Msln CD - /-
ratones
se complementan con MPF recombinante (y en menor medida mMSLN), la mayor parte de esta ventaja en la supervivencia se ha perdido. Estos estudios demuestran que el MPF y mMSLN tener un papel importante en el crecimiento de células de cáncer de pulmón
en
in vivo
y aumentar la posibilidad de que la inactivación del MPF puede ser un tratamiento útil para el pulmón y otros MSLN cánceres que expresan
Visto:. Zhang J, Bera conocimientos tradicionales, Liu W, X Du, Alewine C, Hassan R, et al. (2014) Megacariocítica potenciador Factor y mesotelina madura estimular el crecimiento de una línea celular de cáncer de pulmón en la cavidad peritoneal de ratones. PLoS ONE 9 (8): e104388. doi: 10.1371 /journal.pone.0104388
Editor: S. Prasad Adusumilli, el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2014; Aceptado: 12 de julio de 2014; Publicado: 13 Agosto, 2014
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Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mesotelina
(MSLN)
gen codifica un antígeno tumoral linaje restringido que se expresa en las células mesoteliales normales que revisten la pleura, peritoneo y pericardio. También es altamente expresado en los mesoteliomas epitheliod, que se derivan de las células mesoteliales normales, y de manera aberrante en muchos otros tipos de cáncer, incluyendo ovario, de páncreas, de pulmón, de estómago, colangiocarcinoma y cáncer de mama triple negativo [1] - [4]. El
MSLN
gen codifica una proteína precursora de 71 kDa que se procesa en dos proteínas maduras: Megacariocítica de potenciación del factor (MPF) y madurar MSLN (mMSLN). MPF es una kDa glicoproteína 31 que se secreta de la célula en la sangre. El mMSLN es una proteína de la glicoproteína 40 kDa que permanece unido a la membrana celular por fosfatidil inositol [5], [6], pero cobertizos de la superficie celular con el tiempo a través de la acción de TNF-α la enzima de conversión (Fig. 1) [7 ]. El mMSLN se ha demostrado que se une a MUC16 (CA125); esta interacción ha sido implicada en la propagación intra-cavitaria de mesotelioma y cáncer de ovario [8]. Los estudios de
Msln
gen knock out (- /-) ratones indican que el gen no es esencial para el desarrollo normal y la reproducción, pero varios estudios recientes han planteado la posibilidad de que
MSLN
podría regular el cáncer el crecimiento celular [9] - [12]. En ratas Eker, el desarrollo de carcinoma renal inducida por la esclerosis tuberosa-2 se redujo significativamente en la ausencia de un homólogo de la
MSLN
de genes [13], [14]. En las células de cáncer de páncreas, más de expresión de
MSLN
ha sido implicado en la mejora significativa del crecimiento de células tumorales y la migración
In
in vitro
[11]. Recientemente, el nivel de expresión de proteína MSLN se correlaciona con la agresividad del tumor, así como disminución de la supervivencia global de los pacientes con estadio temprano de adenocarcinoma de pulmón [15], pero el mecanismo molecular que contribuye a estos fenotipos no se conocen bien. CA125, un antígeno de cáncer de ovario asociado a la membrana, se ha informado de interactuar con MSLN, y se ha sugerido que esta interacción puede facilitar la metástasis del cáncer de ovario. Aunque la unión de MSLN células que expresan a CA125 se ha demostrado en cultivo celular [8], [16], no hay experimentos con animales que muestran que esta interacción es importante en ratones portadores de tumores.
GPI, glicosilfosfatidilinositol.
Hemos generado ratones desnudos atímicos en el que el
se inactiva Msln
gen, la prevención de la producción de la proteína mMsln y alimentador multiuso. Estos ratones se reproducen normalmente y no se han observado anormalidades en su crecimiento u otras propiedades. Debido a que estos ratones no hacer Mpf y no tienen Msln en las células que recubren la cavidad peritoneal, los hemos utilizado para investigar si la ausencia de Msln afecta el crecimiento de las células de cáncer de pulmón inoculados dentro de la cavidad peritoneal de estos ratones.
Materiales y Métodos
Líneas celulares e inmunohistoquímica
La línea celular A549 de cáncer de pulmón se obtuvo del Dr. Hisataka Kobayashi (Instituto Nacional del cáncer, NIH, Bethesda, EE.UU.) y su identidad fue confirmado por las huellas de ADN utilizando Breve ensayo de repeticiones en tándem. La línea celular A431 de carcinoma epidermoide humano se adquirió de ATCC (Mananasas, VA) y se mantuvo en el laboratorio como se recomienda. La tinción inmunohistoquímica para MSLN y CA125 se realizó por Histoserv, Inc. (Germantown, MD) usando el ratón anti-MSLN 5B2 (Novocastra Reactivos de Leica Bioystems, Buffalo Grove, IL) tal como se describe anteriormente [17], y el ratón anti-CA125 OC125 (Zymed laboratorios) en la dilución 1:50.
experimentos con Animales
las propuestas de estudio Animal (LMB-053 y LMB-014) fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales de los NIH. Todos los experimentos con animales, incluido el tratamiento y el sacrificio se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de los NIH. ratones desnudos atímicos (NCr-nu /nu) y Nude /
Msln
- /- ratones obtenidos de NCI-Frederick se alojaron en jaulas micro-aislador en todo el curso del experimento. Todos los ratones utilizados en los experimentos eran hembras, peso (15-20 g) y la edad (7-10 semanas) emparejado. Todas las inyecciones fueron intraperitoneal (IP) a menos que se indique lo contrario. A549 y A431 IP xenoinjertos se establecieron mediante la inoculación de 2 × 10
6 células en 200 l de suspensión de células en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para el modelo subcutáneo, se inyectaron 2 x 10
células A549 6 en el muslo derecho. Todos los tratamientos de proteínas recombinantes se realizaron mediante inyección IP de proteínas estudio 25 g en 200 l de PBS, tres veces por semana durante un total de tres semanas. Para los estudios de supervivencia, los ratones se controlaron diariamente y se sacrificaron por CO
2 inhalación encontrarse moribundos
Generación de
Msln CD -. /- Ratones desnudos atímicos
Varón
Msln
ratones nulos en C57 /Bl6 antecedentes genéticos (
Msln CD - /-) [9] se utilizaron para cruzar con una copia /c hembras de tipo salvaje ratones BALB (WT) ratones y camadas fueron seleccionados para la
Msln
alelo heterocigóticos. los ratones heterocigotos varones de cada generación se utilizaron para respaldar cruz con hembras WT BALB /c y el cruce hacia atrás se llevó a cabo durante más de diez generaciones. Los machos heterocigotos para
Msln
en ratones BALB /c antecedentes genéticos se cruzaron con Fox (N) hembras atímicos desnudos para generar Fox N /nulos
Msln
- /- ratones. Desde Fox N nula /
Msln CD - /- ratones hembra no son buenos criadores, que utilizamos
Msln CD - /- hembras /Fox N Het como los animales reproductores de Fox N nula /
Msln CD - /- machos para mantener y generar Fox N nula /
Msln CD - /-. hembras para nuestros experimentos
Generación del MPF-conejo (r) Fc, mMSLN- rFc y CD22-RFC proteínas de fusión en células de mamífero
Para generar versiones recombinantes de mMSLN y MPF, mMSLN-rFc y MPF-rFc se expresaron como proteínas de fusión con IgG de conejo (RFC) en células HEK293T y se purificó como anteriormente se describe [18]. proteína de fusión CD22-RFC se prepara para su uso como control.
se cosecharon Citometría de Flujo
Las células, se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS frío en hielo (PBS con FBS al 5% y 0,1 % de azida de sodio), después se incubó con el anticuerpo anti-mesotelina, MN (Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA) o Morab-009 (Morphotek Inc, Exton, PA) o anti-MUC16 anticuerpo, OC125 (Abcam, Cambridge, MA) a una concentración de 5 mg /ml. anticuerpo de isótopos de concordancia se utilizó como control. La unión de los anticuerpos primarios a las células tumorales se detectó mediante el uso de cualquiera de cabra anti-ratón conjugado con R-ficoeritrina (R-PE) (Invitrogen) o con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con FITC (Biosource). La fluorescencia asociada a las células vivas se determinó utilizando un FACS Calibur (BD Biosicences). Las medias geométricas se expresaron como intensidad media de fluorescencia (MFI). El MFI de las células se compara con el MFI de una curva patrón de perlas de R-PE-conjugados de calibración (kit de cuantificación BD QuantiBRITETM PE, BD Biosciences) y el número de sitios mMSLN se estimó por célula. Los resultados fueron similares con MN (n = 2 experimentos) o Morab-009 (n = 3 experimentos).
MPF Cuantificación
células A549 transfectadas de forma estable ya sea con el control de vectores (A549 /pcDNA) o vector de expresión MPF (A549 /MPF) se sembraron en placas que contienen la misma cantidad de medio completo y se incubaron durante 48 horas. población total de células se contó usando un contador de células Cellometer Vision (Nexcelom, St. Lawrence, MA) Una alícuota volúmenes iguales de medio acondicionado se retiró de cada plato y la concentración de MPF en la solución se cuantificó usando un MPF inmunoenzimático humana patentada kit de ensayo (Morphotek, Easton, PA).
Soft agar ensayo
A549 /pcDNA o A549 /MPF transfectantes estables se suspendieron en 0,35% de agar, se sembraron en placas de 6 pocillos (2 x 10
3 células /pocillo) y se incubaron durante 15-21 días a 37 ° C. Después de Crystal Violet tinción de las placas se lavaron durante 1 hora después explorado para producir imágenes digitales. Se contaron las colonias dentro de un campo cuadrado pre-especificada, colocado en posición central, con una longitud de lado igual a un tercio del diámetro del pozo. pozos múltiples (n) se contaron para cada uno de tres experimentos independientes. El número medio de colonias para cada experimento se informó con una desviación estándar (SD). células KB se utilizaron como control positivo para la formación de colonias.
Análisis estadístico
Para los estudios de supervivencia, las curvas de Kaplan-Meier se representaron gráficamente y se compararon mediante la prueba de log-rank. Se utilizó una prueba de Mann-Whitney para la comparación estadística de los datos de supervivencia. P & lt; 0,05 se usó como el umbral para la significación estadística. Todo el análisis estadístico se realizó mediante Prism (versión 5) para Mac (GraphPad software).
Resultados
Los estudios anteriores han demostrado que mMSLN interactúa con el antígeno tumoral CA125 cáncer de ovario y que esta interacción puede ser importante en la diseminación metastásica de cáncer de ovario a través de la cavidad peritoneal [8], [16], [19]. Para evaluar el impacto de MSLN en el crecimiento de las células cancerosas IP humanos, hemos creado Fox N /nulos
Msln
- /- ratones. Para asegurar que el
Msln
gen se inactiva y que los ratones no hizo que Msln En primer lugar confirmó la deleción utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para la detección de los alelos eliminados de los
Msln
genes (datos no mostrado). La falta de expresión de la proteína mMsln se confirmó por análisis inmunohistoquímico de tejidos de ratón usando anticuerpo policlonal de conejo anti-Msln seguido por detección de color como se describe anteriormente [9] (Fig. 2). La inmunosupresión provocada por la eliminación FoxN permite experimento xenoinjerto con células tumorales humanas. Se utilizó la línea celular A549 de cáncer de pulmón, que tiene muy baja expresión de MSLN (promedio de 3,5 × 10
3 mMSLN sitios de unión /célula), pero la expresión robusta de CA125 (Fig. 3). Hemos inyectado dos millones de células A549 en la cavidad peritoneal de
Msln CD - /- y
Msln + /+
ratones desnudos, se controlará la supervivencia de los animales. Como se muestra en la figura 4A, no hubo una diferencia estadísticamente significativa en la supervivencia entre los dos grupos de ratones. La mediana de supervivencia de
Msln + /+ ratones
fue de 31 días, pero aumentó a 46 días en
Msln CD - /- ratones (p & lt; 0,0001). Casi el 25% de la
Msln CD - /- ratones sobrevivieron más de cuatro meses (Tabla 1), mientras que todos los
Msln + /+
ratones murieron dentro de los 50 días (Fig. 4A). No hay ventaja en la supervivencia similar se observó cuando las células de cáncer epidermoide A431 (Fig. 4B), que expresan ni MSLN ni CA125, se inocularon por vía intraperitoneal. El crecimiento del tumor también se evaluó cuando se inocularon por vía subcutánea las células de cáncer de pulmón A549. En este modelo, los tumores en
Msln CD -
/CD - y en
Msln + /+ ratones
creció a la misma velocidad (Fig. 4C), lo que demuestra que
Msln
expresión no tiene efecto sobre el crecimiento del tumor dentro de este compartimiento.
Una parte de los tejidos del pulmón fueron fijadas en paraformaldehído al 4% se embebieron en parafina y se seccionó 5-6 micras de grosor, a continuación se tiñe para MSLN. A-C: El tejido pulmonar forma
FoxN nula /Msln gratis (+ /+) teñidas con anti-anticuerpo Msln (A: 100X; B: ampliación de 200X); o anticuerpo secundario solamente (C: 100X aumentos) como control negativo. D-F: El tejido pulmonar forma
FoxN nula /Msln gratis (- /-) teñidas con anti-anticuerpo Msln (D: 100X; E: una ampliación de 200X); o solamente anticuerpo secundario (F: 100X aumentos) como control negativo. A medida que se detectó la expresión de mesotelina fuerte esperada en el revestimiento de células mesoteliales del pulmón de
FoxN nula /Msln
ratones (+ /+), pero ninguna expresión en el pulmón de
FoxN nula /Msln gratis (- /-.) ratones
las células se incubaron con los anticuerpos indicados primarios o anticuerpos de control de isótopos, y el anticuerpo secundario apropiado (de cabra anti-IgG de ratón, R-PE o de cabra anti-ratón, FITC). Los resultados se muestran como gráficos de histograma para la unión de anticuerpo primario (trazo negro) o control de isotipo (traza gris). Las células A431 son negativos tanto para MSLN y CA125. Las células A549 muestran una baja expresión de mesotelina (3,5 × 10
3 sitios /célula), pero CA125 altamente expresa
(A) Solar que muestra la supervivencia de los ratones después de recibir la inyección IP de las células A549.; la mediana de supervivencia de los
Msln CD - /- ratones es de 46 días y de
Msln (+ /+)
ratones es de 31 días (
p Hotel & lt; 0,0001). (B) gráfico que muestra la supervivencia de
Msln gratis (-
/CD -) o
Msln gratis (+ /+) ratones después de la inyección de las células A431 IP. (C) gráfico que muestra la supervivencia de
Msln gratis (-
/CD -) o
Msln (+ /+)
los ratones después de la inyección subcutánea de células A549 (D) La supervivencia de A549 xenoinjerto teniendo
Msln gratis (- /-). ratones después de recibir proteínas MPF-RFC o mMSLN-RFC-CD22 o RFC
En el modelo intraperitoneal, los abdómenes A549 de ratones portadores de tumores se hincharon justo antes de la muerte. En la necropsia, las masas tumorales fueron creciendo en la pared peritoneal, en el epiplón, y en el intestino grueso y delgado. IHC demuestra que estos tumores A549 no hacen MSLN detectable (Fig. 5A), pero no hacen CA125 (Fig. 5B). Estos resultados indican que MPF, mMSLN o ambos pueden aumentar la agresividad de los tumores A549 dentro de la cavidad abdominal.
Un ratón nude atímicos fue sacrificado 26 días después de la inoculación IP con células A549. Los tumores se inmunotiñeron con (A) anti-MSLN y (B) anticuerpos monoclonales anti-CA125. Estos tumores fueron negativos para MSLN pero positivo para la expresión CA125 como se muestra mediante tinción de color marrón de las células tumorales.
La hipótesis de que si la pérdida de
Msln
fueron responsables de la progresión del tumor se desaceleró en
Msln CD - /- ratones, a continuación, el reemplazo exógeno de sus productos proteicos, MPF o mMSLN, podrían restaurar el curso más agresivo de la enfermedad se observa en los
Msln
ratones (+ /+). Por lo tanto, se sintetizó recombinante MPF-rFc, mMSLN-rFc, y una proteína de CD22-rFc control. La adición estratégica de la fracción Fc de conejo aumenta significativamente la vida media de estas moléculas, pero no se espera que interfiera con la función. Las células A549 se inyectaron en las cavidades peritoneales de
Msln
- /- ratones, como antes, a continuación, comenzando en el día de la implantación, los ratones fueron tratados con una de las proteínas Fc recombinantes cada dos días para un total de seis dosis. Como se resume en la Tabla 1 y se muestra en la Figura 4D, la supervivencia media de
Msln
- /- ratones tratados con el péptido de control CD22-rFc permanecieron 46 días. Sin embargo, la supervivencia media de los ratones tratados con MPF-rFc disminuyó a 31 días, similar a la supervivencia de
Msln
(+ /+) ratones inyectados con células A549 (Fig. 4A). La inyección de mMSLN-rFc también produjo una disminución estadísticamente significativa en la supervivencia media, aunque el efecto fue menos marcada (42 días, p & lt; 0,016). Los resultados de este experimento sugieren que la pérdida de Mpf en lugar de mMsln es el principal responsable de la supervivencia prolongada de los
Msln CD - /-. Ratones portadores de células A549 xenoinjertados
Para determinar si actúa directamente sobre MPF las células A549 para mejorar su crecimiento o agresividad, que transfectadas establemente el
MPF
ADNc en células A549. MPF expresión se evaluó mediante el ensayo ELISA modificada del medio y la cantidad producida condicionada por 1 × 10
6 células se calculó sobre la base de una curva estándar de MPF recombinante. Mientras A549 /clones MPF producen aproximadamente 400 ng de MPF en 48 horas, no MPF se detectó en el medio condición de las células A549 transfectadas con control de vector (A549 /pcDNA). No se observó diferencia obvia en la tasa de crecimiento o la morfología de la
MPF
células A549 transfectadas en comparación con el control de vectores transfectadas (datos no presentados). También se evaluó el crecimiento independiente de anclaje de estas células en agar blando. Como se muestra en la Tabla 2, no hay diferencia estadística en la formación de colonias entre los
células A549 transfectadas
MPF y la línea de control de vectores transfectadas. Estos experimentos sugieren que el MPF no promueve directamente el crecimiento de las células A549.
Discusión
En nuestro estudio, hemos creado un modelo de ratón que carece de la
Msln
gen y es permisiva para el crecimiento de células de cáncer humano. La línea celular de cáncer de pulmón A549 utilizado para formar tumores IP en nuestros experimentos hace sólo cantidades mínimas de mMSLN, de tal manera que todos los MPF y mMSLN deben ser suministrados de forma exógena. Se observó una diferencia estadísticamente significativa 15 días en la supervivencia entre
Msln + /+
y
Msln
- /- ratones portadores de tumores A549 intraperitoneales. Este hallazgo fue la línea celular específica y, curiosamente, no se ha observado en un modelo subcutáneo. Estos resultados indican que un producto de la
Msln
gen juega un papel importante en la promoción de
en
in vivo
el crecimiento tumoral y la progresión de algunos tipos de células cancerosas que crecen dentro de la peritoneal cavidad.
MPF y mMSLN son los dos productos proteicos realizados por la expresión del gen
MSLN
. Ambas proteínas son altamente expresado por un número de malignidades de tumor sólido incluyendo mesotelioma, de páncreas y de ovario [1], [4]. Varios estudios han investigado cómo los cambios en la expresión del gen
MSLN
pueden alterar el crecimiento del tumor, progresión o invasividad para producir un fenotipo tumoral más agresivo. La sobreexpresión del gen
MSLN
fue mostrado para mejorar la interleucina (IL) -6 señalización [11], y para conferir resistencia al factor de necrosis tumoral (TNF) -a apoptosis mediada en líneas celulares de cáncer de páncreas [20]. La expresión ectópica de la
MSLN
génica en una línea celular de cáncer de mama humano promueve la supervivencia celular y el crecimiento independiente de anclaje
en
in vitro
[10]. Otros estudios han demostrado un papel vital para el
MSLN
gen en la regulación del crecimiento y la apoptosis a través de ambas vías dependientes de p53 e independientes en las células de cáncer de páncreas [12]. En todos ellos
In
in vitro
estudios, los efectos pro-tumorigénicos de
MSLN
manipulación genética se presume que está mediada por cambios en la expresión de mMSLN, aunque la genética manipulaciones en los experimentos deben producir alteraciones similares de niveles MPF
para separar las contribuciones hechas por el MPF o mMSLN al fenotipo que observamos en nuestro estudio, hemos suministrado proteína recombinante exógena al
Msln
. - /- ratones. Se encontró que la suplementación MPF disminución de la supervivencia de los animales 15 días en comparación con los ratones tratados con una proteína de control. Mientras que la suplementación con mMSLN hizo disminuir la supervivencia estadísticamente significativa 4 días, es evidente que MPF es el factor más potente en nuestro modelo.
MPF se identificó originalmente como un factor de crecimiento que podría promover la formación de colonias de megacariocitos cuando se administra en combinación con IL-3 [5]. Hasta la fecha, no receptor MPF se ha identificado en los megacariocitos o cualquier otras células. Tampoco han teorías han propuesto para explicar por qué una proteína expresada normalmente exclusivamente por células mesoteliales debe tener una función primaria como un factor estimulante de megacariocitos. Curiosamente, en nuestros experimentos, mientras que aumenta la agresividad del tumor MPF
en
in vivo
, la sobreexpresión forzada de MPF produjo ninguna ventaja de crecimiento
en
in vitro. Este
sugiere que el efecto de MPF en la agresividad del tumor no está mediada por una acción directa de MPF en el tumor, pero tal vez trabajando indirectamente en otras células. Aunque podría ser tentador considerar que MPF puede tener una función efectora inmune, nuestros experimentos se llevaron a cabo en ratones deficientes en linfocitos, lo que sugiere que otro mecanismo es más probable que sea responsable. Identificación del tipo (s) celular responsable de mediar este efecto de MPF está fuera del alcance del presente estudio
.
Aunque nuestras observaciones se hicieron usando un solo tipo de células, el efecto se observó en la supervivencia fue profundo y altamente reproducible. Nuestros datos sugieren que MPF podría ser un importante mediador de la agresividad del tumor en la cavidad peritoneal, y que la inhibición o el secuestro de MPF pueden ser clínicamente útil en el retraso del crecimiento de algunos tipos de cáncer que crecen en la cavidad peritoneal. Se han iniciado estudios para probar esta hipótesis.