Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer y biomarcadores pronósticos fiables basados en la sangre se necesitan con urgencia. La enumeración y caracterización molecular de las células tumorales circulantes (CTC) ha ganado cada vez más interés en la práctica clínica. detección de CTC por CellSearch
® ya se ha correlacionado con un resultado desfavorable en el CCR metastásico. Sin embargo, la tasa de detección de CTC en la enfermedad de cáncer colorrectal metastásico es bajo en comparación con otras entidades tumorales. Por lo tanto, el uso de ensayos alternativos (o complementarios) podría ayudar a detallar el uso de pronóstico de los CTC como biomarcadores basados en la sangre. En este estudio, las muestras de sangre de 47 pacientes con CCRm fueron seleccionados para la CTC utilizando el CellSearch aprobado por la FDA
® tecnología y /o la AdnaTest
®. 38 muestras podían ser procesados en paralelo. Se demuestra que un análisis combinado de CellSearch
® y el AdnaTest
® conduce a una mejor detección de CTC en nuestra cohorte de pacientes cáncer colorrectal metastásico (tasa de positividad CellSearch
® 33%, AdnaTest
® 30%, combinado 50%). Mientras CTC detectados con el sistema CellSearch
® se asociaron significativamente con la supervivencia libre de progresión (p = 0,046), una correlación significativa con respecto a la supervivencia global podría ser visto solamente cuando se combinaron los dos ensayos (p = 0,013). Estos hallazgos podrían ayudar a establecer herramientas mejoradas para detectar CTC como en el tratamiento de biomarcadores para la rutina clínica en estudios futuros
Visto:. Gargantas TM, Stein A, J Quidde, Hauch S, Rock K, Riethdorf S, et Alabama. (2016) Mejora de la detección de células tumorales circulantes en cáncer colorrectal metastásico por la combinación de la CellSearch
® y el AdnaTest
®. PLoS ONE 11 (5): e0155126. doi: 10.1371 /journal.pone.0155126
Editor: Min-Hsien Wu, Universidad Chang Gung, TAIWAN
Recibido: 3 Noviembre 2015; Aceptado: 25 Abril de 2016; Publicado: 16-may
el año 2016
Derechos de Autor © 2016 Gargantas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación: TMG, SR, y KP fueron apoyados por la ciudad de Hamburgo, Hamburgo Landesexzellenzinitiative (LEXI 2012; tumor de orientación a través de moléculas de superficie celular esenciales en la progresión del cáncer y difusión).. Estos autores también fueron apoyados por el CEI para investigadores avanzados de Grant diseccionar, TRANSCAN efectividad de la red: Grant CTC-SCAN. TMG y PK también recibieron el apoyo de la empresa común iniciativa sobre medicamentos innovadores en virtud de acuerdo de subvención n ° 115749, los recursos de los cuales se compone de contribución financiera del Programa ARCO Séptima de la Unión Europea (FP7 /2007-2013) y las empresas EFPIA 'contribución en especie. Los donantes prestado apoyo en forma de salarios para el autor TMG, pero no tienen ninguna función adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección "Contribuciones de autor '. SH es un empleado de tiempo completo de la AdnaGen GmbH, Langenhagen, Alemania. El AdnaGen GmbH prestado apoyo en forma de salario por autor SH, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. La función específica de este autor se articula en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses: SH es la Gerente de Investigación & amp Sitio;. Desarrollo de la AdnaGen GmbH (Qiagen). Todos los demás autores han declarado que no existen intereses en competencia. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
relacionadas con el cáncer de la muerte es causada generalmente por la derivación de células cancerosas agresivas en nuevas posiciones en el el cuerpo (la formación de metástasis) que se han difundido a partir de los tumores primarios. El cáncer colorrectal (CCR) es una de las enfermedades más comúnmente diagnosticados y una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer [1]. Aproximadamente una cuarta parte de los pacientes con metástasis CRC exposición (CCRm) en el momento del diagnóstico (enfermedad sincrónica) y más pacientes desarrollarán metástasis durante el curso de su enfermedad, lo que resulta en la relativamente alta tasa de mortalidad asociada con el CRC [2].
los diferentes marcadores de pronóstico Actualmente se pueden utilizar en cáncer colorrectal metastásico, por ejemplo, los análisis de las células blancas de la sangre, la cantidad de lactato deshidrogenasa, estado funcional, la localización del tumor primario y la metástasis, marcadores moleculares (por ejemplo, las mutaciones en el gen BRAF), o avanzada agrupación de integración) [3-7]. Además, la dinámica de crecimiento del tumor han sido mostrados para ofrecer información sobre el tratamiento sobre el futuro pronóstico [8, 9].
enumeración y caracterización molecular de las células tumorales capturados de un análisis de sangre mínimamente invasiva (células tumorales circulantes, CTC) se utiliza cada vez más en la práctica clínica para el seguimiento de la enfermedad y el descubrimiento de la importancia pronóstica [10]. CTC son fáciles de obtener por muestreo de sangre periférica menos invasiva que permite una continua de la progresión del tumor "monitoreo en tiempo real". Hasta ahora, el CellSearch
® sistema es el único enfoque que ha sido aprobado por la FDA estadounidense EE.UU. (Food and Drug Administration) para la detección de CTC en metastásico de mama, de colon y de próstata [11-13]. La detección de CTC utilizando CellSearch
® recientemente ha sido correlacionada con un resultado desfavorable en el cáncer colorrectal metastásico [14]. Sin embargo, los estudios realizados en pacientes con CCRm usando CellSearch
® demostrado un rendimiento mucho más bajo de los CTC en este tipo de tumor en comparación con el de mama o cáncer de próstata [11-13]. Se espera que "sólo" 30-40% de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico puerto 3 o más CTC por 7,5 ml de sangre [15]. Por lo tanto, el uso de otros (o complementarios) ensayos podría mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de la biología del cáncer y detallar el uso de CTC como biomarcadores de cáncer en cáncer colorrectal metastásico. Por ejemplo, la discordancia significativa entre CellSearch
® y el AdnaTest
® en la detección de CTC de pacientes con CCRm ya se ha observado [16]. El sistema CellSearch
® utiliza inmunotinción y define CTC como células que expresan tanto EpCAM y pankeratins y que no expresan CD45, así como tener un núcleo teñidas con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Por el contrario, la AdnaTest
® utiliza una plataforma de RT-PCR dirigidos a tres diferentes transcripciones (
EpCAM
,
EGFR
,
CEA
) para identificar las células tumorales dentro de por lo tanto, la fracción de células EpCAM enriquecida.
Un análisis combinado de ambos ensayos podría mejorar la sensibilidad de detección CTC mediante la aplicación de dos enfoques metodológicos (inmunocitoquímica y RT-PCR) y el aumento de la gama de marcadores de CTC. Esto es una ventaja importante en vista de la heterogeneidad fenotípica bien conocido de CTC [10]. El propósito de este estudio fue analizar la relevancia clínica de las CTC mediante la comparación y la combinación de dos ensayos diferentes para la detección de CTC en una pequeña cohorte de pacientes con CCRm (n = 47). Para este fin, el AdnaTest
® y el CellSearch
® se emplearon sistema en paralelo. Nuestros datos muestran que un análisis combinado de ambos ensayos conduce a un aumento de las tasas de detección de CTC con información pronóstica adicional. Estos hallazgos podrían ayudar a establecer nuevas herramientas de diagnóstico con el uso de CTC como en el tratamiento de biomarcadores para la rutina clínica en estudios futuros.
Material y Métodos
serie de pacientes
Pacientes consecutivos prevista para la quimioterapia paliativa para el CDN de la clínica de pacientes externos del Departamento de Oncología y Hematología del Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf fueron reclutados. Características de los pacientes se resumen en la Tabla 1. La mayoría de los pacientes ya estaban ampliamente tratada previamente, recibiendo el tratamiento línea 3
er (mediana) (rango: 1-8). En general, más de 80% de los pacientes recibió fluoropirimidinas, oxaliplatino, irinotecan y bevacizumab y aproximadamente el 40% de los pacientes anticuerpos EGFR. Los datos demográficos y patrones de metástasis fueron como se esperaba, aunque la población en general era un poco más joven que la población CRC metastásico mediana, probablemente relacionada con el fondo hospital universitario. El estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki y las directrices para la experimentación con seres humanos por las Cámaras de Médicos del Estado de Hamburgo ( "Hamburger Ärztekammer"). El protocolo experimental fue aprobado (Aprobación Nº PVN-3779) por el Comité de Ética de las Cámaras de Médicos del Estado de Hamburgo ( "Hamburger Ärztekammer"). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes del inicio del estudio. En total, las muestras de sangre (5 ml y 7,5 ml) de 47 pacientes se recogieron en AdnaCollect
® tubos de extracción de sangre (AdnaGen
®) o CellSave
® tubos de preservación (Janssen Diagnostics), y procesados dentro de las 24 h (AdnaTest
®) o 96 h (CellSearch
®) de acuerdo con las directrices de los proveedores.
AdnaTest
®
para el enriquecimiento y análisis de las células tumorales circulantes (CTC) el AdnaTest ColonCancerSelect y la AdnaTest ColonCancerDetect, (AdnaGen GmbH, Langenhagen) se utilizaron para preparar ARNm, seguido de una RT-PCR para un múltiplex más tarde PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante [16]. Toda la información necesaria en relación con el procesamiento de muestras se puede encontrar en la página web http://www.adnagen.com. Brevemente, se toman 5 ml de sangre para un enriquecimiento de CTC mediante el uso de partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos que constan de una mezcla de anticuerpos contra diferentes EpCAM epítopos Las células enriquecidas fueron posteriormente lisadas y ARNm se purificó por medio de perlas de oligo-dT que figuran en el kit seguido por transcripción inversa (Sensiscript, Qiagen, Hilden). El ADNc resultante se procesó en una PCR multiplex para transcritos asociados a tumores (
receptor del factor de crecimiento epidérmico gratis (
EGFR
),
antígeno carcinoembrionario gratis (
CEA
) y
EpCAM
), así como
La actina como control
limpieza. PCR se realizó utilizando el Master Mix HotStarTaq (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). La visualización de los fragmentos de PCR se llevó a cabo con un 2100 Bioanalyzer utilizando el ensayo de DNA1000 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). CTC fueron identificados positivamente si se ha detectado al menos uno de los marcadores de PCR múltiple.
CellSearch
®
Para el aislamiento de las CTC utilizando CellSearch
®, se llevó a cabo la detección de CTC como se describe en otros lugares [17]. Los criterios para un evento para ser definidos como CTC fueron: una ronda a la morfología oval, un núcleo visible (DAPI-positivo), y un patrón de tinción positiva para una celda específica epitelial (queratina-positivas y CD45-negativo). Para la determinación del EGFR en la CTC, la CellSearch
® tumor Fenotipificación Reactivo EGFR se aplicó en el cuarto canal del sistema [18].
El análisis estadístico
Con el fin de comparar los resultados de el
® CellSearch y los AdnaTest
® experimentos, CTC cuenta desde CellSearch
® datos fueron transformados a positivo (≥3 CTC) o negativo (& lt; 3 CTC) desde ≥3 CTC /7,5 ml de la sangre se han relacionado con un peor resultado clínico [13]. estado de CTC (positivo /negativo) y la correlación con la ubicación de la metástasis se probó con la prueba exacta de Fisher 2x2 [19] y corregido en función de múltiples ensayos. la prueba de McNemar con corrección de Yate para la continuidad se realizó para encontrar el acuerdo entre los dos métodos. Libre de progresión y la supervivencia global (SLP y la SG) calcula para ambos métodos fueron calculados por las curvas de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank [20].
Resultados
análisis de la muestra clínica utilizando la AdnaTest
® y CellSearch
®
Uso de la AdnaTest
®, 13 de 43 (30%) pacientes analizados fueron positivos para CTC. CTC fueron identificados positivamente si se ha detectado al menos uno de los marcadores de PCR múltiple. CTC de 8 pacientes mostraron señales positivas para
EpCAM
. Cuatro de los pacientes, además, mostraron señales de
CEA
, mientras que un paciente fue positivo para
EpCAM
,
CEA
, y
EGFR
. Cinco pacientes mostraron exclusivamente señales para
CEA
sin señales de expresión para cualquier otro marcador (Figura 1A). Para CellSearch
® análisis, sólo los pacientes con ≥ 3 CTC fueron clasificados como "CTC-positivo" ya que este corte se correlaciona con un resultado desfavorable en el cáncer colorrectal metastásico [13, 21]. Catorce de los 42 (33%) analizaron muestras fueron positivas para CTC (rango: 3-44 células). Se encontraron células EGFR-positivo (moderada a fuerte expresión) en seis de los 14 pacientes (intervalo de 1-4 células EGFR-positivo dentro de la cohorte CTC-positivo) (Fig 1B). En este estudio, 38 muestras de sangre clínicas podrían analizarse en paralelo. La combinación de la AdnaTest
® y CellSearch
® 19 de 38 (50%) analizó muestras se volvieron positivos para CTC (figura 1C). Dentro de este grupo,
señales de EGFR
/EGFR no se correlacionó ya que sólo un paciente fue
EGFR
-positivo con el AdnaTest
®, pero tuvo CTC EGFR-negativos con CellSearch
® (paciente 42). Un resumen detallado de la CTC análisis aparece en la Tabla 2. Quince muestras fueron CTC-negativos en ambos ensayos CTC y 5 pacientes fueron CTC-positivos en ambos ensayos. Siete muestras fueron positivas en CellSearch
® y negativo para el AdnaTest
®, mientras que siete casos eran exclusivamente positivo para AdnaTest
®. Los resultados de ambos ensayos no se correlacionaron significativamente (kappa de Cohen = 0,1066, p = 0,51) (Figura 1D). Analiza
(A) Resumido marcador de CTC detectados con el AdnaTest
®. CTC fueron identificados positivamente si al menos uno de los marcadores de PCR múltiple (
EpCAM
,
CEA
, o
EGFR
) se detectó. (B) CTC enumeración por CellSearch
® incluyendo la determinación del EGFR. (C) CTC tasa de positividad de la AdnaTest
®, CellSearch
®, o ambos ensayo en combinación. (D) Comparación entre el AdnaTest
® y el CellSearch
®.
Correlación de los resultados de CTC a lugar de la metástasis y la terapia
Uso de la AdnaTest
®, no se encontró correlación con respecto CTC-positividad y la localización de las metástasis (p & gt; 0,05). Se observaron resultados similares cuando se utiliza CellSearch
® (p & gt; 0,05). La combinación de ambos ensayos también no dio como resultado una correlación significativa entre la ubicación y el estado de la metástasis CTC (p & gt; 0,05). estado CTC no se correlacionó con la que tiene una o múltiples metástasis (p & gt; 0,05) en cualquiera de los métodos de detección de CTC. Curiosamente, la tasa de positividad CTC se asoció con una línea más alta de la terapia, la mediana de 2
ª línea en caso de CTC negatividad en comparación con la mediana 4
ª línea en caso de positividad CTC.
Correlación de CTC conclusiones al resultado clínico
las curvas de Kaplan-Meyer y estadística de log-rank para casos CTC-negativo y CTC-positivos revelaron ninguna correlación significativa con respecto a la supervivencia libre de progresión (SLP) cuando se utiliza el AdnaTest
® (p = 0,43) (Fig 2A). Para CellSearch
® se observó una asociación significativa entre la SSP y el estado de CTC (p = 0,0467) (Figura 2B). Una combinación de los dos ensayos de nuevo no mostró una correlación significativa de la SLP pero puso de manifiesto una tendencia (p = 0,084) (Figura 2C).
También probamos si la presencia de CTC por el AdnaTest
®, CellSearch
® o los resultados combinados se asocian con la supervivencia global reducida (OS) en nuestra cohorte de pacientes cáncer colorrectal metastásico. Utilizando el análisis de Kaplan-Meier una correlación significativa podría ser visto solamente cuando ambos ensayos se combinaron (p = 0,013), mientras que los ensayos individuales por sí solo no proporcionaron información pronóstica significativa (AdnaTest
®: p = 0,31, CellSearch
®: p = 0,080) (figura 3A-3C).
es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer y los biomarcadores basados en sangre confiables se necesitan con urgencia
Discusión
el cáncer colorrectal a mejorar la selección del tratamiento inicial y modificaciones durante el tratamiento. Hasta la fecha, el marcador a base de sangre más ampliamente usado en el CCR es CEA para obtener información sobre el pronóstico al inicio del estudio y la información predictiva durante el tratamiento [22-24]. A pesar del uso generalizado de CEA como biomarcador en sangre no es ni enfermedad específica, influenciada por otros factores, y no tan fiable como otros biomarcadores más recientes de la sangre (por ejemplo, basados CTC) [25].
OS es el más fiable de punto final en los estudios clínicos y la detección de CTC ya se ha demostrado que tiene un impacto pronóstico en muchas entidades tumorales, incluyendo cáncer colorrectal metastásico [11, 12, 21, 26-28]. En nuestra cohorte, pudimos observar mayores tasas de detección de CTC y mejor información sobre el pronóstico relativo a la SG cuando se peina dos sistemas diferentes de detección de la CTC CellSearch aprobado por la FDA
® tecnología y la AdnaTest
®. El pronóstico de la SSP se correlacionó significativamente con la detección de CTC al utilizar CellSearch
® sola (p-valor de 0,046 vs 0,43 cuando se utiliza el AdnaTest
® y 0,084 para los análisis combinados de los dos ensayos). Sin embargo, la SSP, por definición, se refiere a la fecha en que se detecta la progresión y además depende de la evaluación radiológica por un médico, por lo que la SSP un criterio de valoración más fiable.
discordancias significativas entre CellSearch
® y el AdnaTest
® en la detección de CTC ya se han publicado [16, 29, 30]. Sin embargo, ninguno de estos estudios se correlacionó la incidencia de las CTC con el resultado clínico. En el presente estudio, una combinación de la CellSearch
® y el AdnaTest
® aumenta la tasa de detección del 30% al 50% (30% cuando se usa el AdnaTest
®; 33% cuando se utiliza CellSearch
® (≥3 CTC), el 50% si se combinan los dos ensayos). tasa de positividad CTC parece estar asociada con la línea avanzada de tratamiento (Tabla 2), que argumenta a favor de la hipótesis de que un mayor número de CTC permiten a los pacientes adquirir resistencia a las terapias sistémicas. En vista de la gran heterogeneidad de los CTC en el CCR [31], la presencia de más CTC debe aumentar la posibilidad de albergar clones resistentes.
A pesar de que hemos podido demostrar claramente que ambos métodos en combinación mejorar la tasa de positividad de los CTC , el 50% de los pacientes estaban siendo negativo a pesar de la presencia de metástasis evidentes. Además de las limitaciones técnicas de los ensayos (véase el párrafo siguiente) puede haber una biología interesante detrás de la observación de que los niveles de CTC en el CCR son más bajos que en el cáncer de mama. Uno podría argumentar que la diseminación de las células tumorales en el CCR es menos pronunciada, lo que explicaría también por qué los pacientes con metástasis hepáticas CRC se pueden curar mediante cirugía en aproximadamente el 20%, mientras que tal cura rara vez se logra mediante el mismo tratamiento en el cáncer de mama.
Ambos ensayos utilizados en nuestros estudios se basan en la expresión de marcadores de superficie de células epiteliales y son, por lo tanto, probable que se pierda poblaciones de CTC que han sufrido una transición completa epitelio-mesenquimal (EMT) [32-34]. Sin embargo, trabajos recientes se ha demostrado que las células cancerosas con un fenotipo intermedio son probablemente las más agresivas capaces de difundir y superan en sitios distantes debido a su alta plasticidad [35, 36]. El sistema ® CellSearch
y el AdnaTest
® son ambos capaces de detectar las CTC asociados-EMT [37, 38]. Por lo tanto, los ensayos de CTC utilizados en la presente epitelial objetivo investigación y CTC intermedios, mientras que CTC mesenquimales puros (que carece de cualquier expresión de marcadores epiteliales) son probablemente pierden. La detección de CTC mesenquimales puros es de todos modos muy difícil, porque incluso si la etiqueta libre (es decir, EpCAM independiente) se utilizan sistemas de captura (por ejemplo, filtros) marcadores epiteliales, tales como las queratinas se aplican generalmente para la detección de CTC, debido a la falta de marcadores mesenquimales que no se expresan en las células de la sangre de los alrededores. En este contexto, Plastin-3, una proteína actina agrupación no downregulated durante EMT en CRC y de cáncer de mama células y no se expresa en leucocitos-podría ser un avance importante [33, 34].
-Cell libre de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN tumoral de células libres o miRNAs) también se discuten actualmente para ser adecuado como nuevos biomarcadores basados en la sangre [39]. Los cambios en su concentración, así como alteraciones del ADN ya se mostró a ser utilizado para un seguimiento de diagnóstico tratamiento, predictivo o fines pronósticos [40-43]. Sin embargo, la mayoría de ctDNA se deriva de las células tumorales apoptóticas, mientras que el análisis CTC tiene la ventaja para estudiar las células tumorales viables, que también pueden mejorar nuestra comprensión actual de la difusión de células tumorales en pacientes con cáncer. Por otra parte, hasta el momento ningún ensayo /protocolo estandarizado para la detección de ácidos nucleicos o miRNAs libres de células podría establecerse en la enfermedad de cáncer colorrectal metastásico y diferentes enfoques para el descubrimiento de esos biomarcadores se utilizan en los laboratorios de todo el mundo. Recientemente, una estrategia de flujo de trabajo estandarizado se sugirió para la normalización de los datos de expresión de genes miARN como un nuevo punto de partida para los procedimientos estandarizados para permitir la comparación de datos entre diferentes laboratorios [44]. El desarrollo de Assys estandarizados que se pueden utilizar para la diagnosis de compañía es el foco del consorcio de la UE-IMI reciente creación llamado cáncer-ID (www.Cancer-id.eu).
Un montón de debate está en curso si los CTC se puede utilizar como biopsias líquidos guiar las decisiones de tratamiento individualizado [10]. Utilizando el AdnaTest
® y CellSearch
® hemos sido capaces de detectar objetivos terapéuticos relevantes, tales como
EGFR
/EGFR. Las señales para
EGFR
/EGFR en los CTC no se correlacionó en nuestro estudio entre el AdnaTest
® y CellSearch
® (Tabla 2), lo cual se debe probablemente a las diferentes poblaciones de CTC capturadas con nuestros ensayos . Esto demuestra una vez más la complementariedad de ambos ensayos.
En resumen, hemos podido demostrar que una combinación de diferentes ensayos de CTC aumenta la aparición de CTC en un grupo seleccionado de pacientes con CCRm. Existe una correlación significativa a OS podría ser visto solamente cuando se combinaron los dos ensayos (p = 0,013). Estos hallazgos podrían ayudar a establecer los CTC como en el tratamiento de biomarcadores para la rutina clínica en estudios futuros.